Detection of bovine foetal DNA from amniotic fluid using the polymerase chain reaction

Abstract

Sikiövedestä tehtävä diagnostiikka on tullut nopeammaksi ja tehokkaammaksi viime vuosikymmenellä keksityn polymeraasiketjureaktion (PCR) myötä. DNA:n voi nyt analysoida suoraan aspiroidusta sikiövesinäytteestä ilman soluviljelyä. Ihmislääketieteessä PCR:ään perustuva sikiövesidiagnostiikka on ollut käytössä jo useiden vuosien ajan. Valmius myös naudan perinnöllisten sairauksien ja taudinaiheuttajien toteamiseksi on jo olemassa, mutta menetelmiä ei ole vielä otettu yleisesti tähän käyttöön. Tässä kokeessa haluttiin selvittää, kuinka pienestä sikiövesinäytteestä sukupuolenmääritys voidaan luotettavasti tehdä, ja miten näyte on puhdistettava analyysiä varten. Tutkimusta varten teurastamolta haettiin 10 kohtua 70-120 päivän ikäisine sikiöineen. Laboratoriossa kerättiin näytteet sikiövedestä, sikiöstä ja kohdusta. Sikiövedestä määritettiin sukupuoli ja kappakaseiini -tyyppi, jotta näytteen voitiin osoittaa sisältävän sikiön soluja. Jos emän ja sikiön välillä ei ollut kummassakaan em. analyysissä eroa, tehtiin vielä mikrosatelliitteihin eli DNA:n toistojaksoihin perustuva analyysi. Mikrosatelliitteja esiintyy läpi koko genomin ja kunkin mikrosatelliittilokuksen muuntelu eri yksilöiden välillä on suurta, joten niiden joukosta on mahdollista valita sellaiset, joiden "sormenjäljet" ovat yksilölliset. Kaikista sikiövesinäytteistä saatiin sama signaali kuin itse sikiöstä ja nämä molemmat poikkesivat emän signaalista. Kahdesta puhdistetusta sikiövesinäytteestä katosi soluaines puhdistuksen aikana, joten on yksinkertaisempaa ja turvallisempaa jättää näyte puhdistamatta, koska analyysin onnistuminen ei siitä vaarannu. Tutkimuksen perusteella voidaan todeta, että kehittyvän sikiön sukupuoli ja tarvittaessa muitakin DNA-tasolla näkyviä ominaisuuksia voidaan luotettavasti määrittää suoraan 0,5-1,5 ml:stä sikiövettä ilman edeltävää soluviljelyä tai DNA:n puhdistusta.

The aims of this study were to evaluate the amount of amniotic fluid required for diagnosis of sex, milk protein and microsatellite variants by polymerase chain reaction (PCR) and to review methods for isolating DNA from the amniotic cells. Uterine and foetal tissues were used as controls, and milk protein and microsatellite variants to check contamination of maternal cells in the PCR. The results showed that the samples do not need to be purified after DNA release from the amniotic cells and that as little as 0.5-1.5 ml of amniotic fluid is sufficient for reliable diagnosis by PCR.