Improved extraction of prolamins for gluten detection in processed foods

Abstract

Keliakia-analytiikan yksi tärkeimmistä osista on näytteiden sisältämien vehnän, ohran ja rukiin prolamiinien tehokas uutto ennen niiden pitoisuuden analysointia. Prolamiinien uuttuvuuteen vaikuttaa voimakkaasti elintarvikkeen prosessointi. Lisäksi eri viljalajien sisältämien prolamiinien liukoisuuksien välillä on eroja. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää olosuhteet, joissa prolamiinit voidaan tehokkaasti uuttaa viljalajista tai elintarvikkeen valmistusprosessista riippumatta. Vehnän, ohran ja rukiin prolamiinit uutettiin eri vahvuisilla etanoli-, 1-propanoli- ja 2-propanoliliuoksilla. Lisäksi tutkittiin lämpötilan ja pelkistimen käytön vaikutusta uuton tehokkuuteen. Uutteiden proteiinipitoisuudet määritettiin typen määritysmenetelmällä ja niiden prolamiinikoostumuksia tarkasteltiin natriumdodekyylisulfaatti-geelielektroforeesin ja vasta-ainevärjäyksen avulla. Vasta-ainevärjäyksessä käytettiin prolamiinispesifisiä R5 ja omega-gliadiinin vasta-aineita, joiden kykyä tunnistaa eri prolamiinien alaryhmiä vertailtiin. Huomattiin, että R5 vasta-aine reagoi voimakkaimmin keskikokoisten prolamiiniryhmien kanssa, mukaan lukien polymeeriset prolamiinit, kun taas omega-gliadiinin vasta-aine reagoi voimakkaammin suurempi moolimassaisten prolamiinien kanssa. Tässä tutkimuksessa prolamiinit uuttuivat tehokkaimmin 50 °C:ssa käytettäessä 40 % 1-propanolia, jossa 1 % ditiotreitolia.

A problem in gluten analysis has been inconsistent extractability of prolamins, particularly from processed foods consisting of unknown portions of prolamins from wheat, barley, and rye. This study aimed at improving the extraction of prolamins for immunological analysis, regardless of the cereal species and the production process. The prolamins were extracted with varying concentrations of ethanol, 1-propanol, and 2-propanol. Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting were applied to study the protein composition of the extracts and the antibody recognition of the prolamin subgroups. We characterized the affinities of prolamin-specific antibodies that are used in gluten analysis against the prolamin groups that were soluble in 40% 1-propanol. The antibody R5 recognized more abundantly the medium-molecular weight groups, including polymeric proteins, and less the high-molecular weight groups than the anti-ù-gliadin antibody. In the present study, the prolamins were most efficiently extracted by 40% 1-propanol with 1% dithiothreitol at 50 °C . The prolamins were extracted from processed bread samples with efficiency similar to that from untreated meal samples.