Jukuri, open repository of the Natural Resources Institute Finland (Luke) All material supplied via Jukuri is protected by copyright and other intellectual property rights. Duplication or sale, in electronic or print form, of any part of the repository collections is prohibited. Making electronic or print copies of the material is permitted only for your own personal use or for educational purposes. For other purposes, this article may be used in accordance with the publisher’s terms. There may be differences between this version and the publisher’s version. You are advised to cite the publisher’s version. This is an electronic reprint of the original article. This reprint may differ from the original in pagination and typographic detail. Author(s): J. Alexander Osorio, Yajaira Ríos & Riikka Linnakoski Title: Fungal Endophytes Isolated From Mangroves In San Pedro Nature Reserve, Buenaventura Year: 2023 Version: Published version Copyright: The Author(s) 2023 Rights: CC BY-NC-SA 4.0 Rights url: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Please cite the original version: osoOsorio, J. A.; Ríos, Y.; Linnakoski, R. (2023). Fungal Endophytes Isolated From Mangroves In San Pedro Nature Reserve, Buenaventura. Bol. Investig. Mar. Costeras [Internet]. 2023 Oct. 11 [cited 2023 Dec. 29];52(2):143-60. Available from: http://boletin.invemar.org.co/ojs/index.php/boletin/article/view/1231 Published by Invemar This is an open Access article under the CC BY-NC-SA 143 DOI: https://doi.org/10.25268/bimc.invemar.2023.52.2.1231 Publicado por Invemar Este es un manuscrito de acceso abierto bajo la licencia CC Reconocimiento-No Comercial-Compartir Igual Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras “José Benito Vives de Andréis” Santa Marta, Colombia Boletín de Investigaciones Marinas y Costeras Bulletin of Marine and Coastal Research 52 (2), 143-160 ISSN 0122-9761 e-ISSN 2590-4671 2023 (jul-dic/ Jul-Dec) Hongos endófitos aislados de manglares en la Reserva Natural San Pedro, Buenaventura Fungal endophytes isolated from mangroves in San Pedro Nature Reserve, Buenaventura J. Alexander Osorio1*, Yajaira Ríos1 y Riikka Linnakoski2 0000-0003-1774-616X 0000-0002-4303-6703 0000-0002-3294-8088 1. Programa de Biología, Universidad del Quindío, Carrera 15 # 12N, Armenia-Quindío, Colombia. jaosorior@uniquindio.edu.co, osorio.romero17@gmail.com*, yriosa@uqvirtual.edu.co 2. Natural Resources Institute Finland (Luke), Latokartanonkaari 9, 00790 Helsinki, Finland. riikka.linnakoski@luke.fi * Autor de correspondencia / Corresponding autor RESUMEN Los árboles de mangle crecen en zonas estuarinas de las regiones tropicales y subtropicales, donde prestan importantes servicios económicos, ecológicos y culturales. Los estudios han demostrado que estos árboles son importantes reservorios de microorganismos fúngicos, que comprenden una serie de hongos morfológicamente diversos incluyendo patógenos, endófitos o saprobios, desempeñando un papel clave en el ciclado de nutrientes, protección del hospedero frente a condiciones adversas y, en muchas ocasiones, el declive de los hospederos. Con el fin de determinar la diversidad de hongos endófitos asociados a árboles de mangle en la Reserva Natural San Pedro, Buenaventura, Colombia; se colectaron ramas sanas (longitud aprox. 10 cm) de Laguncularia racemosa, Mora oleifera, Pelliciera rhizophorae y Rhizophora racemosa para los respectivos aislamientos fúngicos. Se extrajo ADN y se amplificó la región del espaciador transcrito interno (ITS), seguido de análisis filogenéticos tales como Bayesiano (BI), Máxima Verosimilitud (ML) y Máxima Parsimonia (MP). En total se identificaron nueve géneros, Bipolaris, Ciboria, Coprinellus, Cylindrobasidium, Epicoccum, Fusarium, Lasiodiplodia, Neofusicoccum y Neurospora pertenecientes a ocho familias. De estos, Fusarium, Lasiodiplodia y Neofusicoccum son bien conocidos por su alto potencial para amenazar la salud de sus huéspedes cuando sus condiciones son adversas, igualmente los hongos endófitos también cumplen un papel importante en la producción de biocompuestos para la protección de sus hospedaros. Palabras clave: Análisis molecular, asociación hongo-huésped, ecosistemas costeros, patógenos fúngicos. ABSTRACT Mangrove trees grow in estuarine zones in tropical and subtropical regions, where they provide important economic, ecological and cultural services. Studies have shown that these trees are important reservoirs of fungal microorganisms, which encompasses a range of morphologically diverse fungi that are either pathogens, endophytes or saprobes, playing a key role in nutrient cycling, host protection against adverse conditions and in many occasions host decline. To determine the diversity of endophytic fungi associated with mangrove trees in the San Pedro Natural Reserve, Buenaventura, Colombia, healthy branches (length approx. 10 cm) of Laguncularia racemosa, Mora oleifera, Pelliciera rhizophorae and Rhizophora racemosa were collected for the respective fungal isolations. DNA was extracted and the Internal Transcribed Spacer (ITS) region was amplified, followed by phylogenetic analyses such as Bayesian (BI), Maximum Likelihood (ML) and Maximum Parsimony (MP). A total of nine genera, Bipolaris, Ciboria, Coprinellus, Cylindrobasidium, Epicoccum, Fusarium, Lasiodiplodia, Neofusicoccum and Neurospora belonging to eight families were identified. Of these, Fusarium, Lasiodiplodia and Neofusicoccum are well known for their high potential to threaten the health of their hosts when conditions are adverse. Endophytic fungi also play an important role in the production of biocompounds for the protection of their hosts. Keywords: Coastal ecosystems, fungal pathogens, fungus-host association, molecular analysis. https://doi.org/10.25268/bimc.invemar.2023.52.2.1231 http://orcid.org/0000-0003-1774-616X http://orcid.org/0000-0002-4303-6703 http://orcid.org/0000-0002-3294-8088 mailto:jaosorior@uniquindio.edu.co mailto:osorio.romero17@gmail.com mailto:yriosa@uqvirtual.edu.co mailto:riikka.linnakoski@luke.fi 144 Bulletin of Marine and Coastal Research • Vol. 52 (2) • 2023 (July-December) INTRODUCcIÓN Los bosques de manglar son ecosistemas altamente productivos de las áreas intermareales de las regiones tropicales y subtropicales (Spalding et al., 2010; Tomlinson, 2016). Colombia tiene la tercera mayor extensión de manglares en Latinoamérica, con un área aproximada de 371 081 ha, de las cuales 282 835 ha están en la costa del Pacífico (Giri et al., 2011). En el Pacífico colombiano, los ecosistemas de manglar consisten principalmente en ocho especies: Avicennia germinans (L.), Conocarpus erectus L., Laguncularia racemosa (L.) C.F. Gaertn., Mora oleifera (Triana ex Hemsl.) Ducke, Pelliciera rhizophorae Planch. y Triana, Rhizophora harrisonii Leechm., Rhizophora mangle L. y Rhizophora racemosa G. Mey. (García, 2010; Cornejo et al., 2014; Mejía et al., 2014). Estas especies también brindan servicios importantes a las comunidades locales de la región (Palacios y Cantera, 2017). Sin embargo, a pesar de estos beneficios, se ha reconocido ampliamente que una combinación de actividades humanas y eventos naturales está relacionada con el declive de estos árboles en esta parte del país (Prahl, 1989; Álvarez, 2003; López et al., 2016). En los últimos años, se ha prestado una atención considerable al potencial productivo de los ecosistemas de manglar debido a la actividad metabólica de las comunidades fúngicas (Hyde y Lee, 1995; Rineau et al., 2013; Thatoi et al., 2013). Este potencial ha despertado gran interés en la investigación de las asociaciones entre árboles de mangle y hongos potencialmente beneficiosos como los endófitos (Petrini, 1991; Wilson, 1995), que colonizan los tejidos internos de las plantas, protegiéndolas de factores adversos (Gilbert et al., 2002; Arnold, 2007) o desempeñándose como patógenos oportunistas cuando los hospederos están bajo diferentes niveles de estrés (Slippers y Wingfield, 2007). Para Colombia se han registrado números de hongos endófitos en plantas nativas o no nativas y sintomáticas o asintomáticas (e.g., Salazar y Garcia, 2005; Ordóez et al., 2012; Gamboa y Otero, 2016). Sin embargo, los estudios sobre estos grupos fúngicos asociados con especies de manglar en el país aún son muy escasos (Bolívar-Anillo et al., 2015). El objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de endófitos fúngicos asociados con especies de manglar en la Reserva Natural San Pedro (Buenaventura, Colombia), así como determinar su posible rol en el desarrollo de enfermedades con base en la literatura relevante. INTRODUCTION Mangrove forests are highly productive ecosystems of intertidal areas in tropical and subtropical regions (Spalding et al., 2010; Tomlinson, 2016). Colombia is the third-largest mangrove country in the Latin America, with an approximate area of 371,081 ha. of which 282,835 ha. are on the Pacific coast (Giri et al., 2011). In the Colombian Pacific, mangrove ecosystems consist mainly of eight species including Avicennia germinans (L.), Conocarpus erectus L., Laguncularia racemosa (L.) C.F. Gaertn., Mora oleifera (Triana ex Hemsl.) Ducke, Pelliciera rhizophorae Planch. and Triana, Rhizophora harrisonii Leechm., Rhizophora mangle L., and Rhizophora racemosa G. Mey. (García, 2010; Cornejo et al., 2014; Mejía et al., 2014). In addition, these species also provide important services to the local communities of the region (Palacios and Cantera, 2017). However, despite these benefits, combinations of human activities and natural events have been widely recognized to be associated with the decline of these trees in this part of the country (Prahl, 1989; Álvarez, 2003; López et al., 2016). In recent years, the productive potential of mangrove ecosystems has been largely considered due to the metabolic activity of fungal communities (Hyde and Lee, 1995; Rineau et al., 2013; Thatoi et al., 2013). This potential has aroused great interest in investigating associations between mangrove trees and potentially beneficial fungi such as endophytes (Petrini, 1991; Wilson, 1995), which colonize the internal tissues of plants by protecting them from adverse factors (Gilbert et al., 2002; Arnold, 2007), or turning as opportunistic pathogens when plants are under different levels of stress (Slippers and Wingfield, 2007). Numerous species of endophytic fungi have been reported in Colombia, either from native or non-native symptomatic or asymptomatic plants (e.g., Salazar and Garcia, 2005; Ordóez et al., 2012; Gamboa and Otero, 2016). However, studies on these fungal groups associated with mangrove species in the country remain very limited (Bolívar-Anillo et al., 2015). The objective of this study was to evaluate the presence of fungal endophytes associated with mangrove species in the San Pedro Nature Reserve, Buenaventura, Colombia, and to determine their possible role in disease development based on relevant literature. Marine and Coastal Research Institute 145 Área de Estudio La Reserva Natural San Pedro (03° 50’ 06” N y 77° 15’ 28” W) está ubicada en el istmo de Pichidó, en el área media de la costa pacífica colombiana, municipio de Buenaventura (Valle del Cauca). La reserva tiene una extensión de 100 ha, de las cuales el 40 % corresponde a ecosistemas de manglar y 60 % a bosques lluviosos. Tiene una temperatura anual promedio de 26 °C, una humedad relativa de 80-98 % y una precipitación anual promedio de 7 000 mm. Hay cuatro especies de manglar en esta reserva natural: Laguncularia racemosa, Mora oleifera, Pelliciera rhizophorae y Rhizophora racemosa (Fig. 1). Figura 1. Área de estudio. Reserva Natural San Pedro, Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia. MATERIALES Y MÉTODOS Muestreo de campo Se realizó un reconocimiento del área de estudio, seguido de un muestreo aleatorio de segmentos de ramas asintomáticas del área media del dosel. Se recolectó un total de 20 ramas de aproximadamente 10 cm de longitud (ca.). Se colocaron cinco de cada especie de manglar (Laguncularia racemosa, Mora oleifera, Pelliciera rhizophorae y Study area The San Pedro Nature Reserve (03° 50’ 06” N y 77° 15’ 28” W), is located at the isthmus of Pichidó, in the middle area of the Colombian Pacific coast, in the municipality of Buenaventura (Valle del Cauca). The reserve has an area of 100 ha, of which 40 % is mangrove ecosystem and 60 % rainforest. It has an average annual temperature of 26 °C, the relative humidity is 80 % to 98 %, and an average annual rainfall of 7,000 mm. Four mangrove species are present at this nature reserve, including Laguncularia racemosa, Mora oleifera, Pelliciera rhizophorae, and Rhizophora racemosa (Fig. 1). Figure 1. Study area. San Pedro Nature Reserve, Buenaventura, Valle del Cauca, Colombia. MATERIALS AND METHODS Field sampling Prior recognition of the study area was performed, followed by a random sampling of asymptomatic branch segments from the middle part of canopy. In total 20 branches of approximately 10 cm long (ca.) were collected, five from each mangrove species including Laguncularia racemosa, Mora oleifera, Pelliciera rhizophorae and Rhizophora 146 Boletín de Investigaciones Marinas y Costeras • Vol. 52 (2) • 2023 (julio-diciembre) racemosa were placed in paper bags and stored in a portable refrigerator. They were subsequently transferred and preserved in the laboratory of the Biology Program of the Universidad del Quindío for further fungal isolation. It needs to be considered that the sampling size (number of branches collected) performed in this study depended on the sampling permits obtain from the National Environmental Licensing Authority. Fungal isolations The isolation of endophytes was carried out following the protocol described by Slippers and Wingfield (2007), with certain modifications made by Osorio et al., (2017). The collected branches were washed with tap water to remove excess debris and for each branch, five portions of 0.5 cm approximately were cut. These fragments were submerged in 90 % ethanol for one minute, followed by sodium hypochlorite (NaOCl) at 4 % (1 min), then in 70 % ethanol (1 min), and ending with a rinse in distilled water (1 min). After surface sterilization and the pieces were placed on sterile paper for drying, each fragment was transferred to 2 % malt extract agar (MEA; 20 g malt extract, 20 g Biolab Agar in 1 L of distilled water), containing 50 mg of streptomycin to prevent bacterial colonization. The samples were incubated at room temperature, in natural light and darkness. The resulting colonies were purified using the “single hyphal tip” method, as described in the procedure carried out by Osorio et al., (2017), subsequently, the resulting colonies were separated into morph-groups for the following DNA extraction, which was performed by following the methodology of Raeder and Broda (1985). Direct PCR amplification and sequencing PCR was performed directly from representative pure cultures without prior DNA purification using Phire Plant Direct PCR kit (Thermo Scientific, USA) following the manufacturer’s instructions. ITS1-F and ITS4 primers (White et al., 1990) were used for the amplification of the ITS region. 25 µl PCR reactions contained 0.5 µl DNA template, 0.5 µM ITS1-F and ITS4 primers, 15 µl 2 × Phire Plant PCR buffer (includes dNTPs and MgCl2) (Thermo Scientific) and 0.5 µl Phire Hot Start II DNA Polymerase (Thermo Scientific). Initial denaturation was performed at 98 °C for 5 min followed by 35 cycles of (1) denaturation at 98 °C for 5 s, (2) annealing at 55 °C for 5 s, and (3) extension at 72 °C for 20 s. The final extension occurred at 72 °C for 1 min. The amplified PCR products were run on 1 % agarose gels, and Rhizophora racemosa) en bolsas de papel y se almacenaron en un refrigerador portátil. Acto seguido, las muestras fueron transferidas y preservadas en el laboratorio del Programa de Biología de la Universidad del Quindío para aislamiento fúngico. Debe tenerse en cuenta que, en este estudio, el tamaño de la muestra (el número de ramas recolectadas) dependió de los permisos de muestreo otorgados por la Autoridad Nacional de Licencias Ambientales (ANLA). Aislamiento fúngico El aislamiento de endófitos se realizó siguiendo el protocolo descrito por Slippers y Wingfield (2007), con ciertas modificaciones hechas por Osorio et al. (2017). Las ramas recolectadas se lavaron con agua de la llave para remover el exceso de desechos y, para cada rama, se cortaron cinco porciones de 0.5 cm aproximadamente. Estos fragmentos se sumergieron en etanol al 90 % por 1 min, luego en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 4 % (1 min) y después en etanol al 70 % (1 min), finalizando con un enjuague en agua destilada (1 min). Después de esterilizar la superficie y colocar las piezas en papel estéril para secarlas, cada fragmento se transfirió a agar de extracto de malta al 2 % (MEA; 20 g de extracto de malta, 20 g de agar Biolab en 1 L de agua destilada), el cual contenía 50 mg de estreptomicina para prevenir la colonización bacteriana. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente, en luz y oscuridad naturales. Las colonias resultantes se purificaron utilizando el método de ‘punta hifal única’, tal y como se describe en el procedimiento realizado por Osorio et al. (2017). Acto seguido, las colonias se separaron en morfogrupos para la posterior extracción de su ADN, la cual se llevó a cabo siguiendo la metodología de Raeder y Broda (1985). Amplificación y secuenciación por PCR directa Se realizó PCR directamente de cultivos puros representativos sin purificación previa de ADN, utilizando el kit Phire Plant Direct PCR (Thermo Scientific, EE. UU.) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los cebadores ITS1-F e ITS4 (White et al., 1990) para amplificar la región ITS. Las reacciones PCR de 25 µl contenían 0.5 µl de molde de ADN, 0.5 µM de los cebadores ITS1-F e ITS4, 15 µl 2 × del buffer PCR Phire Plant (que incluye dNTPs y MgCl2) (Thermo Scientific) y 0.5 µl de polimerasa II de ADN Phire Hot Start (Thermo Scientific). La desnaturalización inicial se llevó a cabo a 98 °C por 5 min, seguida de 35 ciclos de (1) desnaturalización a 98 °C por 5 s, (2) recocido a 55 °C por 5 s y (3) extensión a 72 °C por 20 s. La extensión final ocurrió a 72 °C por 1 min. Los productos PCR amplificados se colocaron Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras 147 en geles de agarosa, y aquellos que fueron amplificados con éxito se purificaron mediante el protocolo EXO-SAP, i.e., el producto PCR (20 μl) se mezcló con 8 μl de Exo-SAP [5 μl de exonucleasa I (20 U/μl) (Fermentas, Vilnius, Lituania) y 100 μl de fosfatasa alcalina de camarón (1 U/μL) (Roche Diagnostics, Indianapolis, EE. UU.) en una mezcla de reacción de 1000 μl]. Las muestras fueron incubadas a (1) 37 °C por 15 min y (2) a 80 °C por 15 min. Los productos PCR fueron secuenciados en Macrogen Europe. Las secuencias resultantes se analizaron manualmente, y se obtuvieron secuencias de consenso utilizando el software Sequencher v.5. Análisis filogenético Las secuencias obtenidas se compararon con los datos de especie en GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) realizando búsquedas BLAST mediante el algoritmo BLASTn (Altschul et al., 1990). Se obtuvieron secuencias de ADN de especies estrechamente relacionadas desde GenBank y se combinaron en conjuntos de datos con las secuencias ITS de los aislados obtenidos en este estudio (Table 1). La selección del grupo externo de cada conjunto de datos se llevó a cabo con base en los resultados de estudios anteriores, incluyendo los de Sun y Guo (2012) y Osorio et al. (2017). Los conjuntos de datos se alinearon utilizando el programa MAFFT (https://mafft.cbrc. jp/alignment/server/), seleccionando el método de refinamiento iterativo G-INS-i (Kuraku et al., 2013; Katoh et al., 2019), y se editaron manualmente en MEGA v. 10.1.7 (Kumar et al., 2018). Se realizaron reconstrucciones filogenéticas por máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana (BI) para cada conjunto de datos obtenido. Tabla 1. Números e información de acceso en GenBank para los aislados obtenidos de árboles de mangle en la Reserva Natural San Pedro de Buenaventura (Colombia). Especie / Specie # del aislado / # Isolated Anfitrión / Host Código de acceso Genbank para la región del gen ITS / Genbank Access code for the ITS gene region Bipolaris sp. COLPR-12 Pelliciera rhizophorae MW029957 Bipolaris sp. COLPR-15 Pelliciera rhizophorae MW029956 Ciboria aestivalis COLLR-3 Laguncularia racemosa MW029950 Coprinellus radians COLRR-11 Rhizophora racemosa MW029960 Cylindrobasidium torrendii COLLR-1 Laguncularia racemosa MW029959 Cylindrobasidium torrendii COLPR-13 Pelliciera rhizophorae MW029958 Epicoccum nigrum COLRR-10 Rhizophora racemosa MW029955 successfully amplified products were purified with EXO-SAP protocol: the PCR product (20 μl) was mixed with 8 μl of Exo-SAP [5 μl of Exonuclease I (20 U/μl) (Fermentas,Vilnius, Lithuania) and 100 μl of Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA) in a 1000 μl reaction mixture]. The samples were incubated at (1) 37 °C for 15 minutes and (2) at 80 °C for 15 minutes. The PCR products were sequenced at Macrogen Europe. The resulting sequences were manually analyzed, and consensus sequences obtained by using Sequencher v.5 software. Phylogenetic analysis The obtained sequences were compared to the species data in GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi) by performing BLAST searches on GenBank using the BLASTn algorithm (Altschul et al., 1990). DNA sequences of closely related species were obtained from GenBank and combined into datasets with the ITS sequences of the isolates obtained in this study (Table 1). The selection of the outgroup for each dataset was made according to the results of previous studies, including those of Sun and Guo (2012) and Osorio et al. (2017). The data sets were aligned using the MAFFT program (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/), selecting the iterative refinement method G-INS-i (Kuraku et al., 2013; Katoh et al., 2019) and were manually edited with MEGA v. 10.1.7 (Kumar et al., 2018). Phylogenetic reconstructions were performed by maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML), and bayesian inference (BI) for each dataset obtained. Table 1. Isolate numbers and access information to GenBank of isolates obtained from mangrove trees in the San Pedro Buenaventura Nature Reserve (Colombia). https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/ https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi https://mafft.cbrc.jp/alignment/server 148 Bulletin of Marine and Coastal Research • Vol. 52 (2) • 2023 (July-December) Especie / Specie # del aislado / # Isolated Anfitrión / Host Código de acceso Genbank para la región del gen ITS / Genbank Access code for the ITS gene region Fusarium oxysporum COLLR-2 Laguncularia racemosa MW029951 Fusarium oxysporum COLPR-14 Pelliciera rhizophorae MW029952 Fusarium oxysporum COLMO-16 Mora oleifera MW029953 Lasiodiplodia theobromae COLLR-17 Laguncularia racemosa MW029949 Lasiodiplodia venezuelensis COLRR-9 Rhizophora racemosa MW029948 Neofusicoccum sp. COLRR-6 Rhizophora racemosa MW029946 Neofusicoccum sp. COLRR-7 Rhizophora racemosa MW029947 Neofusicoccum batangarum COLLR-5 Laguncularia racemosa MW029944 Neofusicoccum batangarum COLRR-8 Rhizophora racemosa MW029945 Neurospora crassa COLLR-4 Laguncularia racemosa MW029954 Los análisis de MP se llevaron a cabo en PAUP v. 4. 0b10 (Swofford, 2003), utilizando una búsqueda heurística y el algoritmo de reorganización de bisección-reconexión de árboles. Las brechas se trataron como datos faltantes, y todos los caracteres fueron tratados de manera no ordenada y con el mismo peso. Se obtuvo soporte estadístico para los nuevos mediante 1000 repeticiones bootstrap. Para los análisis de ML y BI, se obtuvieron modelos de reemplazo con antelación utilizando el software jModelTest v. 2.1.10 (Darriba et al., 2012) y los criterios de información Akaike (AIC) (Akaike, 1974). Los análisis de ML se llevaron a cabo en el programa PhyML v. 3.1 (Guindon y Gascuel, 2003), teniendo en cuenta los modelos obtenidos a través de jModelTest. Los valores de soporte para los nuevos estimaron utilizando 1000 repeticiones bootstrap de ML. Posteriormente, se determinaron las probabilidades de BI con base en el algoritmo de cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) en MrBayes v. 3.2.7a (Ronquist et al., 2012). Se realizaron dos ejecuciones independientes de manera simultánea para cinco millones de generaciones. Los valores de quemado se determinaron mediante el software Tracer v. 1.7.1 (Rambaut et al., 2018). Los primeros 0.25 árboles muestreados que representaran la fase de quemado fueron descartados, y los restantes se utilizaron para construir el árbol de consenso. Por último, los árboles filogenéticos obtenidos de los análisis de BI, ML y MP fueron editados en FigTree v. 1.4.4 (http://tree. bio.ed.ac.uk/software/figtree/) y/o MEGA v. 10.1.7 (Kumar et al., 2018). Analyses of the MP were performed in PAUP v. 4. 0b10 (Swofford, 2003) using a heuristic search and tree- bisection-reconnection (TBR) reorganization algorithm. Gaps were treated as missing data and all characters were treated as unordered type with the same weight. Statistical support for the nodes was obtained by performing 1000 bootstrap replicates. For ML and BI analyses, replacement models were previously obtained using the jModelTest software v. 2.1.10 (Darriba et al., 2012) using the Akaike (AIC) information criteria (Akaike, 1974). ML analyses were performed with the PhyML v. 3.1 program (Guindon and Gascuel, 2003), considering the models obtained with jModelTest. The support values for the nodes were estimated using 1000 ML bootstrap replicates. Subsequent probabilities for BI were determined based on the Markov Chain Monte Carlo (MCMC) algorithm that was performed on MrBayes v. 3.2.7a (Ronquist et al., 2012). Two independent runs were conducted simultaneously for 5 million generations. The burn-in values were determined through Tracer software v. 1.7.1 (Rambaut et al., 2018), the first 0.25 sampled trees that represented the burn-in phase were discarded and the remaining trees were used to build the consensus tree. Finally, the phylogenetic trees obtained from the BI, ML and MP analyses were edited in FigTree v. 1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) and/or MEGA v. 10.1.7 (Kumar et al., 2018). http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ Marine and Coastal Research Institute 149 RESULTADOS Se muestrearon 20 ramas en total, pertenecientes a cuatro especies de manglar. De estas, se aislaron 17 hongos endófitos, que representan nueve géneros pertenecientes a ocho familias, incluyendo a Botryosphaeriaceae, Didymellaceae, Nectriaceae, Physalacriaceae, Pleosporaceae, Psathyrellaceae, Sclerotiniaceae y Sordariaceae; dos en Basidiomycota y seis en Ascomycota. De estos aislados, se obtuvieron seis de L. racemosa, seis de R. racemosa, cuatro de P. rhizophorae y uno de M. oleifera. Amplificación y secuenciación por PCR Los fragmentos obtenidos de las secuencias ITS tenían un tamaño aproximado de entre 465 y 606 bp. Las secuencias incluidas en este estudio se depositaron en la base de datos GenBank de secuencias de ADN (Tabla 1). Análisis filogenético Los análisis de BI, ML y MP para la región genética ITS mostraron topologías congruentes soportadas por valores de soporte bootstrap y probabilidades subsiguientes, identificando ocho familias de hongos (Fig. 2). La filogenia generada para Botryosphaeriaceae incluyó 15 especies RESULTS A total of 20 branches were sampled, belonging to four mangrove species. Of these, 17 endophytic fungi were isolated, representing nine genera belonging to eight families including Botryosphaeriaceae, Didymellaceae, Nectriaceae, Physalacriaceae, Pleosporaceae, Psathyrellaceae, Sclerotiniaceae and Sordariaceae; two in the Basidiomycota and six in the Ascomycota. Of these isolates, six were obtained from L. racemosa, six from R. racemosa, four from P. rhizophorae and one from M. oleifera. PCR amplification and sequencing Fragments obtained from the ITS sequences, comprised approximately 465 to 606 bp in size. The sequences included in this study were deposited in the GenBank DNA sequence database (Table 1). Phylogenetic analysis Analyses of BI, ML and MP, for the ITS gene region showed congruent topologies supported by bootstrap support values and subsequent probabilities, thus identifying eight fungal families (Fig. 2). The phylogeny generated for Botryosphaeriaceae included fifteen species previously Figura 2. Familias de hogos endófitos aislados de cuatro especies de manglar. Filograma obtenido de los análisis de BI, ML y MPF del conjunto de datos ITS. Las secuencias obtenidas en este estudio se muestran en negrita. Las probabilidades subsiguientes ≥ 95 % de BI se representan con ramas gruesas. Los valores de soporte bootstrap > 70 % se indican cerca a los nodos como MP/ML. * • Valores de soporte bootstrap < 70 %. Figure 2. Families of isolated endophyte fungi of four mangrove species. A phylogram obtained from the BI, ML and MP analyses of the ITS dataset. The sequences obtained in this study in bold. The subsequent probabilities ≥ 95 % of BI are represented by thick branches. Bootstrap support values > 70 % are indicated near nodes as MP/ML. * • Bootstrap support values < 70 %. 150 Boletín de Investigaciones Marinas y Costeras • Vol. 52 (2) • 2023 (julio-diciembre) previamente descritas con base en la región ITS (Fig. 3a). En Didymellaceae, se realizó una comparación filogenética de 18 especies, de las cuales solo se obtuvo un aislado (MW029955) de los manglares (Fig. 3b). Para Nectriaceae, se tomaron 14 especies previamente descritas como referencia, y tres aislados obtenidos de árboles de mangle (MW029951, MW029952, MW029953) fueron agrupados en el mismo clado con Fusarium falciforme (Carrión) Summerb. y Schroers 2002, F. oxysporum y F. solani (Fig. 4a). La filogenia de Physalacriaceae incluyó nueve especies previamente descritas. Dos aislados obtenidos de manglares (MW029959, MW029958) presentaron una estrecha relación con Cylindrobasidium torrendii (Fig. 4b). Para Pleosporaceae, el análisis filogenético incluyó 16 especies previamente descritas. Dos aislados obtenidos de manglares (MW029957, MW029956) formaron un clado independiente dentro de la familia (Fig. 4c). En Psathyrellaceae, los análisis filogenéticos incluyeron 13 especies, de las cuales se agrupó un único aislado de manglar (MW029960) con Coprinellus radians (Fig. 5a). En Sclerotiniaceae, el aislado MW029950 se agrupó estrechamente con dos especies en el mismo clado: Ciboria aestivalis y Moellerodiscus lentus (Fig. 5b). Para Sordariaceae, un aislado de manglar (MW029954) se agrupó con Neurospora crassa, N. pannonica, N. sitophila y N. tetrasperma (Fig. 5c). Figura 3. Filograma de géneros en Botryosphaeriaceae. Seis de los 17 aislados obtenidos de manglar están estrechamente agrupados con los géneros Lasiodiplodia y Neofusicoccum (3a). Filograma del género Didymellaceae, indicando que uno de los aislados obtenidos de Rhizophora racemosa (negrita) está agrupado con diferentes especies de Epicoccum (3b). Filogramas obtenidos de los análisis de BI, ML y MP para el conjunto de datos ITS. Las probabilidades subsiguientes ≥ 95 % de BI se representan con ramas gruesas. Los valores de soporte bootstrap > 70 % se indican cerca a los nodos como MP/ML. * • Valores de soporte bootstrap < 70 %. described based on the ITS region (Fig. 3a). In Didymellaceae 18 species were phylogenetically compared, of which only one isolate (MW029955), was obtained from mangroves (Fig. 3b). For Nectriaceae, fourteen species described earlier were used as references; three isolates obtained from mangrove trees (MW029951, MW029952, MW029953) grouped in the same clade with Fusarium falciforme (Carrión) Summerb. and Schroers 2002, F. oxysporum and F. solani (Fig. 4a). Phylogeny of Physalacriaceae included nine previously described species; two isolates obtained from mangroves (MW029959, MW029958) were closely related to Cylindrobasidium torrendii (Fig. 4b). In Pleosporaceae, 16 species described earlier were included in the phylogenetic analysis; two isolates obtained from mangroves (MW029957, MW029956) formed a separate clade within the family (Fig. 4c). In Psathyrellaceae, 13 species were included in the phylogenetic analyses, of these, a single isolate obtained from mangroves (MW029960) grouped with Coprinellus radians (Fig. 5a). In Sclerotiniaceae, the isolate (MW029950) was closely grouping with two species in the same clade, Ciboria aestivalis and Moellerodiscus lentus (Fig. 5b). In Sordariaceae, a mangrove isolate (MW029954) was grouping with Neurospora crassa, N. pannonica, N. sitophila and N. tetrasperma (Fig. 5c). Figure 3. Phylogram of genera in Botryosphaeriaceae. Six of the 17 mangrove isolates are closely grouped with the genera Lasiodiplodia and Neofusicoccum (3a). A phylogram of Didymellaceae genera, indicating that one of the isolates obtained from Rhizophora racemosa (in bold) is grouped with different species of Epicoccum (3b). Phylograms obtained from BI, ML and MP analyses of the ITS dataset. The subsequent probabilities ≥ 95 % of IB are represented by thick branches. Bootstrap support values > 70 % are indicated near nodes as MP/ML. * • Bootstrap support values < 70 %. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras 151 Figura 4. Análisis filogenético de los géneros en Nectriaceae. Los aislados de manglar (negrita) se agrupan con diferentes especies de Fusarium (4a). Filograma con el género Physalacriaceae. Los aislados obtenidos de manglares se agrupan claramente con Cylindrobasidium torrendii (4b). Filograma del género Pleosporaceae. Los aislados obtenidos de Pelliciera rhizophorae (negrita) sugieren una relación estrecha con Bipolaris simmondsii (4c). Filogramas obtenidos de los análisis de BI, ML y MP para el conjunto de datos ITS. Las probabilidades subsiguientes ≥ 95 % de BI se representan con ramas gruesas. Los valores de soporte bootstrap > 70 % se indican cerca a los nodos como MP/ML. * • Valores de soporte bootstrap < 70 %. Figura 5. Filogramas obtenidos de los géneros en Psathyrellaceae, indicando que uno de los aislados obtenidos de Rhizophora racemosa (negrita) está estrechamente relacionado con Coprinellus radians (5a). Filograma de géneros en Sclerotiniaceae, indicando que uno de los aislados obtenidos de Laguncularia racemosa (negrita) se agrupa con Moellerodiscus lentus y Ciboria aestivalis (5b). Filograma obtenido de los géneros en Sordariaceae. Se muestra que los aislados obtenidos de las ramas de Laguncularia racemosa (negrita) se agrupan con cuatro especies de Neurospora (5c). Filogramas obtenidos de los análisis de BI, ML y MP para el conjunto de datos ITS. Las probabilidades subsiguientes ≥ 95 % de BI se representan con ramas gruesas. Los valores de soporte bootstrap > 70 % se indican cerca a los nodos como MP/ML. * • Valores de soporte bootstrap < 70 %. Figure 4. Phylogenetic analysis of genera in Nectriaceae. Mangrove isolates (in bold) are grouped with different species of Fusarium (4a). Phylogram with genus Physalacriaceae, the isolates obtained from mangroves are clearly grouping with Cylindrobasidium torrendii (4b). Phylogram of Pleosporaceae genera. Isolations obtained from Pelliciera rhizophorae (in bold) suggest a close relationship with Bipolaris simmondsii (4c). Phylograms obtained from BI, ML and MP analyses of the ITS dataset. The subsequent probabilities ≥ 95 % of IB are represented by thick branches. Bootstrap support values > 70 % are indicated near nodes as MP/ML. * • Bootstrap support values < 70 %. Figure 5. Phylograms obtained from genera in Psathyrellaceae indicating that one of the isolations obtained from Rhizophora racemosa (in bold) is closely related to Coprinellus radians (5a). Phylogram of genera in Sclerotiniaceae indicating that one of the isolates obtained from Laguncularia racemosa (in bold) groups with Moellerodiscus lentus and Ciboria aestivalis (5b). Phylogram obtained from genera in Sordariaceae,shows that isolations obtained from branches of Laguncularia racemosa (in bold) groups with four species of Neurospora (5c). Phylograms obtained from BI, ML and MP analyses of the ITS dataset. The subsequent probabilities ≥ 95 % of IB are represented by thick branches. Bootstrap support values > 70 % are indicated near nodes as MP/ML. * • Bootstrap support values < 70 %. 152 Bulletin of Marine and Coastal Research • Vol. 52 (2) • 2023 (July-December) DISCUSIÓN Este estudio representa la primera aproximación filogenética a los hongos endófitos asociados con árboles de mangle en un área de la costa del Pacífico colombiano. Se identificaron nueve géneros fúngicos con base en datos de secuencia de ADN para la región ITS, la cual es ampliamente utilizada como un marcador molecular en la identificación de hongos y en estudios taxonómicos (Hibbett et al., 2011; Joel y Bhimba, 2013). A partir del análisis filogenético, se verificó la identidad de los aislados, revelando que los endófitos recolectados en este estudio se agrupan estrechamente con especies como Ciboria aestivalis, Coprinellus radians, Cylindrobasidium torrendii, Epicoccum nigrum, Fusarium oxysporum, Lasiodiplodia theobromae, Lasiodiplodia venezuelensis, Neofusicoccum batangarum y Neurospora crassa. Esto, además de dos aislados que no pudieron confirmarse a nivel de especie. Se registraron Bipolaris sp. y Neofusicoccum sp. por primera vez en la costa del Pacífico colombiano. Los hongos obtenidos en este estudio pertenecen en su mayorá a Ascomycota, con 14 aislados en distintos géneros. Entretanto, tres aislados fueron miembros de Basidiomycota. Curiosamente, estudios anteriores han confirmado que las partes aéreas y sumergidas de los árboles de mangle son mayoritariamente dominadas por ascomicetos, mientras que los basidiomicetos se encuentran en menor proporción (Alias et al., 2010; Sun y Guo, 2012; Abdel et al., 2014; Simões et al., 2015). Esto es consistente con la actividad saprofítica que presenta un gran número de basidiomicetos (Agrios, 2005; Mohapatra, 2008). Mientras los basidiomicetos se encuentran principalmente en ambientes terrestres (Shearer et al., 2007), los ascomicetos son vistos como un grupo ecológico importante, y una gran variedad de ellos aparece en ambientes diversos, incluyendo los marinos (Jones y Tan, 1987; Hyde y Jones, 1988; Abdel-Wahab, 2005; Vittal y Sarma, 2006; Alias et al., 2010; Suetrong et al., 2017). Además, se considera que un amplio rango de variables, incluyendo la edad del huésped, la arquitectura, los niveles de brillo, el genotipo y la altura de la copa, entre otros, afectan la estructura de las comunidades fúngicas, así como las interacciones entre endófitos y plantas (Saikkonen, 2007). En este estudio se obtuvieron dos géneros en Botryosphaeriaceae (Lasiodiplodia y Neofusicoccum). Esto es consistente con estudios anteriores, que registran un amplio rango de hongos diversamente ecológicos en todas las áreas geográficas y climáticas del mundo (excepto en las regiones DISCUSSION This study represents the first phylogenetic approach of endophytic fungi associated with mangrove trees in an area of the Colombian Pacific coast. Nine fungal genera were identified based on the DNA sequence data for the ITS region, a gene region widely used as a molecular marker in fungal identification and taxonomic studies (Hibbett et al., 2011; Joel and Bhimba, 2013). Based on the phylogenetic analysis, the identity of the isolates were verified and revealed that the endophytes collected in this study closely grouped with species such as Ciboria aestivalis, Coprinellus radians, Cylindrobasidium torrendii, Epicoccum nigrum, Fusarium oxysporum, Lasiodiplodia theobromae, Lasiodiplodia venezuelensis, Neofusicoccum batangarum and Neurospora crassa, and two isolates that could not be confirmed to species level, Bipolaris sp. and Neofusicoccum sp., all are reported for the first time at the Colombian Pacific coast. The fungi obtained in this study belong mostly to Ascomycota, with fourteen isolates within seven genera; meanwhile, three isolates were members of Basidiomycota. Interestingly, previous studies have confirmed that the aerial and submerge parts of mangrove trees, are largely dominated by ascomycetes, while basidiomycetes have a lower proportion (Alias et al., 2010; Sun and Guo, 2012; Abdel et al., 2014; Simões et al., 2015), this is consistent with the saprophytic activity that present a large number of Basidiomycetes (Agrios, 2005; Mohapatra, 2008). While most Basidiomycetes are mostly found in terrestrial environments (Shearer et al., 2007), the Ascomycetes are considered as an important ecological group, with a wide variety occurring in diverse environments, including marine environments (Jones and Tan, 1987; Hyde and Jones, 1988; Abdel-Wahab, 2005; Vittal and Sarma, 2006; Alias et al., 2010; Suetrong et al., 2017). Moreover, a wide range of variables including host age, architecture, brightness levels, genotype, height of crown, among others, have been considered to affect fungal community structure, as well as endophyte-plant interactions (Saikkonen, 2007). Two genera in the Botryosphaeriaceae, including Lasiodiplodia and Neofusicoccum were obtained in this study, it is consistent with previous studies reporting their wide range of ecologically diverse fungi, found in all geographical and climatic areas of the world (except in polar regions) (Slippers and Wingfield, 2007; Phillips et al., 2013). For instance, reports of Botryosphaeria, Lasiodiplodia, and Marine and Coastal Research Institute 153 polares) (Slippers y Wingfield, 2007; Phillips et al., 2013). Por ejemplo, registros de Botryosphaeria, Lasiodiplodia y Neofusicoccum en manglares brasileños (De Souza et al., 2013), de Neofusicoccum en China (Xing et al., 2011) y de 14 especies pertenecientes a cuatro géneros (Botryosphaeria, Diplodia, Lasiodiplodia y Neofusicoccum) en manglares sudafricanos (Osorio et al., 2017) confirman la ubicuidad de las especies de esta familia fúngica. Neofusicoccum fue el género más comúnmente aislado, dada su habilidad de habitar una amplia variedad de especies de plantas y áreas geográficas alrededor del mundo (Slippers et al., 2005; Sakalidis et al., 2011). Esto es consistente con nuestros resultados, según los cuales Neofusicoccum fue el género más comúnmente aislado, lo que indica su amplio rango geográfico (Shetty et al., 2011). Lasiodiplodia theobromae es considerado un hongo altamente fitopatógeno (Slippers y Wingfield, 2007) que se encuentra comúnmente en regiones tropicales y subtropicales (Punithalingam, 1980; Burgess et al., 2006; Phillips et al., 2013; Mehl et al., 2017). Estudios anteriores indican que esta especie se asocia con diferentes plantas huésped, causando enfermedades y daños serios en cultivos económicamente importantes (Coutinho et al., 2017). También ha sido mencionada como el agente causal de la podredumbre, el marchitamiento y la necrosis de semillas en plantas de manglar en India (Misral, 2002), además de ser un patógeno fúngico de las platas de mangle en el delta del Niger en Nigeria (Ukoima y Amakiri 2000), posiblemente como respuesta al desbalance de los ecosistemas de manglar. Este es, por lo tanto, un tema de preocupación, teniendo en cuenta que los manglares de Buenaventura están bajo estrés constante debido a perturbaciones antropogénicas, que se observaron durante el trabajo de campo, si bien no se encontraron síntomas obvios de enfermedad. En este sentido, es muy recomendable realizar más estudios para determinar el grado de patogenicidad de esta especie en los manglares colombianos. Los análisis filogenéticos apoyaron la idea de que MW029948 está estrechamente relacionado con Lasiodiplodia venezuelensis, el cual fue aislado de ramas de Rhizophora racemosa. A la fecha, esta especie no ha sido ampliamente reportada en otras partes del mundo; L. venezuelensis es considerada como una especie rara con una distribución geográficamente limitada (Mohali, et al., 2017). Este es el primer registro de L. venezuelensis en asociación con árboles de mangle en Colombia. Los aislados MW029951, MW029952 y MW029953 fueron agrupados dentro del género Fusarium, y los análisis Neofusicoccum in mangroves of Brazil (De Souza et al., 2013), Neofusicoccum in China (Xing et al., 2011) and fourteen species belonging to four genera, Botryosphaeria, Diplodia, Lasiodiplodia, and Neofusicoccum in mangroves of South Africa (Osorio et al., 2017), confirms the ubiquity of the species belonging to this fungal family. Neofusicoccum was the most commonly isolated genus, given the ability of species of this genus to inhabit a wide variety of plant species and geographical areas worldwide (Slippers et al., 2005; Sakalidis et al., 2011). This is consistent with our results, since Neofusicoccum was the most isolated genus, indicating its wide geographical range (Shetty et al., 2011). Lasiodiplodia theobromae is considered a highly phytopathogenic fungus (Slippers and Wingfield, 2007), which is commonly found in tropical and subtropical regions (Punithalingam, 1980; Burgess et al., 2006; Phillips et al., 2013; Mehl et al., 2017). Previous reports indicate that this species is associated with different host plants, causing plan diseases and being responsible for serious damage to crops of economic importance (Coutinho et al., 2017). It has also been reported as the causal agent of rot, withering and necrosis of seeds in mangrove plants in India (Misral, 2002), and also as a fungal pathogen of mangrove plants in the Niger Delta in Nigeria (Ukoima and Amakiri 2000), possibly in response to an imbalance in the mangrove ecosystems. It is then of concern, considering that mangroves in in Buenaventura are under constant stress due to the anthropogenic disturbances observed during field work, although no obvious symptoms of disease were found. In this sense, further studies are highly recommended to determine the degree of pathogenicity of this species in Colombian mangroves. In this study, phylogenetic analyses supported that the isolate MW029948 is closely related to Lasiodiplodia venezuelensis, isolated from branches of R. racemosa. To date, this species has not been widely reported in other parts of the world; L. venezuelensis is considered as a rare species having geographically limited distribution (Mohali, et al., 2017). This is the first report of L. venezuelensis associated with mangrove trees in Colombia. The isolates MW029951, MW029952 and MW029953 grouped within the genus Fusarium, and subsequent analyses revealed their proximity to F. oxysporum, which is a widely existing species (Munkvold, 2017). This isolate was obtained from three of the four 154 Boletín de Investigaciones Marinas y Costeras • Vol. 52 (2) • 2023 (julio-diciembre) posteriores revelaron su proximidad a F. oxysporum, una especie ampliamente recurrente (Munkvold, 2017). Este aislado fue obtenido de tres de los cuatro manglares muestreados en San Pedro (L. racemosa, M. oleifera y P. rhizophorae) y correspondió a la única especie aislada de M. oleifera. El género incluye un gran número de especies ubicuas que pueden colonizar un amplio rango de hábitats (Munkvold, 2017). En ambientes de manglar, este género ha sido visto colonizando los mangles de Mangalvan (Pal y Purkayastha, 1992), las hojas y ramas de Avicennia schaueriana, L. racemosa y R. mangle en Brasil (De Souza et al., 2013) y recientemente en el microbioma de la rizosfera de manglar de Avicennia marina en el Mar Rojo, Arabia Saudita (Simões et al., 2015). Adicionalmente, se sabe que los miembros del complejo F. oxysporum causan enfermedades de marchitamiento vascular y son importantes como patógenos de podredumbre en las raíces (Munkvold, 2017). Aunque F. oxysporum incluye cepas patógenas y no patógenas, sería importante desarrollar estudios en el futuro para investigar su patogenicidad en manglares, para así estimar la posible amenaza a estos ecosistemas. Los miembros de Didymellaceae son cosmopolitas (Aveskamp et al., 2008, 2009; Chen et al., 2015a, 2015b). El aislado MW029955 reside en esta familia y guarda una estrecha relación filogenética con Epicoccum nigrum (99 / 100 %). Se sabe que diferentes especies de Epicoccum producen metabolitos secundarios bioactivos con actividad antiviral (Guo et al., 2009), antifúngica (Harwoko et al., 2019), antiinflamatoria (Gonda et al., 2016) y citotóxica (Wang et al., 2010). Entre estas especies, el complejo E. nigrum (Favaro et al., 2011) ha sido una parte importante de la investigación sobre compuestos bioactivos de hongos endófitos aislados del manglar Acanthus ilicifolius L. (Yan et al., 2019). Dicha investigación se ha nutrido de la amplia distribución geográfica y la alta variabilidad de huéspedes (Perveen et al., 2017; Ahumada et al., 2018; Rhim et al., 2019; El-Sayed et al., 2020). Nuestros análisis filogenéticos confirmaron que el aislado obtenido de R. racemosa (MW029960) corresponde a Coprinellus radians. Coprinellus es uno de los linajes de hongos coprinoides en Psathyrellaceae (Hussain et al., 2018), con aproximadamente 80 especies descritas (Kirk et al., 2008; Nagy et al., 2012; Gomes y Wartchow, 2014). Estos hongos son saprótrofos comunes en virutas de madera, láminas de hojas y estiércol de animales herbívoros (Schafer, 2010). Coprinellus radians ha sido aislada principalmente de pacientes humanos (Lu et al., 2020). Sin embargo, la información sobre su relación con árboles de manglar es aún escasa. Neurospora crassa, aislada de ramas de L. racemosa en San Pedro, también mangroves sampled in San Pedro; L. racemosa, M. oleifera and P. rhizophorae, and was the only isolated species from M. oleifera. The genus includes numerous ubiquitous species that can colonize a wide range of habitats (Munkvold, 2017). In mangrove environments the genus has been found colonizing the mangroves of Mangalvan (Pal and Purkayastha, 1992), the leaves and branches of Avicennia schaueriana, L. racemosa and R. mangle in Brazil (De Souza et al., 2013), and recently in microbiome of the mangroves rhizosphere of Avicennia marina in the Red Sea, Saudi Arabia (Simões et al., 2015). Also, members of the F. oxysporum complex are known to cause vascular withering diseases, and are important as root rot pathogens (Munkvold, 2017). Although F. oxysporum includes both pathogenic and nonpathogenic strains, it will be then important to conduct future studies to investigate its pathogenicity in mangroves, and thus to estimate a possible threat to these ecosystems. Members of the Didymellaceae are cosmopolitan (Aveskamp et al., 2008, 2009; Chen et al., 2015a, 2015b). The isolate MW029955 resides in this family, being phylogenetically closely related to Epicoccum nigrum (99 / 100 %). Different species of Epicoccum are known to produce bioactive secondary metabolites with antiviral (Guo et al., 2009), antifungals (Harwoko et al., 2019), anti- inflammatory (Gonda et al., 2016), and cytotoxic activities (Wang et al., 2010). Among these species, the E. nigrum species complex (Favaro et al., 2011), has been an important part of research on bioactive compounds of endophytic fungi isolated from the mangrove Acanthus ilicifolius L. (Yan et al., 2019). Such research is also facilitated due to the wide geographical distribution and high hosts’ variability (Perveen et al., 2017; Ahumada et al., 2018; Rhim et al., 2019; El-Sayed et al., 2020). The current phylogenetic analyses confirmed that the isolate obtained from R. racemosa (MW029960) corresponded to Coprinellus radians. Coprinellus is one of the most important lineages of Coprinoid fungi in the Psathyrellaceae (Hussain et al., 2018), with approximately 80 described species (Kirk et al., 2008; Nagy et al., 2012; Gomes and Wartchow, 2014). These fungi are common saprotrophs in wood chips, leaf blades and herbivorous manure (Schafer, 2010). Coprinellus radians has been mainly isolated from human patients (Lu et al., 2020), however, information on its relationship to mangrove trees still remains very limited. Neurospora crassa isolated from branches of L. racemosa in San Pedro, was also isolated from leaves of Rhizophora mucronata Lam (Joel and Bhimba, Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras 155 fue aislada de hojas de Rhizophora mucronata Lam (Joel y Bhimba, 2013) para determinar su actividad antimicrobiana y citotóxica. Neurospora es común en regiones tropicales y subtropicales húmedas (Turner et al., 2001), y también se encuentra en sedimentos de manglar en India (Thamizhmani y Senthilkumaran, 2012) y en el micobioma de la rizosfera de los manglares marinos Avicennia del Mar Rojo (Simões et al., 2015). Tanto C. radians como N. crassa son especies que representan una fuente promisoria de moléculas bioactivas con uso potencial en la industria farmacéutica (Demers et al., 2018). De las cuatro especies de manglar muestreadas en San Pedro, L. racemosa y R. racemosa han sido previamente registradas como huéspedes de hongos endófitos (Vázquez et al., 2000; De Souza et al., 2013; Ukoima et al., 2013), mientras que aún no hay datos disponibles para M. oleifera y P. rhizophorae. De igual manera, aún es escasa la información sobre Bipolaris sp., Ciboria aestivalis y Cylindrobasidium torrendii, las cuales se han asociado con árboles de mangle. Con respecto a M. oleifera y P. rhizophorae, la primera pertenece a un género nativo de las tierras bajas de los bosques lluviosos de Centro y Suramérica y las islas del Caribe (Bernal et al., 2015). La segunda es la única especie del género, y es nativa desde Centroamérica hasta Ecuador (Ulloa et al., 2017). Esta distribución limitada de huéspedes, en conjunto con los escasos estudios sobre hongos asociados con ecosistemas de manglar, ilustra la poca información sobre los microorganismos fúngicos asociados con estos árboles alrededor del mundo. Bipolaris (MW029956 y MW029957) incluye miembros considerados como patógenos importantes para más de 60 géneros de plantas (Sivanesan, 1984; Agrios, 2005; Manamgoda et al., 2011; Hyde et al., 2014). Los análisis filogenéticos también confirmaron que el aislado MW029950 obtenido de L. racemosa guarda una estrecha relación con C. aestivalis. Esta especie ha sido encontrada en especímenes de herbario de Cydonia oblonga Miller (Rosaceae) (Galan y Palmer, 2001). Adicionalmente, nuestros análisis soportan la idea de que los aislados MW029958 y MW029959 están estrechamente relacionados con C. torrendii, un hongo que causa una descomposición débil y limitada en la madera (Floudas et al., 2015). Estos grupos fúngicos se registraron por primera vez en ramas asintomáticas de manglares en Colombia. A pesar de la gran riqueza florística de Colombia, los estudios sobre su micobiota asociada aún son muy escasos. En este sentido, este estudio contribuye al conocimiento de la diversidad fúngica asociada a los árboles de mangle en Colombia. 2013) to determine their antimicrobial and cytotoxic activity. Neurospora is common in humid tropical and subtropical regions (Turner et al., 2001), also found in mangrove sediments in India (Thamizhmani and Senthilkumaran, 2012) and in the mycobiome of the rhizosphere of the red Sea marine Avicennia mangroves (Simões et al., 2015). Both C. radians and N. crassa are species that represent a promising source of bioactive molecules with potential use in the pharmaceutical industry (Demers et al., 2018). Of the four mangrove species sampled in San Pedro, L. racemosa and R. racemosa have previously been reported as hosts of endophytic fungi (Vázquez et al., 2000; De Souza et al., 2013; Ukoima et al., 2013), while for M. oleifera and P. rhizophorae there is still no data available. Likewise, information for Bipolaris sp., Ciboria aestivalis and Cylindrobasidium torrendii known to be associated with mangrove trees remain limited. Regarding M. oleifera and P. rhizophorae, the former belongs to a genus native to lowlands of the rainforests of South America, Central America and the Caribbean islands (Bernal et al., 2015), and the latter is the only species of the genus, being native to Central America from Honduras to Ecuador (Ulloa et al., 2017). This limited distribution of hosts, coupled with the limited fungal studies associated with mangrove ecosystems, and illustrates the lack of information on fungal microorganisms associated with these trees worldwide. Bipolaris (MW029956 and MW029957) includes members considered important pathogens of more than 60 plant genera (Sivanesan, 1984; Agrios, 2005; Manamgoda et al., 2011; Hyde et al., 2014). Phylogenetic analyses also confirmed that the isolate MW029950 obtained from L. racemosa was closely relate to C. aestivalis. This species has been found in herbarium specimens of Cydonia oblonga Miller (Rosaceae) (Galan and Palmer, 2001). In addition, current analyses supported that the isolates MW029958 and MW029959 were closely related to C. torrendii, a fungus that causes weak and limited decomposition of wood (Floudas et al., 2015). These fungal groups are reported for the first time from asymptomatic branches of mangroves in Colombia. Despite Colombia’s great floristic richness, studies in terms of its associated mycobiota remain very limited. In this sense, this study contributes to the knowledge of fungal diversity associated with mangrove trees in Colombia. 156 Bulletin of Marine and Coastal Research • Vol. 52 (2) • 2023 (July-December) AGRADECIMIENTOS Se agradece a la Autoridad Nacional de Licencias Ambientales (ANLA) por las licencias de muestreo (permiso 2019080900-1) bajo el marco nacional otorgado por la resolución No. 01789. También a los estudiantes del Programa de Biología de la Universidad del Quindío por su asistencia en campo. De igual manera, se agradece a los programas de Agroindustria y Biología de la Universidad del Quindío por suministrar los espacios físicos para desarrollar los procedimientos de laboratorio. ACKNOWLEDGMENT We acknowledge to the National Environmental Licensing Authority (ANLA) for sampling permits (Permission: 2019080900-1) under the National Framework granted by resolution No. 01789., as well as the students from the Biology Program, Universidad del Quindío for assistance in the field. Likewise, thanks to the Agro-Industry and Biology Departments of the Universidad del Quindío for providing the physical spaces to carry out the laboratory procedures. BIBLIOGRAFÍA / LITERATURE CITED Abdel, M.A., M.S. Hodhod, A.H., Bahkali and E.B. Jones. 2014. Marine fungi of Saudi Arabia. Bot. Mar, 57: 323–335. https://doi.org/10.1515/bot-2014-0010 Abdel-Wahab, M.A. 2005. Diversity of marine fungi from Egyptian Red Sea mangroves. Bot. Mar, 48: 348–355. https://doi.org/10.1515/BOT.2005.047 Agrios, G.N. 2005. Plant pathology. 5th ed. Elsevier/Academic Press. London. 948 p. Ahumada, R., V. Novoa and J. Becerra. 2018. Morphological response to salinity, temperature, and pH changes by marine fungus Epicoccum nigrum. Environ. Monit. Assess., 191. https://doi.org/10.1007/s10661-018-7166-5 Akaike, H. 1974. A new look at the statistical model identification. IEEE Trans. Autom. Control, 19: 716–723. http://dx.doi.org/10.1109/TAC.1974.1100705 Alias, S.A., N. Zainuddin and E.B. Jones. 2010. 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