Sex diagnosis of ovine and bovine embryos by enzymatic amplification and digestion of DNA from the ZFY/ZFX locus

Abstract

Lähiaikoina on mahdollista saada haluttua sukupuolta olevia jälkeläisiä käytännön kotieläintuotannossa. Koska siittiöiden lajittelu X- ja Y -siittiöihin ennen keinosiemennystä ei vielä ole tuonut toivottavaa tulosta, on ainoa vaihtoehto tehdä määritys suoraan alkiosta ennen alkionsiirtoa. Alkiosta otetaan näytepala, jonka DNA:sta määritys voidaan tehdä. Sukupuolilajittelu tehdään usein DNA:n spesifisellä monistuksella (PCR) käyttämällä Y-kromosomispesifisten alukkeiden lisäksi autosomaalisia alukkelta, jotka vähentävät virhemääritysten todennäköisyyttä. Tällöin reaktio-olosuhteiden optimoiminen muodostuu hankalaksi. Lisäksi käytetyt alukkeet ovat yleensä lajispesifisiä, minkä johdosta optimointi onnistuu vain käyttämällä kyseisen lajin DNA:ta. Tässä tutkimuksessa nämä ongelmat ovat poistettu monistamalla evoluutiossa konservoitunutta ZFY-geeniä. ZFY-geeni on kaikkien istukallisten nisäkkäiden Y-kromosomissa, ja sillä on homologi X-kromosomissa. Eri lajien sisällä sukupuolten erottaminen perustuu ZFY-geenin sisällä olevien, lajispesifisten pistemutaatioiden tunnistamiseen restriktio-entsyymien avulla. Entsyymi-käsittelyn jälkeen saadaan kunkin lajin naaraille ja koiraille tunnusomaiset juovastot geelielektroforeesissa. Menetelmä optimoitiin hiiren DNA:lla, ja sen tarkkuus testattiin pilkkomalla lampaan alkioita 2-4 osaan sekä kenttäolosuhteissa että laboratoriossa. Kustakin osasta tehtiin määritys erikseen sokkotestinä. Samalla verrattiin erilaisia näytteen käsittelytapoja parhaan tehokkuuden löytämiseksi. Joissakin tapauksissa solunäytteen entsymaattinen hajotus korvattiin nopeammalla menetelmällä, jossa näyte kuumennettiin emäksisessä liuoksessa. Käytetyllä tekniikalla määritettiin sukupuoli erittäin suurella tarkkuudella lampaan näytepaloista, jopa yhdestä solusta, sekä naudan 1-8 soluisista alkioista.

A PCR-based sex determination assay for sheep and cattle embryos was developed using mouse embryos for optimizing the protocol. Samples were lysed either enzymatically or by alkaline treatment followed by enzymatic amplification of DNA from the ZFY/ZFX locus. Sex diagnosis could be done after the digestion of the amplified product by restriction endonucleases. Ovine and bovine embryos could be sexed from biopsies as small as 1-4 cells. Some embryos were split into 2-4 sections, which were amplified separately. Blind trials with such samples demonstrated that the method was highly accurate, even when embryo biopsy was done under farm conditions. The protocol involves an in-built control. This eliminates the need for autosomal control primers, which often inhibit the amplification of the Y-chromosome-specific DNA, especially when a small amount of template is used.