Kasvitauteja aiheuttavien gram-positiivisten bakteerien molekyylitason tautimekanismien selvitys: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -lajin virulenssitekijät

Abstract

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) on gram-positiivinen bakteeri, joka on läheistä sukua mykobakteereille ja streptomykeeteille. Se on kasvipatogeeni, joka aiheuttaa perunan vaalean rengasmädän. Tämä kasvitauti aiheuttaa huomattavia taloudellisia menetyksiä eri puolilla Eurooppaa huolimatta jatkuvista ponnisteluista taudin hävittämiseksi. Tutkimusprojektimme päämääränä on selvittää molekyylitasolla Cms-bakteerin virulenssitekijät. Cms-bakteeri tuottaa erittyvää sellulaasi-entsyymiä, jota kutsumme CelA:ksi. Tutkimusryhmämme on kloonannut ja sekvensoinut geenin, joka koodaa sellulaasi CelA:ta. Mutantit bakteerikannat, jotka eivät tuota sellulaasia, ovat vain hyvin heikosti virulentteja. Virulenssi voidaan kuitenkin osittain palauttaa siirtämällä mutantteihin bakteereihin kyseinen sellulaasigeeni. Tällä voidaan osoittaa sellulaasin olevan Cms:lle tärkeä virulenssitekijä. Kyseisen entsyymin rakenne poikkeaa merkittävästi aikaisemmin kuvatuista sellulaaseista aminohapposekvenssin perusteella. Sellulaasit ovat yleensä monidomeenisia proteiineja, joiden katalyyttinen domeeni ja selluloosaan sitoutuva domeeni ovat toisistaan erillään. Olemme huomanneet, että Cms:n sellulaasilla (CelA:lla) on näiden kahden domeenin lisäksi kolmas domeeni (dom3), jonka kaltaista ei ole aikaisemmin kuvattu sellulaasien yhteydessä. Tämän domeenin peptidisekvenssissä on yhteneväisyyttä ekspansiineiksi kutsuttujen kasviproteiinien kanssa. Ekspansiinit ovat kasvien solunseinän proteiineja, jotka tunkeutuvat selluloosakuitujen mikrofibrillien väliin saaden nämä liukumaan toistensa lomitse, kun solunseinä kasvaa. Tämän perusteella on mahdollista, että myös CelA:n dom3 osallistuu solunseinän selluloosakuitujen fibrillien avaamiseen. Sellulaasi-tutkimusten lisäksi olemme osoittaneet, että patogeeniset Cms-kannat tuottavat proteiinia tai proteiineja, joka/jotka aiheuttavat saastutuksen jälkeen tupakalla hypersensitiivisen reaktion (HR). Yksi tällainen proteiini on jo puhdistettu ja olemme parhaillaan eristämässä sitä koodaavaa geeniä. Useilla gram-negatiivisilla kasvipatogeeneillä on HR-indusoreja (harpiineja), joita koodataan hrp-geeniryhmissä (hypersensitive response and pathogenicity -lokus). hrp-geenien tuotteet muodostavat nk. III-tyypin erityskoneiston, joka esiintyy sekä eläin- että kasvipatogeeneissä ja erittää virulenssitekijät suoraan isäntäsolun sisälle. Koska tuloksemme osoittavat, että Cms sekä tuottaa että erittää HR:ta indusoivaa proteiinia, on mahdollista, että myös se sisältää hrp-geeniryhmä

Molecular investigations of infection mechanisms in Gram-positive plant pathogenic bacteria: virulence factors for Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms), a Gram-positive bacterium related to Mycobacterium and Streptomyces, is the causal agent of potato ring rot disease. Despite eradication programmes throughout Europe, the disease continues to cause significant economic losses. The main task of our project is to understand, at the molecular level, the virulence factors produced by Cms. Cms produces a secreted cellulase, which we call CelA. We have cloned and sequenced the gene for this protein. Strains and mutants of the bacteria that do not produce cellulase are only weakly virulent. However, virulence can be partially restored by transferring the cellulase gene to a non-cellulase producing strain or mutant, thereby restoring cellulase expression. This indicates that cellulase is an important virulence factor. On the basis of the deduced amino acid sequence, we have found that the enzyme has an unusual structure. Cellulases are very often multi-domain proteins containing both a catalytic domain and a cellulose-binding domain. However, we have found that CelA contains a third domain unlike any domain previously shown to be associated with a cellulase. The peptide sequence of this domain shows significant similarity to plant proteins called expansins. Expansins are plant cell wall proteins that allow cell walls to expand during growth, presumably by acting as a molecular grease that permits cellulose microfibrils to slip past each other during cell expansion. It is possible, then, that domain 3 of CelA is involved in opening up cellulose fibres in the cell walls of infected plants. In addition to our work on cellulase, we have found that Cms produces proteins that cause a hypersensitive reaction (HR) when inoculated into tobacco. We have purified one of these proteins and are in the process of isolating and cloning the gene that encodes it. In many Gram-negative plant pathogens, an HR inducer protein (called harpin) is encoded on the hrp locus (hypersensitive response and pathogenicity locus). The hrp locus encodes the type III secretion system found in both plant and animal pathogens. The type III secretion system is believed to inject virulence factors directly into the host cell. Because our results show that Cms produces and secretes HR-inducing protein, it too may contain an hrp locus.