Sex diagnosis of ovine and bovine embryos by enzymatic amplification and digestion of DNA from the ZFY/ZFX locus

Lähiaikoina on mahdollista saada haluttua sukupuolta olevia jälkeläisiä käytännön kotieläintuotannossa. Koska siittiöiden lajittelu X- ja Y -siittiöihin ennen keinosiemennystä ei vielä ole tuonut toivottavaa tulosta, on ainoa vaihtoehto tehdä määritys suoraan alkiosta ennen alkionsiirtoa. Alkiosta otetaan näytepala, jonka DNA:sta määritys voidaan tehdä. Sukupuolilajittelu tehdään usein DNA:n spesifisellä monistuksella (PCR) käyttämällä Y-kromosomispesifisten alukkeiden lisäksi autosomaalisia alukkelta, jotka vähentävät virhemääritysten todennäköisyyttä. Tällöin reaktio-olosuhteiden optimoiminen muodostuu hankalaksi. Lisäksi käytetyt alukkeet ovat yleensä lajispesifisiä, minkä johdosta optimointi onnistuu vain käyttämällä kyseisen lajin DNA:ta. Tässä tutkimuksessa nämä ongelmat ovat poistettu monistamalla evoluutiossa konservoitunutta ZFY-geeniä. ZFY-geeni on kaikkien istukallisten nisäkkäiden Y-kromosomissa, ja sillä on homologi X-kromosomissa. Eri lajien sisällä sukupuolten erottaminen perustuu ZFY-geenin sisällä olevien, lajispesifisten pistemutaatioiden tunnistamiseen restriktio-entsyymien avulla. Entsyymi-käsittelyn jälkeen saadaan kunkin lajin naaraille ja koiraille tunnusomaiset juovastot geelielektroforeesissa. Menetelmä optimoitiin hiiren DNA:lla, ja sen tarkkuus testattiin pilkkomalla lampaan alkioita 2-4 osaan sekä kenttäolosuhteissa että laboratoriossa. Kustakin osasta tehtiin määritys erikseen sokkotestinä. Samalla verrattiin erilaisia näytteen käsittelytapoja parhaan tehokkuuden löytämiseksi. Joissakin tapauksissa solunäytteen entsymaattinen hajotus korvattiin nopeammalla menetelmällä, jossa näyte kuumennettiin emäksisessä liuoksessa. Käytetyllä tekniikalla määritettiin sukupuoli erittäin suurella tarkkuudella lampaan näytepaloista, jopa yhdestä solusta, sekä naudan 1-8 soluisista alkioista.