Helena Hyvärinen (toim.) Kasviperäiset biomolekyylit – glukosinolaatit Kirjallisuuskatsaus Helena Hyvärinen (toim.) Kasviperäiset biomolekyylit – glukosinolaatit Kirjallisuuskatsaus Maatalouden tutkimuskeskus http://www.mtt.fi ISBN 951-729-593-6 ISSN 1238-9935 Copyright Maatalouden tutkimuskeskus Kirjoittajat Julkaisija Maatalouden tutkimuskeskus, 31600 Jokioinen Jakelu ja myynti Maatalouden tutkimuskeskus, tietopalveluyksikkö, 31600 Jokioinen Puhelin (03) 4188 2327, telekopio (03) 4188 2339 sähköposti julkaisut@mtt.fi Painatus Jyväskylän yliopistopaino 2001 Sisäsivujen painopaperille on myönnetty pohjoismainen Joutsenmerkki. Kansimateriaali on 75-prosenttisesti uusiokuitua. Hyvärinen, H.1) (toim.) 2001. Kasviperäiset biomolekyylit – glukosinolaatit. Kirjallisuuskatsaus. Maatalouden tutkimuskeskuksen julkaisuja. Sarja A 90. Jokioinen: Maatalouden tutkimuskeskus. 72 p. ISSN 1238-9935, ISBN 951-729-593-6. 1) Maatalouden tutkimuskeskus, Elintarvikkeiden tutkimus, Elintarvikekemia- ja teknologia, 31600 Jokioinen, helena.hyvarinen@mtt.fi Tiivistelmä Avainsanat: ristikukkaiset kasvit, kasvinviljely, kasvu, biosynteesi, kemiallinen koostumus, biomolekyylit, glukosinolaatit, torjuntamenetelmät, elintarviketuotanto, terveysvaikutukset, analyysimenetelmät Glukosinolaatit ovat ristikukkaisilla kas- veilla esiintyviä rikkiä sisältäviä yhdisteitä. Entsyymit hajottavat niitä ja hajoamistuot- teet ovat fysiologisesti aktiivisia. Glu- kosinolaatit saattavat vaikuttaa mm. kasvi- en kestävyyteen, siementen itämiseen, kas- vitautien ehkäisyyn sekä kasvien makuun. Yhdisteiden käyttäytyminen elimistössä sekä mahdolliset terveysvaikutukset ovat myös huonosti tunnettuja. Aikaisemmasta käsityksestä poiketen glukosinolaatit kasvissa esiintyessään saat- tavat vaikuttaa kasvin kehittymiseen, eri- tyisesti poikkeavissa tilanteissa. Niiden esiintymiseen vaikuttaa sellaisia eläviä ja elottomia (bioottiset ja abioottiset) tekijöi- tä, joista ainakin osaa voidaan jo nyt huomi- oida viljelytekniikassa. Tämän lisäksi erilai- set ärsykkeet saattavat kiihdyttää glu- kosinolaattien muodostumista. Sellaisen viljelytekniikan kehittäminen, joka suosii tarvittaessa glukosinolaattien muodostu- mista edellyttää yhdisteiden biosynteesin ja hydrolyysin ymmärtämistä. Glukosinolaatteja pidetään kasvien puolustuskemikaaleina. Ristikukkaiskasvi- en murskatut solut, lahoavat kasvijätteet ja kasveista eristettyjen glukosinolaattien ha- joamistuotteet estävät muiden kasvien sie- menten itämistä ja taimien kasvua. Ne myös rajoittavat maassa elävien kasvintu- hoojien lisääntymistä. Glukosinolaattien hajoamistuotteet vaikuttavat ristikukkais- kasvien ja niitä syövien hyönteisten väliseen kemialliseen viestintään. Ristikukkaiskas- vien avulla uskotaan voitavan vähentää ke- miallisen torjunnan tarvetta viljelykierros- sa. Elintarviketeknologiset prosessit ja va- rastointi vaikuttavat siihen, miten glu- kosinolaatit hajoavat ja paljonko hajoamis- tuotteita on elintarvikkeissa. Hajoamis- tuotteista erityisesti indoleilla ja isotiosy- anaateilla on todettu positiivisia terveysvai- kutuksia. Kasvien glukosinolaatit määritetään monivaiheisen esikäsittelyn jälkeen. Mene- telmänä käytetään pääasiassa korkean ero- tuskyvyn nestekromatografia. Glukosino- laattien hajoamistuotteiden analysoinnissa käytetään puolestaan kaasu- tai nestekro- matografiaa. Tähän kirjallisuuskatsaukseen on koot- tu uusinta tutkimustietoa glukosinolaateis- ta, niiden muodostumisesta ja hajoamisesta, biokemiasta, käytöstä kasvintuhoojien tor- juntaan, käsittelyjen vaikutuksista, terveys- vaikutuksista sekä analysoinnista. 3 Alkusanat Kasviksilla, marjoilla ja viljatuotteilla on todettu olevan edullinen vaikutus ihmisen terveyteen. Viimeaikaisen tutkimuksen valossa erityisesti kasviperäiset biomole- kyylit suojaavat esim. sydän- ja ve- risuonitaudeilta ja syövältä. Tällaisia ovat fenoliset yhdisteet (flavonoidit ja lig- naanit) sekä glukosinolaatit. Kasvin vegetatiivista kasvua rajoitta- vien pohjoisten kasvuolojen vaikutuksia biomolekyylien määrään ja laatuun ei tun- neta, mutta viitteitä esimerkiksi pitkän päivän edullisista vaikutuksista on kuiten- kin olemassa. Myöskään näiden biomole- kyylien käyttäytymistä elintarvikeketjus- sa ei tunneta. Viime vuosina on kiinnostuttu maail- manlaajuisesti siitä, miten kasvikunnasta peräisin olevia, luonnollisia biomolekyyle- jä voitaisiin hyödyntää terveysvaikutteis- ten eli funktionaalisten elintarvikkeiden aineosina. Tämä edellyttää kuitenkin tie- teellisen tutkimustiedon syventämistä biomolekyylien muodostumisesta, siihen vaikuttavista tekijöistä ja viime kädessä biomolekyylien vaikutuksista ihmisen eli- mistössä. Maatalouden tutkimuskeskus (MTT) aloitti vuonna 1998 tutkimusohjelman ”Kasviperäiset biomolekyylit elintarvike- tuotannossa”. Ohjelman tavoitteena oli kehittää suomalaiseen päivittäiseen pe- rusruokavalioon uusia, kasvipohjaisia funktionaalisia elintarvikkeita, joilla voisi olla edullista vaikutusta kansantervey- teen. Ohjelmassa tutkitaan kasviperäisten biomolekyylien koko elinkaarta pellosta pöytään. Kasvintuotannon tutkimus selvittää, kuinka viljelytekniikan avulla voidaan muuttaa abioottisia ja bioottisia kasvute- kijöitä terveysvaikutteisia biomolekyylejä suosivaksi. Kasvinsuojelu pyrkii osoitta- maan, että terveysvaikutteisilla biomole- kyyleillä on vaikutusta myös kasvien puo- lustuksessa. Lisäksi tutkitaan biomole- kyylien käyttäytymistä elintarvikeproses- seissa. Näin prosesseja pyritään optimoi- maan, jotta biomolekyylit säilyvät ja sa- malla kehitetään mallituotteita kliinisiin tutkimuksiin. Helsingin yliopistossa teh- tävässä osaprojektissa haetaan mittareita, joilla voidaan havainnoida biomolekyylien vaikutuksia ihmisessä. Tutkittaviksi kasveiksi valittiin Suo- messa viljeltäviä, hyviksi biomolekyylien lähteiksi tiedettyjä kasveja ja marjoja tai luonnonmarjoja: kaalit (glukosinolaatit), mustaherukka, mansikka, puolukka ja tattari (flavonoidit) sekä pellava (lig- naanit, oligosakkaridit). Ohjelmaa rahoit- taa MTT:n lisäksi maa- ja metsätalousmi- nisteriön elintarvikeklusterin tutkimus- ohjelma. Seurantaryhmässä on edustettu- na myös kotimaisia elintarvikeyrityksiä. Tämä glukosinolaatteja käsittelevä kirjallisuuskatsaus koottiin tutkimusoh- jelman taustamateriaaliksi. Myöhemmin julkaistaan myös fenolisia yhdisteitä ja ter- peenejä koskevat kirjallisuusselvitykset. Hannu Korhonen Professori Ohjelman vastaava johtaja 4 Sisällys Tiivistelmä . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Alkusanat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1 Yleistä glukosinolaateista, Keskitalo, M. & Hyvärinen, H. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Kirjallisuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 Glukosinolaattien biokemia ja esiintymiseen vaikuttavat kasvutekijät, Keskitalo, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.1 Glukosinolaattien merkitys kasvin kasvussa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.2 Glukosinolaattien muodostuminen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.2.1 Biosynteesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.2.2 Sijainti kasvissa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2.3 Biosynteesin geneettinen säätely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.3 Glukosinolaattien hajoaminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.1 Hydrolyysi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3.2 Hajottajaentsyymit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.3.3 Hajotuksen geneettinen säätely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.4 Glukosinolaattien esiintymiseen vaikuttavat tekijät . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.1 Abioottiset tekijät . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.1.1 Valo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.4.1.2 Lämpötila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.4.1.3 Ilman dioksidit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.4.1.4 Maalaji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.4.1.5 Kuivuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.4.1.6 Ravinteet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.4.1.7 Ulkoinen kemikaalikäsittely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.4.2 Bioottiset tekijät . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.4.2.1 Kasvilaji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.4.2.2 Kasvilajike . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.4.2.3 Kehitysvaihe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.4.2.4 Kasvinosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.4.2.5 Satokomponentit. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.5 Glukosinolaattien modifiointi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Kirjallisuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3 Glukosinolaatit ja niiden hajoamistuotteet kasvinsuojelussa, Jaakkola, S. . . . . . . . . 32 3.1 Glukosinolaattien hajoamistuotteet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.2 Isotiosyanaattien ominaisuudet ja tuotanto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.3 Hajoamistuotteet maassa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.4 Glukosinolaattien vaikutukset . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.4.1 Rikka- ja viljelykasvit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.4.2 Taudinaiheuttajat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 5 3.4.3 Ankeroiset ja hyönteiset. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.4.4 Ristikukkaisia kasveja syövät eläimet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.4.4.1 Isäntäkasvin tunnistaminen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.4.4.2 Ristikukkaisille sopeutumattomien kasvinsyöjien syönti . . 47 3.4.4.3 Ristikukkaisilla kasveilla elävien hyönteisten syönti . . . . . . 48 3.4.4.4 Ristikukkaisilla kasveilla elävien hyönteisten muninta . . . . 48 3.4.5 Glukosinolaatit ja indusoitu puolustus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Kirjallisuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4 Glukosinolaatit ja niiden hajoamistuotteet elintarvikkeissa, Ryhänen, E-L., Tolonen, M. & Taipale, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 4.1 Glukosinolaattien pitoisuudet kaalikasveissa (Brassica oleracea) . . . . . . . . . . 59 4.2 Glukosinolaattien sekä niiden hajoamistuotteiden vaikutus elintarvikkeiden makuun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.3 Varastoinnin ja prosessoinnin vaikutus glukosinolaatteihin ja niiden hajoamistuotteisiin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.3.1 Varastointi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.3.2 Pilkkominen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.3.3 Keittäminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 4.3.4 Pakastaminen ja kuivaaminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.3.5 Hapattaminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.4 Glukosinolaattien ja niiden hajoamistuotteiden vaikutukset terveyteen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.4.1 Antikarsinogeeninen vaikutus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.4.2 Haitalliset vaikutukset. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 Kirjallisuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 5 Glukosinolaattien ja niiden hajoamistuotteiden määrittäminen, Pihlava, J-M. . . . . 68 5.1 Johdanto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 5.2 Glukosinolaatit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 5.2.1 Kasvinäytteen esikäsittely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 5.2.2 Öljykasvien siementen esikäsittely . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.2.3 Glukosinolaattien eristäminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.2.4 Glukosinolaattien desulfonointi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.2.5 Yhdisteiden tunnistaminen ja kvantitointi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.2.5.1 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia . . . . . . . . . . . . . 69 5.2.5.2 Kaasukromatografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.3 Glukosinolaattien hajoamistuotteet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 5.3.1 Hajoamistuotteiden eristäminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 5.3.2 Hajoamistuotteiden analysointi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 5.3.2.1 Kaasukromatografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 5.3.2.2 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia . . . . . . . . . . . . . 70 5.3.2.3 Spektrofotometria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Kirjallisuus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 6 1 Yleistä glukosinolaateista Marjo Keskitalo1) & Helena Hyvärinen2) 1) Maatalouden tutkimuskeskus, Kasvintuotannon tutkimus, Peltokasvit ja maaperä, 31600 Jokioinen, marjo.keskitalo@mtt.fi 2) Maatalouden tutkimuskeskus, Elintarvikkeiden tutkimus, Elintarvikekemia ja -tekniikka, 31600 Jokioinen, helena.hyvarinen@mtt.fi Glukosinolaatit ovat kasveissa esiintyviä se- kundäärisiä aineenvaihduntatuotteita. Ne muodostuvat aminohapoista, ovat vesi- liukoisia ja haihtumattomia. Ristikukkaisis- sa kasveissa, kuten rypsissä ja rapsissa, ne ovat tyypillisiä rikkiä sisältäviä glykosideja. Glukosinolaatteja ja niitä hajottavia my- rosinaasi-entsyymejä on todettu mm. Bras- sicaceae-, Resedaceae-, Tovariaceae-, Tropaeola- ceae-heimoihin kuuluvissa kasveissa (Rod- man 1991). Glukosinolaattien yleinen ra- kenne on esitetty kuvassa 1. Erilaisia glukosinolaatteja on tunnistet- tu jo yli 100. Glukosinolaattien lukumäärä kasveissa vaihtelee, mutta yleensä samasta kasvista on tunnistettu useampia kuin yh- dentyyppisiä yhdisteitä. Kaalien glukosino- laattikoostumus on melko yhtenäinen, sillä 20 kasvilajista tunnistettiin vain 15 erilaista glukosinolaattia (Cole 1997). Sen sijaan yh- destä lituruohosta analysoitiin jopa 23 eri- laista glukosinolaattia (Haughn 1991). Glukosinolaatit hajoavat kasveissa my- rosinaasi-entsyymin vaikutuksesta yhdis- teiksi, joista mm. isotiosyanaatit ovat haih- tuvia (Doughty et al. 1996). Glukosinolaat- tien pitoisuus kasvissa on yleensä hyvin pie- ni (1–250 µmol g-1) yhdisteestä ja lajista riippuen, mutta voi kuitenkin olla jopa 10 % kasvin kuivapainosta (Cole 1997). Glukosinolaatit muodostuvat kasvin so- luissa monivaiheisen reaktiosarjan tulokse- na. Yhdisteiden merkitys kasville ei ole täy- sin selvä, mutta aikaisemmasta käsityksestä poiketen, glukosinolaatit saattavat kuiten- kin vaikuttaa kasvin kasvuun. Ne ilmeisesti myös osallistuvat rikkitasapainon ylläpitä- miseen, millä saattaa olla merkitystä kasvin selviytymisessä erilaisissa normaalioloista poikkeavissa tilanteissa. Yhdisteiden bioke- miasta sekä niiden esiintymiseen vaikutta- vista tekijöistä kerrotaan luvussa 2. Kasvin ja sitä ympäröivän ekosysteemin vuorovai- kutuksessa glukosinolaateilla sekä niiden hajoamistuotteilla tiedetään olevan tärkeä rooli. Erityisesti glukosinolaattien hajo- amistuotteiden, kuten isotiosyanaattien, on todettu karkottavan hyönteisiä, ehkäisevän kasvitauteja sekä muiden kasvien kasvua, mistä kerrotaan luvussa 3. Glukosinolaattien on aikaisemmin to- dettu olevan yksinomaan haitallisia läm- minverisille eläimille, mutta viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että eräät niistä saattavat ehkäistä tiettyjen kansansairauk- sien syntymistä. Glukosinolaatit ovatkin 7 Kuva 1. Glukosinolaatin rakennekaava. R = alkyyli, alkenyyli, aryyli, aryylialkyyli, aryylitio- alkyyli, β-hydroksialkyyli tai indolyylimetyyli (Verhoeven et al. 1997). R-C-S-β-D-Glu || N-OSO3 - kiinnostavia kasvien sekundäärisiä aineen- vaihduntatuotteita siksi, että niiden entsy- maattisesti vapautuvat hajoamistuotteet ovat ilmeisesti fysiologisesti aktiivisia yhdis- teitä. Sen lisäksi ne esim. antavat kaalikas- veille tyypillisen pistävän maun (McGregor et al. 1983). Näiden takia on tärkeää tietää, miten elintarvikkeiden valmistusprosessit vaikuttavat glukosinolaattien säilymiseen. Tästä kerrotaan luvussa 4. Kasvisten terveyttä edistävä vaikutus saattaa johtua eri komponenttien vuorovai- kutuksesta. Sen takia on tärkeää ymmärtää kasvi kokonaisuutena sekä myös muiden molekyylien muodostuminen (Schreiner et al. 1998, Kushad et al. 1999), vaikka tässä kirjoituksessa keskitytäänkin pelkästään glukosinolaatteihin. Glukosinolaatit ovat negatiivisesti va- rautuneita yhdisteitä, jotka esiintyvät kas- veissa yleisimmin kaliumsuoloina. Ne voi- vat myös esiintyä sinapiinihapon koliinies- tereinä (McGregor et al. 1983). Glu- kosinolaatti muodostuu sivuketjusta (R) ja tiohydroksamaatti-O-sulfonaattista, jossa sokeriosa on kiinnittynyt β-sidoksen avulla rikkiatomiin (Kuva 1). Taulukossa 1 on esi- tetty eräiden glukosinolaattien triviaalini- met sekä sivuketjut (R). Glukosinolaattien sokeriosana on lähes 8 Triviaalinimi Sivuketju glukoalyssiini 5-metyylisulfinyylipentyyli glukoberteroiini 4-pentenyyli glukobrassikanapiini 5-metyylitiopentyyli glukoerusiini * 4-metyylitiobutyyli glukoerysoliini 4-metyylisulfonyylibutyyli glukoiberiini 3-metyylisulfinyylipropyyli glukoiberveriini * 3-metyylitiopropyyli glukokappariini metyyli glukokeiroliini 3-metyylisulfonyylipropyyli glukokokleariini glukojiabutiini 2-metyylibutyyli glukolepidiini etyyli glukonapiini * 3-butenyyli glukonapoleiferiini 2-hydroksi-4-pentenyyli glukonapoliferiini 2-hydroksi-4-pentenyyli glukoputranjiviini iso propyyli glukorafaniini * 4-metyylisulfininyylibutyyli progoitriini ** epiprogoitriini (R)-2-hydroksi-3-butenyyli sinigriini * 2-propenyyliallyyli glukonasturtiini * 2-fenyylietyyli glukotropaeoliini bentsyyli sinalbiini p-hydroksibentsyyli 4-hydoksiglukobrassikiini * 4-hydroksi-3-indolyylimetyyli 4-metoksiglukobrassikiini * 4-metoksi-3-indolyylimetyyli glukobrassikiini * 1-metoksi-3-indolyylimetyyli goitriini 5-vinyylioksazolidiinitioni neoglukobrassikiini * N-metoksi-3-indolyylimetyyli 1-metoksi-3-indolyylimetyyli * = esiintyvät yleisesti kaalikasveissa (Brassica) ** = isomeerejä Tiedot koostettu seuraavista lähteistä: VanEtten et al. 1976, Fenwick et al. 1983, Sones et al. 1984 ja Shahidi et al. 1997. Taulukko 1. Glukosinolaattien triviaalinimiä, sivuketju (R-ryhmä). poikkeuksetta glukoosi, mutta se voi olla myös jokin muu sokeri. Sivuketjunsa perus- teella glukosinolaatit voidaan jakaa alifaat- tisiin, aromaattisiin ja heterosyklisiin eli in- dolyyliglukosinolaatteihin. Kasviperäisten raaka-aineiden ja tuotteiden glukosinolaat- tien analyysimenetelmistä kerrotaan luvus- sa 5. Kirjallisuus Cole, R.A. 1997. The relative importance of glucosinolates and amino acids to the development of two aphid pests Brevicoryne brassicae and Myzus persicae on wild and cultivated brassica spe- cies. Entomologia Experimentalis et Applicata 85: 121–133. Doughty, K.J., Blight, M.M., Bock, C.H., Fieldsend, J.K. & Pickett, J.A. 1996. Release of isothiocyanates and other volatiles from Brassica rapa during infection by Alternaria brassicae. Phytochemistry 43: 371–374. Fenwick, G.R., Heaney, R.H. & Mullin, W.J. 1983. Glucosinolates and their breakdown products in food and food plants. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition 18 (2): 123–201. Haughn, G.W., Davin, L., Giblin, M. & Underhill, E.W. 1991. Biochemical genetics of plant second- ary metabolites in Arabidopsis thaliana. Plant Phys- iology 97: 217–226. Kushad, M.M., Brown, A.F., Kurilich, A.C., Juvik, J.A., Klein, B.A., Wallig, M.A. & Jeffery, E.H. 1999. Variation of glucosinolates in vegetable crops of Brassica oleracea. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47: 1541–1548. McCregor, D., Mullin, W. & Fenwick, G. 1983. An- alytical methodology for determining glucosinolate composition and content. Journal of Association of Official Analytical Chemists 66: 825–849. Rodman, J.E. 1991. A taxonomic analysis of glucosinolate-producing plants, part 1: phenetics. Systematic Botany 16: 598–618. Schreiner, M., von, Schonhof, I. & Krumbein, A. 1998. Neue Dimension der Produktqualität-Bioakti- ve Substanzen im Gemüse. Gemüse 34: 80–84. Shahidi, F. 1997. Benefical health effects and drawbacks of antinutrients and phytochemicals in foods. In: Shahidi, F. (ed.). Antinutrients and phytochemicals in food. Washington: American Chemical Society. p. 1–9. ISBN 0-8412-3498-1. Sones, K., Heaney, R.K. & Fenwick, G.R. 1984. An esitimate of the mean daily intake of gluco- sinolates from cruciferous vegetables in the UK. Journal of the Science of Food and Agriculture. 35: 712–720. VanEtten, C.H., Daxenbichler, M.E., Williams, P.H. & Kwolek, W.F. 1976. Glucosinolates and de- rived products in cruciferous vegetables. Analysis of the ediple part from twenty-two varietes of cab- bage. Journal of Agricultural and Food Chemistry 24: 452–455. Verhoeven, D.T.H., Verhagen, H., Goldbohm, R.A., van den Brant, P.A. & Poppel, G. 1997. A re- view of mechanisms underlying anticarcinogenity by brassica vegetables. Chemico-Biological Inter- actions 103: 79–129. 9 2 Glukosinolaattien biokemia ja esiintymiseen vaikuttavat kasvutekijät Marjo Keskitalo Maatalouden tutkimuskeskus, Kasvintuotannon tutkimus, Peltokasvit ja maaperä, 31600 Jokioinen, marjo.keskitalo@mtt.fi Glukosinolaatit, joita tunnetaan tällä het- kellä yli 100, ovat rikki- ja typpi-pitoisia kasvin sekundäärisiä yhdisteitä, jotka muo- dostuvat aminohaposta ja sokerista. Erityisesti ristikukkaisissa kasveissa esiin- tyviä glukosinolaattien oletettiin aikaisem- min olevan pelkästään ylijäämätuotteita, joilla ei olisi merkitystä kasvin kehityksessä. Vieläkään glukosinolaattien merkitystä ei täysin tunneta, mutta niiden on havaittu osallistuvan moniin kasville tärkeisiin ta- pahtumiin. Näitä ovat mm rikkitasapainon säätely, itäminen ja kasvien puolustus. Sen lisäksi glukosinolaatit ovat tunnetun kasvi- hormonin, IAA:n esiasteita. Aikaisemmasta käsityksestä poiketen eräiden glukosinolaattien on todettu vai- kuttavan myös ihmisen terveyteen positiivi- sesti. Sen lisäksi glukosinolaateilla on kas- vinsuojelullista merkitystä. Glukosinolaattien hyödyllisten tekijöi- den takia on tärkeää tietää, miten eri abi- oottiset ja bioottiset kasvutekijät vaikutta- vat niiden muodostumiseen, jotta yhdistei- den pitoisuuteen voitaisiin viljelyteknisesti vaikuttaa. Abioottisista tekijöistä tärkeim- piä ovat valo, lämpötila, kuivuus, maalaji, ravinteet, ilman dioksidit ja ulkoiset kemi- kaalikäsittelyt. Bioottisia tekijöitä ovat puolestaan kasvilaji, kasvilajike, kehitysvai- he, kasvinosa ja muiden satokomponenttien vaikutus. Glukosinolaattien biosynteesi tapahtuu solun mikrosomeissa tai muiden soluor- ganellien kalvorakenteiden läheisyydessä. Glukosinolaatit esiintyvät soluissa ilmeises- ti varastoproteiineihin liittyneinä tai nk. myrosiinisoluissa, joissa glukosinolaattien lisäksi esiintyy myös niitä hajottavia my- rosinaasientsyymejä. Rypsi ja rapsi ovat esimerkkejä siitä, mi- ten klassisen jalostuksen avulla on voitu vä- hentää sekundääriaineina esiintyvien glu- kosinolaattien pitoisuuksia. Glukosinolaat- tien biosynteesin ja myrosinaasien geneetti- nen säätely ei ole vielä selvä, vaikka useita säätelyyn osallistuvia geenejä onkin voitu tunnistaa. On kuitenkin todennäköistä, että geeni- ja biotekniset menetelmät mah- dollistavat jo lähitulevaisuudessa hyödyllis- ten glukosinolaattien modifioinnin. Avainsanat: ristikukkaiset kasvit, kasvinviljely, sekundäärinen aineenvaihdunta, glukosinolaatit, muodostuminen, biosynteesi, myrosinaasit, hajoaminen, hydrolyysi, biokemia, geneettinen säätely, solu, abioottiset ja bioottiset kasvutekijät 10 2.1 Glukosinolaattien merkitys kasvin kasvussa Kasvien sekundääristen aineenvaihdunta- tuotteiden, kuten glukosinolaattien oletet- tiin aikaisemmin olevan pelkästään ylijää- mätuotteita, joilla ei olisi merkitystä kasvin kehityksessä. Vieläkään glukosinolaattien merkitystä ei täysin tunneta, vaikka niiden on havaittu osallistuvan moniin kasville tär- keisiin tapahtumiin. Eräät glukosinolaatit ja niiden johdan- naiset, kuten IAA (indolyyli-3-etikkahap- po), ovat kasvihormoneja, jotka edistävät auksiinien tapaan mm. Pituuskasvua. Glu- kosinolaatit toimivat kasvissa ilmeisesti rik- kitasapainon ylläpitäjänä tai varastoina. Ne osallistuvat myös kasvin typpiaineenvaih- duntaan, ja saattavat siten vaikuttaa kasvin kykyyn selviytyä erilaisista stresseistä. Rikinpuutteessa glukosinolaattien on ha- vaittu hajoavan, jolloin vapautuva rikki käytetään muiden aineenvaihduntatuottei- den, kuten aminohappojen valmistukseen. Glukosinolaattien sisältämät molekyylit saattavat olla erityisen tärkeitä kasvin sel- viytymisessä poikkeavissa lämpötiloissa, kuten talvehtimisen tai kuumuusstressin ai- kana (Ludwig-Müller et al. 2000). Glu- kosinolaattien, myrosinaasin ja niiden hyd- rolyysiin vaikuttavan askorbiinihapolla on ilmeisesti tärkeä rooli siemenen itämisessä, jolloin komponenttien pitoisuuksien on ha- vaittu muuttuvan selvästi. Lukuisat glu- kosinolaatit sekä niitä hajoittavien my- rosinaasi-entsyymien eri muodot viittaavat siihen, että glukosinolaatit tai niiden hajo- amistuotteet ovat tärkeitä tietyissä kasvin kehitysvaiheissa (Kelly et al. 1998). Glukosinolaateista, kuten muistakin se- kundäärisistä aineenvaihduntatuotteista, on ollut ihmiselle apua hänen jaotellessaan kasveja taksonomisesti eri ryhmiin (Bennet et al. 1997a). Kasvin ja sitä ympäröivän ekosysteemin vuorovaikutuksessa glukosinolaateilla sekä niiden hajoamistuotteilla tiedetään olevan tärkeä rooli. Hajoamistuotteista erityisesti isotiosyanaattien on todettu karkottavan hyönteisiä sekä ehkäisevän kasvitauteja. Niiden avulla kasvi pystyy puolustautu- maan vaaratekijöitä vastaan. Toisaalta iso- tiosyanaatit voivat houkutella tai muutoin muuttaa hyönteisten käyttäytymistä kasvin läheisyydessä. Glukosinolaattien kitkerä maku karkottaa kasvissyöjiä, millä on saat- tanut olla evoluutiossa merkittävä rooli kas- vin säilymisen ja leviämisen kannalta. 2.2 Glukosinolaattien muodostuminen 2.2.1 Biosynteesi Glukosinolaatit ovat rikki- ja typpipitoisia yhdisteitä, jotka koostuvat sokeriosasta (glykonista) sekä sivuketjusta (aglykoni). Sivuketjun muodostamat aminohapot ovat pääasiassa samoja, joita käytetään valkuais- aineiden synteesiin (α-aminohapot), mutta myös muita aminohappoja tavataan glu- kosinolaattien sivuketjuissa. Aromaattisten aminohappojen muodostumista ja siirty- mistä glukosinolaattien sekä fenolisten yh- disteiden synteesiin on havainnollistettu kuvassa 2. Glukosinolaatit jaetaan sivuketjussa olevan aminohapon mukaan kolmeen ryh- mään: L-metioniinistä muodostuneet ali- faattiset- eli alkenyyliglukosinolaatit, L-fe- nylalaniinista, L-tyrosiinistä (ja mahdolli- sesti L-fenyylietyylistä) muodostuneet aro- maattiset glukosinolaatit, sekä L-trypto- faanista muodostuneet indolyyliglukosi- nolaatit (Sørensen 1990). Alifaattiset glu- kosinolaatit voidaan edelleen jakaa propyy- li-, butyyli- ja pentyyliglukosinolaateiksi (Magrath et al. 1993). L-metioniinistä joh- detut alifaattiset glukosinolaatit ovat ylei- simpiä juuri ristikukkaisissa (Giamoustaris & Mithen 1996). Glukosinolaattien biosynteesin tär- keimmät vaiheet ovat sivuketjun hiilirun- gon pidentyminen, N-hydroksiaminohap- pojen muodostuminen, aldoksiimien muo- dostuminen vastaavista aminohaposta, glu- koosin ja rikin liittyminen sekä sivuketjun muotoutuminen (Bennett et al. 1995, Ben- nett et al. 1996, Halkier & Du 1997). Näi- 11 den päätapahtumien aikana glukosinolaat- tiin päättyvä aminohappo käy läpi eri vai- heita, joista tunnetaan ainakin seuraavat vä- lituotteet: N-hydroksiaminohapot, aldok- siimit, tiohydroksimaatit sekä desulfoglu- kosinolaatit (Kuva 3) (Haughn et al. 1991, Magrath et al. 1993). Vielä biosynteesin lo- pussa muotoutuvat ainakin osa metioniini-, tryptofaani- ja tyrosiinilähtöisten glu- kosinolaattien sivuketjuista (Halkier & Du 1997). Glukosinolaattien biosynteesin ensim- mäiseen vaiheeseen, aldoksiimien muodos- tumiseen aminohapoista, osallistuu kol- menlaisia entsyymejä. Happea vaativista mono-oksygenaasityyppisistä entsyymeistä toinen, sytokromi P450, toimii tyrosiini- ja fenyylialaniinilähtöisten aromaattisten glu- kosinolaattien tuotannossa. Toinen entsyy- mi, flaviiniin sitoutunut mono- oksygenaasi (FMO), sitoo fenyylialaniinista ja me- tioniinista muodostuneita aminohappoja aromaattisiksi ja alifaattisiksi glukosinolaa- teiksi (Halkier & Du 1997). Kolmas entsyy- 12 GLUKOOSI Fosfoenolipyryvaatti Erytroosi 4-fosfaatti Glykolyysi Pentoosifosfaattireitti + Korismiinihappo Sikimihapporeitti TyrosiiniTryptofaani Fenyylialaniini Aromaattiset glukosinolaatit Indolyyli eli epäsäännölliset glukosinolaatit Aromaattiset glukosinolaatit Fenoliset yhdisteet Kuva 2. Yksinkertaistettu kaavio aromaattisten aminohappojen siirtymisestä glukosinolaattien ja fenolisten yhdisteiden biosynteesiin. 13 L-tyrosiini L-fenyylialaniini L-metioniini L-tryptofaani Vastaavista aminohapoista muodostuneet hydroksiaminohapot Vastaavista aminohapoista muodostuneet aldoksiimit Sivuketjun piteneminen Hfen Hmet Dmet Thmet Syt P450 Syt P450 FMO FMO FMO FMO Peroksidaasit Rikkiä sisältävä välituote rikin liittäminen L-kysteiinistä Tiohydroksimaatti Desulfoglukosinolaatti UDP-glukoosi UDP PAPS PAP Primääriset glukosinolaatit Sivuketjun muokkaus Aromaattiset, alkenyyli- ja indolyyli glukosinolaatit Syanogeeniset glykosidit IAA-kasvihormoni Pyruvaatti + NH3 Kuva 3. Yksinkertaistettu malli aromaattisten, alifaattisten/alkenyyli- ja indolyyliglukosinolaattien biosynteeseistä. Osa lähtöaineina toimivien aminohappojen sivuketjuista pitenee ennen varsi- naisen glukosinolaatti-synteesin alkamista, jonka seurauksena muodostuvat homologiset aminohapot (Hfen = homofenyylialaniini, Hmet = homometioniini, Dhmet = dihomometioniini, Thmet = trihomometioniini). Aldoksiimeja tuottavat lähtöainespesifiset entsyymit: Syt P450 = sy- tokromi-P450-mono-oksygenaasi, FMO = flaviiniin liittynyt mono-oksygenaasi sekä peroksidaa- sit Hydroksiaminohapot, aldoksiimit, tiohydroksimaatit ja desulfoglukosinolaatit ovat glu- kosinolaatti-synteesin välituotteita. Glukoosin liittäminen desulfoglukosinolaattiin tapahtuu UDPG-tiohydroksimaatti-glukosyylitransferaasin avulla. Sen jälkeen tapahtuu sulfaatin liittämi- nen PAPS:desulfoglukosinolaatti-sulfotransferaasin avulla. Osa primääristen glukosinolaattien sivuketjuista muokataan ennen lopullisten glukosinolaattien muodostumista. IAA = indolyy- li-3-etikkahappo, UDPG = uridiinidifosfaatti-glukoosi, PAPS = 3’-fosfoadenosiini-5’-fosfosulfaatti. (Du et al. 1995, Halkier & Du 1996, Bennet et al. 1997a, Bennet et al. 1997b). NADPH+ O2 CO2 mityyppi on peroksidaasi, jolla tuotetaan tryptofaanista indolyyliglukosino- laatteja (Wallsgrove et al. 1995, Bennett et al. 1997a, Halkier & Du 1997). FMO:n on to- dettu toimivan kaaleissa, isovesikrassissa ja retiisissä. Sytokromi P450-tyyppinen mono-oksygenaasi-entsyymi on yleinen keltasinapissa ja köynnöskrassissa (Du et al. 1995, Bennett et al. 1996, Du & Halkier 1996), eikä entsyymiä ole tavattu muissa kasveissa (Bennet et al. 1997b). Keltasina- pissa toimii P450:n lisäksi myös FMO ja pe- roksidaasi (Bennett et al. 1997b). Biosynteesiä säädellään ilmeisesti alku- vaiheessa, ja säätelystä vastaavien entsyy- mien aktivoitumisen onkin havaittu vaikut- tavan lopputuotteiden muodostumiseen (Halkier & Du 1997). Synteesin alkuvai- heessa toimivat sytokromi P450, FMO ja peroksidaasit ovat erittäin lähtöainespesifi- siä (Bennett et al. 1995, Bennett et al. 1996, Bennet et al. 1997b). Sen sijaan syn- teesin loppuvaiheen entsyymeillä on havait- tu olevan vain vähän lähtöainespesifisyyttä (Halkier & Du 1997). Glukosinolaattien muodostuminen riippuu lähtöaineesta, pH:sta, rauta-ioneista, epitiospesifisen pro- teiinin mukanaolosta sekä muista vielä huo- nosti tunnetuista tekijöistä (Taipalesuu et al. 1997). Aminohappojen dekarboksylaasi-aktii- visuutta on havaittu tietyissä soluorganis- meissa, kuten mikrosomeissa, joiden arvel- laan olevan glukosinolaatti-synteesin väli- tuotteita (aldoksiimeja) muodostavien FMO-entsyymien sijaintipaikkoja (Bennett et al. 1996). Peroksidaasien on sen sijaan to- dettu toimivan solukalvoihin sitoutuneena ja riippuvan kasvin kehitysasteesta (Ben- nett et al. 1997a). Glukosinolaattien lisäksi saman biosyn- teesin tiedetään tuottavan mm syanogeeni- siä glykosidejä sekä kasvihormoneja. Aro- maattisten glukosinolaattien (tyrosiini- ja fenyylialaniinilähtöiset) ja syanogeenisten glukosidien biosynteesit erkanevat juuri al- doksiimien muodostumisen jälkeen, minkä takia aldoksiimit ovat tärkeitä välituotteita myös syanogeenisten glukosinolaattien synteesissä (Du et al. 1995). Glukosinolaat- tien synteesistä poiketen syanogeeniset glu- kosinolaatit ovat ilmeisesti riippuvaisia pel- kästään sytokromi P450:n toiminnasta (Bennett et al. 1996). Tryptofaani toimii puolestaan indolyyliglukosinolaattien li- säksi tunnetun kasvihormonin, indolyy- lietikkahapon (IAA), lähtöaineena (Halkier & Du 1997). 2.2.2 Sijainti kasvissa Glukosinolaattien ja myrosinaasien sijainti kasvisolukossa sekä solun sisällä ei ole selvä. Glukosinolaatit sijaitsevat eräiden tutki- musten mukaan samassa solussa niitä hyd- rolysoivien myrosinaasi-entsyymien kanssa (Bones & Rossiter 1996). Tällöin tarkoite- taan myrosinaasi-glukosinolaatti-systee- miä, josta kerrotaan glukosinolaattien hyd- rolyysin yhteydessä luvussa 2.3. Eräiden tutkimusten mukaan itävässä sareptansinapin siemenessä glukosinolaatit (sinigriini) ja myrosinaasit sijaitsevat pääo- sin täysin eri soluissa. Glukosinolaatit esiin- tyvät mahdollisesti solujen vakuoleissa (so- lunesterakkuloissa) tai proteiineihin (protein body) liittyneinä tai niiden yhteydessä. Nämä proteiinia sisältävät solut muistutta- vat heinäkasvien varastoproteiinia sisältäviä aleuronisoluja, joissa ei kuitenkaan esiinny glukosinolaatteja. Myrosinaasit sijaitsevat nk. myrosiinisolujen myrosiinijyväsissä, nii- den ulkokalvoilla tai muiden soluorganelli- en ulkokalvoihin kiinnittyneinä (Kuva 4). On mahdollista, että glukosinolaattien si- jainti ja pitoisuus muuttuu selvästi itämisen alkuvaiheessa, sillä noin neljän vuorokau- den vanhassa taimessa proteiinivarasto oli hajonnut ja sinigriiniä oli vakuolissa jäljellä enää vähän (Kelly et al. 1998). Glu- kosinolaatin lisäksi vakuolit ilmeisesti sisäl- tävät melko suuria pitoisuuksia askor- biinihappoa (Bones & Rossiter 1996). Glukosinolaattien on havaittu kerään- tyvän erityisesti juuriin ja lehtiin. Eräillä kasveilla, kuten papaijalla, mono-oksy- genaasi-entsyymiaktiivisuus rajoittuu vain lehtiin (Bennett et al. 1997a). Näiden lisäk- si glukosinolaatteja esiintyy runsaasti risti- 14 kukkaisten siemenissä ja kehittyvissä alki- oissa, vaikka ne eivät tutkimuksen mukaan pysty syntetisoimaan näitä yhdisteitä, vaan ainoastaan muodostamaan rikkipitoisia aminohappoja (Toroser et al. 1995). Glukosinolaattien kulkeutumisesta tuo- tantokohdasta muualle solukkoon ei ole tarkkaa tietoa. Glukosinolaattien fysioke- miallisten ominaisuuksien todettiin kuiten- kin olevan sellaisia, että niiden kuljetus kas- vin varren johtosolukon nilaosassa on mah- dollista (Brudenell et al. 1999). Glu- kosinolaattien todettiin kulkeutuvan kehit- tyvien rapsinsiementen alkioista kasva- tusalustaan, mikä osoitti jonkinlaisen kulje- tusmekanismin toimivuutta (Gijzen et al. 1989). Kun siemenissä esiintyville glukosino- laateille etsittiin mahdollista synteesipaik- kaa, havaittiin että litujen glukosinolaatti- pitoisuus vähenee samanaikaisesti, kun sie- menten glukosinolaattipitoisuus kasvaa. On ilmeistä, että litu toimii varsinaisena synteesisolukkona siemeniin kuljetettaville glukosinolaateille (Bilsborrow et al. 1993a, Toroser et al. 1995). 2.2.3 Biosynteesin geneettinen säätely Glukosinolaattien biosynteesin säätelyä on ymmärrettävä, kun tavoitteena on niiden hallittu ja optimoitu tuotanto sekä mahdol- lisesti aineenvaihduntatuotteiden muok- kaus. Usein tutkimuksissa hyödynnetään mutantteja kasveja, joilta tutkittava aineen- 15 Mitokondrio Solukelmu eli plasmalemma Vakuolia ympäröivä tonoplasti Endoplasmakalvosto Tärkkelyksen täyttämä amyloplasti Vakuoli Soluseinä Tuma Varastoproteiini-verkostoa, johon myrosinaasit ovat liittyneet muodostaen myrosiinijyväsen Glukosinolatteja ja askorbiinihappoa Myrosinaaseja Kuva 4. Myrosinaasi-entsyymin ja glukosinolaattien oletettu sijainti soluissa. Myrosinaasi-entsyy- mit sijaitsevat myrosiinijyväsissä, niiden ulkokalvoilla tai muiden soluorganellien ulkokalvoilla. Glukosinolaatit esiintyvät mahdollisesti vakuoleissa tai kiinnittyneinä varastoproteiineihin. Myrosinaasien sijaintisolua kutsutaan myrosiinisoluksi (Bones & Rossiter 1996, Kelly et al. 1998). vaihduntatuote puuttuu tai sen muodostu- minen on vähäistä. Näin aineenvaihdunnan merkitystä kasvin kehityksessä voidaan tut- kia. Alifaattisten glukosinolaattien vähyys tai puuttuminen mutantista lituruohosta ei muuttanut kasvin rakennetta tai kasvua, vaikka usein aineenvaihduntatuotteiden ta- sapainon muuttuminen on kasvin kehityk- sen kannalta tuhoisaa. Glukosinolaattien vähyys johtui mutantista geenistä (gsm1). Tällöin yhdisteen oleelliset lähtöaineet puuttuivat, eikä metioniinia muodostunut alifaattisia glukosinolaatteja varten (Haughn et al. 1991). Erityisesti on tutkittu niiden geenien toimintaa, jotka vaikuttavat metioniiniläh- töisten glukosinolaattien sivuketjun muo- dostumiseen. Vähintään kahteen, mutta mahdollisesti useampaankin eri lokukseen (geeni) (Gsl-alk, Gsl-elong, Gsl-ohp, Gsl- oxid), kuuluvien muotojen (alleeli) arvellaan säätelevän alifaattisten eli metioniiniläh- töisten glukosinolaattien muodostumista (Magrath et al. 1994, Giamoustaris & Mit- hen 1996, Halkier & Du 1997). Ristikuk- kaisilla Gsl-elong määrää sen, muodostuuko vain propyylijohdannaisia vai niiden lisäksi myös butyylijohdannaisia (Magrath et al. 1994, Mithen & Campos 1996). Gsl-elong määrää mahdollisesti myös alifaattisten glukosinolaattien kokonaispitoisuuden (Halkier & Du 1997). Gsl-elongin lisäksi Gsl-pron on havaittu säätelevän propyyli- glukosinolaattien muodostumista (Mag- rath et al. 1994). Lituruoholla Gsl-alk säätelee butyyli- ja pentyyliglukosinolaateiksi päätyviä sivu- ketjuja. Gsl-ohp ja Gsl-oh säätelevät hydrok- siryhmien liittymistä mm. metyylisulfinyy- libutyyli ja butyyliglukosinolaatteihin (Mit- hen & Campos 1996). Maantieteellisesti tarkasteltuna länsieu- rooppalaiset lituruohot sisälsivät Gsl-ohp- alleeleja ja tuottivat propyyli- ja butyyli- glukosinolaatteja. Keski- ja itäeurooppalai- set kasvit puolestaan sisälsivät Gsl-elong- alleeleja ja tuottivat pelkästään propyyli- glukosinolaatteja (Mithen & Campos 1996). On ilmeistä, että eri kasveilla esiin- tyy erilaisia Gsl-elong -lokuksen (geeni) muotoja (alleeleja), mikä aiheuttaa vaihte- lua glukosinolaattien sivuketjun pituuteen sekä siihen liittyvien toiminnallisten ryhmi- en kiinnittymiseen (Magrath et al. 1994, Mithen & Campos 1996). 2.3 Glukosinolaattien hajoaminen 2.3.1 Hydrolyysi Myrosinaasi-entsyymit hajottavat glu- kosinolaatteja D-glukoosiksi ja thiohydrok- simaatti-O-sulfonaatiksi (aglukoni). Pysy- mätön aglukoni hajoaa muun muassa sul- faatiksi, isotiosyanaatiksi, tiosyanaatiksi, epitionitriiliksi ja nitriiliksi, joista osa on myrkyllisiä. Myrosinaaseja on tavattu Bras- sicaceae-heimoon kuuluvien kasvien lisäksi ainakin 14 muusta heimosta (Rodman 1991). Myrosinaasi-aktiivisuutta on löydet- ty myös sienistä, bakteereista, kirvoista ja nisäkkäiden soluista (Bones & Rossiter 1996). Glukosinolaattien hajoamisnopeus ja hajoamistuotteen luonne riippuu glu- kosinolaatin sivuketjun sisältämistä ryh- mistä, pH:sta sekä myrosinaasiin liittyneis- tä proteiineista (Bones & Rossiter 1996, Sharma & Garg 1996, Taipalensuu et al. 1996, Halkier & Du 1997, Eriksson 2000). Suurin myrosinaasi-aktiivisuus havaittiin pH 7:ssä (+37 °C lämpötilassa) (Sharma & Garg 1996), ja poikkeama tästä arvosta las- ki aktiivisuutta. Neutraaleissa (pH 5) olois- sa hajoamistuotteina olivat isotiosyanaatit ja happamissa (pH 2) nitriilit, joiden muo- dostumiseen vaikuttavat rautaionit ja muut kationit (Bones & Rossiter 1996). Hydrolyysin sijaintipaikkaa tutkittaessa on ensin selvitettävä glukosinolaatteja sekä niitä hydrolysoivien myrosinaasi-entsyymi- en keskinäinen sijainti kasvisolukossa. Asiaa vaikeuttaa se, että hydrolyysi käynnistyy vasta solukon vioittuessa, minkä takia kom- ponenttien keskinäinen sijainti on edelleen epäselvä (Bones & Rossiter 1996). Eräs ole- tus on, että hajottajaentsyymit ja glu- kosinolaatit sijaitsevat eri soluissa, josta ker- rottiin kappaleessa 2.2. Toinen oletus on, 16 että hajottavat entsyymit sijaitsevat glu- kosinolaattien kanssa samassa solussa. Niitä kutsutaan myrosinaasi-glukosinolaatti-so- luiksi tai myrosiinisoluiksi, joiden hajottua glukosinolaattien hydrolyysi alkaa. Solussa glukosinolaatit ja myrosinaasi-entsyymit voivat sijaita joko eri tai samassa osassa, jol- loin ne ovat inaktiivisia. Myrosinaasin ja glukosinolaattien lisäksi samassa solussa esiintyy askorbiinihappoa, jonka on havait- tu lisäävän myrosinaasiaktiivisuutta ja siten nopeuttavan glukosinolaattien hajoamista (Bones & Rossiter 1996). Myrosiinisolut ovat kasvien eritesoluja. Niiden koko ja rakenne muuttuvat kas- visolukon erilaistuessa. Erityisesti laaja eri- tekanavaverkosto sekä runsas myrosiinijy- västen määrä erottavat myrosiinisolut ym- päröivistä soluista. Myrosiinijyväset sisältä- vät homogeenista varastoproteiinia (Bones & Iversen 1985) (Kuva 4). Solun vanhetessa myrosiinijyvästen ympärille kehittyy va- kuoleja, jotka voivat myöhemmin yhdistyä. Myrosiinisolujen määrän on havaittu pie- nenevän kasvisolukon kehittyessä. Tämä johtuu ilmeisesti siitä, ettei uusia soluja muodostu, eivätkä ne jakaudu kasvun aika- na. Sinapilla havaittiin olevan enemmän myrosiinisoluja kuin samassa kehitysvai- heessa olevalla retiisillä. Myös valossa kas- vaneissa kasveissa niitä oli enemmän kuin pimeässä kasvaneissa (Bones & Iversen 1985). 2.3.2 Hajottajaentsyymit Myrosinaasi-entsyymi on glykoproteiini, jonka hiilihydraattipitoisuus on 9–23 % molekyylin kokonaispainosta (Bones & Rossiter 1996) ja molekyylimassa 61–70 kDa (Falk et al. 1992). Rypsin myrosinaa- sista on tunnistettu kolme isoentsyymistä muotoa, MA, MB ja MC, joista MA esiintyy pääasiassa siemenissä ja MB siemenissä, sirkkavarressa ja lehdissä (Eriksson 2000). Myrosinaasia on paikallistettu my- rosiinisolujen myrosiinijyväsistä, joissa on myös proteiinia. Myrosinaasi-aktiivisuuden ei kuitenkaan ole havaittu edellyttävän jy- väsen olemassaoloa (Bones & Iversen 1985). Myrosinaasia on löydetty myös esimerkiksi rapsin kehittyvässä siemenessä myrosiinijy- västen ulkopuolelta (Höglund et al. 1991). Vakuolin ulkopuolella sitä on erityisesti so- lukalvoissa, kuten endoplasmakalvostossa (ER), solukelmussa sekä mitokondrion kal- vorakenteissa (Bones & Iversen 1985). Myrosinaasin sijainti solussa ja sen pitoisuus muuttuvat ilmeisesti hyvin paljon siemenen kehittyessä sekä taimen alkukehityksen ai- kana. On mahdollista, että entsyymi kulje- tetaan synteesipaikaltaan (ribosomeihin liittyneestä ER:stä) muualle soluun (Len- man et al. 1993). Myrosinaasi-entsyymin aktiivisuutta on löydetty kaikista kasvinosista (Bones & Ros- siter 1996), mutta aktiivisuuksissa on ha- vaittu selviä eroja kasvinosien välillä (Hög- lund et al. 1991). Myrosinaasi-aktiivisuutta on erityisesti vioittuneissa tai kuolleissa kas- visolukoissa (Schnug 1989), mutta myös elävien lehtien vihreässä perussolukossa, juuren kärkisolukossa sekä siemenissä (Iver- sen 1970, Bones & Iversen 1985). Rapsin sirkkavarren myrosinaasi-aktiivisuus oli sel- västi suurempi kuin sirkkalehtien (Bones 1990, Falk et al. 1992), joka puolestaan oli moninkertainen juureen verrattuna (Bones 1990). Myrosinaasi-aktiivisuus oli ruusu- kaalin ulkolehdessä neljästä viiteen kertaa suurempi kuin muissa osissa (varsi, sisäleh- det, keskusta) (Springett & Adams 1989, Bones & Rossiter 1996). Myrosinaasiin liit- tyneen proteiinin aktiivisuutta todettiin pelkästään siemenissä (Taipalensuu et al. 1996). Myrosinaasi-aktiivisuus riippuu kas- vinosan lisäksi kasvin kehitysvaiheesta (Höglund et al. 1991, Falk et al. 1992, Bones & Rossiter 1996). Jopa erilaistumat- tomassa solukossa eli kalluksessa esiintyi selvää myrosinaasi-aktiivisuutta, mikä py- syi tasaisena jopa kahden vuoden ajan. Kal- luksesta kasvaneiden versojen myrosinaa- si-aktiivisuus oli sen sijaan erilaistumatonta solukkoa korkeampi (Bones 1990). Eristet- tyjen ja erilaistuneiden solujen myrosinaa- si-aktiivisuuden on havaittu laskevan kehi- tysvaiheen mukana (Bones & Rossiter 17 1996). Vanhoissa kasveissa myrosinaasi-ak- tiivisuus on yleensä nuoria pienempi. Poik- keuksena ovat kehittyvät siemenet, joissa entsyymiaktiivisuus oli korkein noin kuu- kauden kuluttua pölytyksestä. Muissa kas- vinosissa aktiivisuus oli pieni, eikä sitä ha- vaittu lainkaan varsissa ja juurissa (Falk et al. 1992). Myrosinaasi-entsyymit voivat aktivoi- tua sekä ulkoisten että sisäisten säätelyteki- jöiden takia. Ulkoisia tekijöitä ovat mm. kasvisolukon vahingoittuminen (Koritsas et al. 1991). Sisäisiä säätelytekijöitä ovat puolestaan tietyt kasvin viestijärjestelmään liittyvät kemikaalit, jotka säätelevät kasvi- fysiologisia toimintoja. Viestikemikaaleja vapautuu kasvin kärsiessä stressistä, jota voivat aiheuttaa sekä abioottiset että bioot- tiset kasvutekijät. Eniten on tutkittu kas- visolukon vioittumisen ja taudinaiheuttaji- en vaikutusta kasvin sisäiseen viestintään (Doughty et al. 1996, Taipalensuu et al. 1997). Sisäistä säätelyä saattaa tapahtua myös silloin, kun kasvi kärsii rikin puuttees- ta ja glukosinolaatteja hajotetaan primääri- metabolian tarpeita varten (Schnug 1989). Rikin puutteesta johtuvassa stressitilassa toimii askorbiinihappoa tuottava askor- baatti/glutationi -sykli (Schung et al. 1995). Pieninä pitoisuuksina askorbiini- happo kiihdyttää ja suurina pitoisuuksina estää myrosinaasia (Bones & Rossiter 1996). Tämän mahdollistaa se, että myrosinaasista esiintyy useita isoentsyymisiä muotoja, jois- ta ainakin yksi aktivoituu askorbiinihapon vaikutuksesta (Springett & Adams 1989, Xue et al. 1995, Bones & Rossiter 1996, Taipalensuu et al. 1996). Askorbiinihap- po-pitoisuuden lisäksi myrosinaasin aktiivi- suuteen vaikuttavat lämpötila (Springett & Adams 1989, Sharma & Garg 1996) ja my- rosinaasi- sekä lähtöainepitoisuus (Sharma & Garg 1996). Myrosinaasien toiminnan lisäksi glu- kosinolaattien hajoamisprosessiin vaikutta- vat nk. myrosinaaseihin liittyvät proteiinit (MyAP, myrosinase associated proteins ja MBP, myrosinase binding proteins), joiden toimintaa on käsitelty laajasti viimeaikoina Andreas- sonin (2000) ja Erikssonin (2000) teoksissa. Proteiinit vaikuttavat myrosinaasi-entsyy- min toimintaan ja eräät jopa aktivoituvat myrosinaasin tavoin eri ärsykkeille (Falk et al. 1992, Taipalensuu et al. 1996, Taipa- lesuu et al. 1997, Andreasson 2000, Eriks- son 2000). Proteiineilla ei välttämättä ole myrosinaasi-aktiivisuutta, mutta ne edesauttavat myrosinaasi-entsyymin toi- mintaa ja vaikuttavat hajoamistuotteiden muodostumiseen tuottaen rautaionien kanssa epitionitriilejä (Bones & Rossiter 1996). Eräiden myrosiiniin liittyvien prote- iinien on todettu aktivoituvan myrosiinien tavoin solukon vioittuessa tai kemikaalikä- sittelyiden seurauksena (Taipalensuu et al. 1997). 2.3.3 Hajotuksen geneettinen säätely Myrosinaasi-entsyymin aktiivisuutta sääte- lee geeniperhe, josta rapsilla on tunnistettu ainakin MA-(=Myr1) ja MB-(=Myr2) gee- nit (Xue et al. 1992, Thangstad et al. 1993, Bones & Rossiter 1996). Lituruoholla esiin- tyy kolme myrosinaasi-geeniä, joista kah- den (TGG1 ja TGG2) rakenne on selvitetty. Näiden rakenne kuitenkin erosi rapsin my- rosinaasi-geeneistä, mikä havainnollisti rapsin ja lituruohon evoluutionaalista eroa (Xue et al. 1995). Rapsin myrosinaasi-gee- niperhe puolestaan sisältää neljästä lähes kahteenkymmeneen jäsentä, sillä MA- tyyppisiä geenejä todettiin vähintään neljä ja MB-tyyppisiä yli kymmenen (Lenman et al. 1993, Thangstad et al. 1993; Xue et al. 1995). Sinapista on tunnistettu MA1- MB1-, MB2- ja MB3-geenit (Xue et al. 1992). Rapsissa myrosinaasi-geeniaktiivi- suutta esiintyi erityisesti sirkkalehdissä, en- simmäisissä kasvulehdissä sekä kehittyvissä siemenissä, ja jonkin verran liduissa, terä- lehdissä ja lehtiruodissa. Varressa, vanhois- sa lehdissä ja juurissa aktiivisuutta ei havait- tu tai se oli erittäin matala (Falk et al. 1992). Molempien myrosinaasi-geenityyppien (MA, MB ) havaittiin toimivan kehittyvässä sinapin siemenen alkiossa, mutta vain MB oli aktiivinen itävän taimen sirkkalehdissä ja sirkkavarressa (Xue et al. 1993, Bones & 18 Rossiter 1996). On ilmeistä, että my- rosinaasi-geenit ilmenevät ajallisesti ja pai- kallisesti eri tavalla: MA on aktiivisin sieme- nen alkiossa ja MB puolestaan nopeasti ja- kaantuvissa solukoissa, kuten sirkkataimen maanpäällisissä osissa sekä mahdollisesti siemenissä (Falk et al. 1992, Lenman et al. 1993, Xue et al. 1993). 2.4 Glukosinolaattien esiintymiseen vaikuttavat tekijät Glukosinolaattien kuten muidenkin sekun- dääristen aineenvaihduntatuotteiden muo- dostumiseen ja niiden vaihteluun vaikuttaa niin perimä kuin ympäristötekijätkin. Nii- den esiintyminen kasvissa tai solukossa riip- puu yhteyttämistuotteiden saatavuudesta (lähtöaineista), glukosinolaattien biosyn- teesistä sekä niitä hajottavien entsyymien aktiivisuudesta. Glukosinolaattien tiedetään muodostu- van kahdella tavalla. Eräitä glukosinolaat- teja kasvi tuottaa jatkuvasti (riippuen kehi- tysvaiheesta ja kasvinosasta), mutta tietyt glukosinolaatit muodostuvat vasta kasvin reagoidessa ärsykkeisiin. Ärsykkeet voivat myös kiihdyttää biosynteesiä. Siemens ja Mitchell-Olds (1998) testasivat kahta ylei- sesti esiintyvää väittämää glukosinolaattien esiintymisestä. Ensimmäisen hypoteesin mukaan ärsykkeeseen reagoivan kasvin ai- neenvaihdunnan ja perustasoisen metaboli- an välillä on negatiivinen korrelaatio eli mitä enemmän glukosinolaatteja muodos- tuu aineenvaihdunnan perustasolla, sitä vä- hemmän glukosinolaattien muodostumi- nen lisääntyy ärsykkeen jälkeen. Toisen hy- poteesin mukaan korkea perusmetabolia vaatia kasvilta runsaasti energiaa, mikä ai- heuttaa siemensadon alenemista. Tutki- mukseen käytettiin rypsiä, jonka tiedettiin tuottavan glukosinolaatteja vaihtelevia määriä riippuen kasvuoloista. Tulokset ei- vät tukeneet ensimmäistä hypoteesia, sillä aineenvaihduntatuotteiden muodostumi- nen ärsytyksen (patogeenit ja hyönteiset) seurauksena oli joko riippumaton perus- tasoisesta glukosinolaatti- ja myrosinaa- si-pitoisuudesta tai aineenvaihduntatuot- teita syntyi enemmän, kun perustasoinen tuotto oli korkeampi. Sen sijaan tulokset vahvistivat toista väittämää, sillä runsaasti myrosinaasia tuottavilla kasveilla oli noin 16 % pienempi siemensato kuin vähän tuo- tavilla kasveilla (Siemens & Mitchell-Olds 1998). Glukosinolaattien synteesiin ja my- rosinaasin aktiivisuuteen vaikuttavat useat eri tekijät. Abioottisia eli elinympäristössä olevia elottomia tekijöitä ovat lämpötila, valo, ilman hiilidioksidipitoisuus, ravinneti- la ja kuivuus. Bioottisia eli elollisia tekijöitä ovat kasvilaji, kasvilajike, kehitysvaihe, kas- vinosa ja yhteyttämistuotteiden kulkeutu- minen muihin satokomponentteihin. Glu- kosinolaatti-synteesin lisäksi lopulliseen glu- kosinolaatti-pitoisuuteen vaikuttaa myös my- rosinaasin toiminta. 2.4.1 Abioottiset tekijät 2.4.1.1 Valo Valo on kasvien yhteyttämisen sekä sen kas- vuun ja kehitykseen tarvittavien primääris- ten aineenvaihduntatuotteiden synteesien peruselementti. Valon merkitys sekundää- risten aineenvaihduntatuotteiden muodos- tumisessa ei ole kuitenkaan selvä. Valon vaikutus kasvien kehitykseen riippuu yh- teyttämiskelpoisen säteilyn määrästä (pho- tosynthetic active radiation, PAR, muusta säteilystä (nm. UVA ja UVB), säteilyn voi- makkuudesta sekä päivänpituudesta. Valon vaikutus kahdeksan vuorokautta vanhojen retiisintaimien glukosinolaattien muodostukseen riippui kasvinosasta sekä siitä, montako vuorokautta taimia oli kas- vatettu yhtäjaksoisesti joko valossa tai pi- meässä. Valovuorokausien määrän lisäänty- minen lisäsi yleensä myös glukosinolaattien muodostumista sirkkavarressa ja vähensi niiden muodostumista sirkkalehdissä. Kun taimia oli kasvatettu jatkuvassa valossa, oli sirkkavarressa hyvin paljon glukosinolaat- tia ja sirkkalehdissä puolestaan hyvin vä- hän. Jatkuvassa pimeässä kasvatettujen 19 kasvien sirkkavarsissa glukosinolaattia oli sen sijaan hyvin vähän ja sirkkalehdissä hy- vin paljon verrattuna muissa olosuhteissa kasvatettuihin kasveihin (Kimura et al. 1995). Keräkaalintaimia kasvatettiin kasvatus- kaapeissa, joiden yö- ja päivälämpötila oli sama. Glukosinolaatti-pitoisuudet vaihteli- vat valo- ja pimeäjaksoista riippumatto- masti (ultraradiaanisesti), sillä molempien jaksojen aikana havaittiin sekä juurissa että lehdissä korkeita glukosinolaatti-pitoi- suuksia (Rosa & Rodrigues 1998). Aikai- semmassa kokeessa samat tutkijat havaitsi- vat, että valojakson aikana juurten koko- naisglukosinolaatti-pitoisuudet laskivat pi- meäjaksoon verrattuna (Rosa 1997). Valo- jaksoisuudesta aiheutuva rytmitys peittyi sen sijaan korkean kasvatuslämpötilan aihe- uttamien stressioireiden alle (Rosa & Rodri- gues 1998). Valo vaikuttaa ilmeisesti myrosinaasin toimintaan, sillä valossa kasvatetun keltasi- napin sirkkalehdet sisälsivät vähemmän si- nalbiiniä kuin pimeässä kasvatetun. Ilmiön oletettiin johtuvan siitä, että myrosinaa- si-aktiivisuus ja siten glukosinolaattien ha- jotus on runsaampaa valossa kasvatetuissa lehdissä (Bennett et al. 1997b). 2.4.1.2 Lämpötila Lämpötila vaikuttaa yhteyttämistehokkuu- teen sekä glukoosin muodostumiseen. Pri- määrisen aineenvaihdunnan tarpeesta riip- puen ylijäävästä glukoosista syntetisoidaan sekundäärisiä aineenvaihduntatuotteita. Keräkaalin maanpäällisten osien sekä juur- ten glukosinolaatti-pitoisuudet kohosivat lämpimissä oloissa (Rosa & Rodrigues 1998). Vaihtelut kokonaisglukosinolaat- ti-pitoisuudessa ja yksittäisten gluko- sinolaattien pitoisuuksissa olivat selvästi suurempia lämpimässä kasvatetuissa tai- missa. Tutkimukset osoittavat, että korkeassa lämpötilassa glukosinolaatti-pitoisuudet saattavat olla suurempia, mutta glu- kosinolaattien vaihtelut vuorokauden aika- na ovat myös normaalia suuremmat (Rosa & Rodrigues 1998). Portugalilaisessa tutki- muksessa verrattiin kesällä ja talvella kasva- tettujen kaalien glukosinolaatti-pitoisuuk- sia. Kesäkautena kasvatettujen kaalien ko- konaisglukosinolaatti- sekä glukoiberiini- pitoisuudet olivat korkeimmat (Rosa & Heaney 1996, Rosa et al. 1996). Viileissä talvioloissa kasvatetut kaalit sisälsivät sitä vastoin runsaasti typpeä (Rosa & Heaney 1996). 2.4.1.3 Ilman dioksidit Hiilen ja typen tasapainoteorian mukaan kasvi suuntaa yhteyttämistuotteitaan ensi- sijassa kasvuun. Energian siirtyminen se- kundäärimetaboliitteihin ja kasvin puolus- tukseen riippuu kokonaisenergiatilanteesta sekä hiilen ja typen tasapainosta kasvissa. Mikäli energiaa on ylimäärin tai ravinteiden saatavuus ei ole tasapainossa, saattaa kasvi lisätä sekundääristen aineenvaihduntatuot- teiden biosynteesiä (Gleadow et al. 1998). Ilmakehän hiilidioksidi-pitoisuuden kasva- essa hiilen ja typen tasapaino kasvissa muut- tuu ja typpi tulee olemaan kasvien kasvua rajoittava tekijä. Tämä rajoittaa typpi-pi- toisten primääriyhdisteiden muodostumis- ta, mistä seurannee typpeä sisältävien se- kundääristen aineenvaihduntatuotteiden väheneminen (Karowe et al. 1997). Väittämän testaamiseksi tutkijat kasva- tettivat sinappia, retiisiä ja naurista kasva- tuskaapeissa, joiden hiilidioksidi-pitoisuus oli normaali (360 ppm) tai nostettu (725 ppm). Ainoastaan sinapin nuorien ja vanho- jen lehtien glukoosinolaatti-pitoisuus aleni merkitsevästi korkean hiilidioksidi-pitoi- suuden takia, niin että toiseksi nuorimmas- sa lehdessä oli 45 % ja neljänneksi nuorim- massa lehdessä 30 % vähemmän glu- kosinolaatteja kuin verrannekasvin lehdis- sä. Käsittely ei sen sijaan vaikuttanut retii- sin ja nauriin glukosinolaatti-pitoisuuksiin (Karowe et al. 1997). Lituruohoja kasvatettiin oloissa, joissa ilman rikkidioksidin pitoisuutta oli nostet- tu. Suurin rikkidioksidin altistus (706 ± 28 20 nl SO2 l-1) lisäsi versojen glukosinolaatti-pi- toisuutta 2,5-kertaiseksi, kun mittaus teh- tiin kymmenen vuorokautta käsittelyn jäl- keen (van der Kooij et al. 1997). 2.4.1.4 Maalaji Glukosinolaatti-pitoisuuden havaittiin ole- van korkeampi savimaalla kasvatetuissa kasveissa verrattuna hiekkamaan kasveihin (Heaney & Fenwick 1980). Kun glu- kosinolaatteja sisältävien kasvijätteiden ha- joamista tutkittiin savi- ja hiekkamailla, ha- vaittiin, että mikrobihengitys oli runsaam- paa savimaalla. Ilmeisesti tämän takia glu- kosinolaattien hajoamistuotteita esiintyi vähemmän juuri savimaalla. Hajoamistuot- teita löydettiin savimaasta myös lyhemmän aikaa kuin hiekkamaasta (Bending & Lin- coln 1999). 2.4.1.5 Kuivuus Kuivuus lisää glukosinolaatti-pitoisuuksia (Bouchereau et al. 1996, Ciska et al. 2000). Rypsin siemenissä niitä on ollut jopa 120–200 % enemmän kuivuudesta kärsi- vissä kuin sadetetuissa kasveissa (Milford & Evans 1991). Glukosinolaatti-pitoisuus li- sääntyy sitä enemmän, mitä myöhäisem- mässä kehitysvaiheessa kasvi kärsii kuivuu- desta. Rypsin siemenissä glukosinolaatteja oli eniten, kun kasvi kärsi kuivuudesta ve- getatiivisen kasvun tai kukinnan alkuvai- heessa (Bouchereau et al. 1996, Jensen et al. 1996). Kuivuus kukintavaiheessa nosti sie- menten glukosinolaatti-pitoisuutta jopa 40–65 %, jolloin erityisesti alkenyyliglu- kosinolaattien pitoisuus lisääntyi (Champo- livier & Merrien 1996). Litujen täyttövai- heessa kuivuus ei enää vaikuttanut tai vai- kutus siemenen laatuun oli vain vähäinen (Bouchereau et al. 1996, Champolivier & Merrien 1996, Jensen et al. 1996). Rypsin glukosinolaatti-pitoisuus alkoi lisääntyä, kun kuivuusstressiä oli kestänyt yli kuusi vuorokautta ja lehden vesipotentiaali oli alle -1,4 Mpa. Tämän jälkeen glukosinolaat- ti-pitoisuus lisääntyi lineaarisesti 1,5 µmol g-1 kunakin stressipäivänä (Jensen et al. 1996). Veden puute voi aiheuttaa kasveissa sel- laisia metabolisia muutoksia, jotka estävät hyönteisten pesiytymisen sekä muuttavat niiden maittavuutta kasvinsyöjille. Kaaleja kasteltiin niukasti siten, että kasvit kärsivät vedenpuutteesta. Oletuksesta poiketen kaali- ja persikkakirvan menestyminen ei riippunut kasvin vesipotentiaalista (Cole 1997). Tuloksen perusteella voidaan olet- taa, ettei kasvi tuottanut kirvoja haittaavia yhdisteitä tai ne eivät vaikuttaneet tutkit- tujen kirvojen käyttäytymiseen. 2.4.1.6 Ravinteet Rikki Rikki on tärkeä ravinne erityisesti glu- kosinolaatteja syntetisoiville kasveille. Öljykasvit tarvitsevat rikkiä noin kaksi ker- taa enemmän kuin viljakasvit eli 20–30 kg ha-1 (Booth et al. 1991). Rikki-pitoisten lan- notteiden lisääminen on nostanut yleensä kasvien glukosinolaatti-pitoisuutta. Kali- umsulfaattina annettu rikki (50 kg ha-1) li- säsi viljeltyjen ristikukkaisten glukosino- laatti-pitoisuutta (Booth & Walker 1994). Lannoitus vaikuttaa eri tavalla eri kas- vinosiin, sillä rikin lisäys ei nostanut retiisin juuren glukosinolaatti-pitoisuutta (Lee et al. 1996). Rikkilannoituksen nostaminen (10–45 kg S ha-1) kylvölannoituksen yh- teydessä on lisännyt kevätrypsin siementen glukosinolaatti-pitoisuutta (Asare & Scaris- brick 1995, Jonsson 1996). Myös syysryp- sin siementen glukosinolaatti-pitoisuudet nousivat, kun kylvön yhteydessä lisättiin rikkilannoitusta (15–45 kg S ha-1) (Jonsson 1996). Rikkilannoitus kukkimisvaiheessa on selvästi lisännyt siementen glukosino- laatti-pitoisuutta (Hocking et al. 1996). Vähän rikkiä sisältävillä maalajeilla rikin li- säys jopa kaksinkertaisti siementen glu- kosinolaatti-pitoisuuden (Zhao et al. 1993). Rikin puute vaikuttaa eri glukosinolaat- teihin eri tavalla. Alkenyyliglukosinolaatit 21 muodostuvat metioniinistä ja ovat herkem- piä rikinpuutteelle kuin indoliglukosinolaa- tit, jotka muodostuvat tryptofaanista Tämä johtuu ilmeisesti siitä, että glukosinolaat- tien lähtöaineena toimivien aminohappojen synteesi reagoi eri tavalla rikin puutteeseen (Zhao et al. 1994). Tätä tukee havainto, jos- sa rikkilisäys kiihdytti metioniinin ja kyste- iinin muodostumista aspartaatin ja aspara- giinin kustannuksella (Zhao et al. 1993). Rikkilannoitus saattaa vaikuttaa suo- raan hyönteisten käyttäytymiseen kasvissa, mikä voi edelleen epäsuorasti vaikuttaa kas- vin glukosinolaatti-pitoisuuteen. Tämä ha- vaittiin, kun runsaasti rikkiä saaneet ruusu- kaalit houkuttelivat tehokkaimmin kaali- kirvoja, joiden vioituksista seurasi puoles- taan glukosinolaattien väheneminen kaalis- sa (Yusuf & Collins 1998). Rikin saannin vähenemisen yhteydessä myrosinaasi-entsyymit aktivoituvat ja kas- vin glukosinolaatteja hydrolysoidaan pri- määrimetabolian rakennusaineiksi (Shung 1989, Schung 1990, Schung et al. 1995). Vaikka glukosinolaattien sisältämän rikin osuus kasvin kokonaisrikistä on pieni, toi- mivat glukosinolaatit jonkinlaisena rikkiva- rastona tai puskurina rikin saannin muu- toksille (Bones & Rossiter 1996). Rikkilan- noitus vaikuttaa kasvin glukosinolaatti-pi- toisuuteen vain silloin, kun maassa ei ole sitä tarpeeksi ja kasvi kärsii rikinpuutteesta (Shung 1989, Schung 1990, Schung et al. 1995). Typpi Typpilannoituksen lisääminen nostaa usei- den tutkimusten mukaan siementen sini- griini-pitoisuutta (Bones & Rossiter 1996) sekä muiden glukosinolaattien pitoisuutta (Milford & Evans 1991, Bilsborrow et al. 1993b, Asare & Scarisbrick 1995). Tämä johtuu mitä ilmeisemmin siitä, että öljykas- vien siementen valkuaisainesynteesi kiihtyy typpilannoitusta lisättäessä (Kundu & Dha- ka 1996). Lannoituksen vaikutusta glukosinolaat- tien hajoamistuotteiden muodostumiseen on tutkittu varsin vähän. Saatavilla olevien tutkimusten mukaan vaikutus ei ole yk- siselitteinen. Kun kyssäkaalien astiakokees- sa typpilannoitus nostettiin nelinkertaisek- si, glukosinolaattien hajoamistuotteiden määrä laski yli 50 %. Sen sijaan kun kalium- lannoitusta lisättiin nelinkertaiseksi, lisään- tyi glukosinolaattien hajoamistuotteiden määrä n. 40 %. Tuorepainoa kohden lasket- tuna typellä oli selvästi kaliumia suurempi merkitys hajoamistuotteiden muodostumi- seen (Fischer 1992). Typen ja rikin suhde Typen ja rikin tasapaino vaikuttaa kasvin kasvuun ja kehittymiseen. Ravinteilla on havaittu selvä yhdysvaikutus kasvien glu- kosinolaatti-pitoisuuteen. Kasvi kärsii hel- posti rikin puutteesta, jos lannoituksen ty- pen ja rikin suhde on korkea ja glu- kosinolaattien biosynteesi estyy. Vastaavas- ti, jos typen ja rikin suhde on pieni, saattaa jopa alifaattisten glukosinolaattien pitoi- suus nousta (Milford & Evans 1991, Zhao et al. 1993, Hocking et al. 1996, Blake-Kalff et al. 1998). Typpilannoitus lisää siementen glukosinolaatti- ja valkuaispitoisuutta, kun rikkiä on riittävästi saatavilla. Mikäli rikkiä on vähän, typpilisäys saattaa jopa alentaa glukosinolaatti-pitoisuutta (Zhao et al. 1993). 2.4.1.7 Ulkoinen kemikaalikäsittely Glukosinolaattien biosynteesiin on mah- dollista vaikuttaa ulkoisin kemikaalikäsit- telyin. Metyylijasmonaatti (100 µM) lisäsi erityisesti rapsin indolyyliglukosinolaattien muodostusta, mutta se ei vaikuttanut glu- kosinolaattien kokonaispitoisuuteen (Ben- nett et al. 1997b). Salisyylihappo (2,5 mM) lisäsi rapsin fenyylietyyliglukosinolaattien muodostumista, mutta ei vaikuttanut glu- kosinolaattien lopulliseen pitoisuuteen. Samassa tutkimuksessa olleen sinapin indo- lyyliglukosinolaatti-pitoisuus ei ulkoisten kemikaalikäsittelyjen takia muuttunut (Bennett et al. 1997b). Toisessa tutkimuksessa sinapin sinalbii- 22 ni-pitoisuus puolestaan lisääntyi jopa kah- deksankertaisesti jasmonihappo-käsittelyn (50–100 µM) jälkeen. Kokonaisglukosino- laattien määrä ei solussa kuitenkaan lisään- tynyt, mikä viittaa lähtöaineen eli tyrosiinin rajoittuneeseen määrään (Du et al. 1995). Jasmonihappo kiihdytti aromaattisen glu- kosinolaatin lisäksi fenolisten yhdisteiden, kaneli- ja kumariinihapon muodostumista (Du & Halkier 1996). Glukosinolaattien hajoamiseen ja my- rosinaasi-entsyymin aktiivisuuteen voidaan vaikuttaa ulkoisin käsittelyin. Metyylijas- monaatin ja jasmonihapon havaittiin lisää- vän myrosinaasi-entsyymiin liittyvän prote- iinin (MyAP) aktiivisuutta. Salisyylihappo puolestaan ehkäisi aktivoitumista (Taipa- lesuu et al. 1997). Matalan askorbiinihap- po-pitoisuuden todettiin lisäävän (Du et al. 1995) ja korkean ehkäisevän myrosinaa- si-aktiivisuutta (Du & Halkier 1996, Du et al. 1995). Askorbiinihappo ilmeisesti pa- rantaa myrosinaasi-entsyymin ja sen subst- raatin, glukosinolaatin, yhteensopivuutta, jolloin hydrolyysinopeus kiihtyy. Koska as- korbiinihappo ja glukosinolaatti kilpailevat myrosinaasin aktiivisesta kohdasta, saattaa askorbiinihappo suurina pitoisuuksina syr- jäyttää glukosinolaatin ja hidastuttaa hyd- rolyysiä (Bones & Rossiter 1996). 2.4.2 Bioottiset tekijät 2.4.2.1 Kasvilaji Glukosinolaattia tuottavat kasvit ovat hy- vin erilaisia. Tähän vaikuttaa myös se, että muutokset nuorten ja vanhojen kasvinosien välillä ovat eri kasvilajeilla usein eri suuntai- set. Rapsin kuten muidenkin ristikukkais- ten kasvien glukosinolaatti-pitoisuudet las- kevat solukon vanhetessa, mutta keltasina- pin osalta tilanne on päinvastainen (Karowe et al. 1997). Keltasinapilla glukosinolaattia hajottavan entsyymin aktiivisuus on jopa kymmenkertainen rypsiin ja rapsiin verrat- tuna. Tämä saattaa vaikuttaa mitattavaan glukosinolaatti-pitoisuuteen (Bones 1990). Tavallisesti glukosinolaatteja on niitä tuottavissa kasveissa monia erityyppisiä (Hrncirik & Velišek 1997). Kahdestakym- menestä kaalikasvista tunnistettiin 13 eri- laista glukosinolaattia, joista sinigriini, glu- konapiini ja glukobrassikiini esiintyivät suurimpina pitoisuuksina (Cole 1997). Sinappi sisältää poikkeuksellisesti vain yhtä pääkomponenttia. Sinalbiini on keltasina- pin, sekä sinigriini mustasinapin ja rypsin pääasiallinen glukosinolaatti (Velišek et al. 1995). Laajassa kaalikasvitutkimuksessa selvi- tettiin yhteensä 50 parsakaalilajikkeen, nel- jän ruusukaalinlajikkeen, kuuden kaalila- jikkeen ja kolmen kukkakaalilajikkeen glu- kosinolaatti-koostumukset. Lähes kaikilla kaaleilla pääkomponentteina olivat gluko- brassikiini ja glukonapiini. Sen lisäksi parsa- kaalin pääkomponentteina olivat gluko- raphaniini ja progoitriini, ruusukaalilla sini- griini ja progoitriini, kaalilla sinigriini sekä kukkakaalilla sinigriini ja hydroksygluko- brassisiini (Kushad et al. 1999). Indoliglukosinolaattien on havaittu muodostavan 30–40 % tavanomaisempien kaalien kokonaisglukosinolaatti-pitoisuu- desta, ja loput muodostuvat pääasiassa ali- faattisista glukosinolaateista (Ciska et al. 1994). Kasvien kokonaisglukosinolaat- ti-pitoisuuden mukainen järjestys suurim- masta pienimpään on seuraava: isovesikras- si, retiisit, ruusukaali, kukkakaali, nauris, parsakaali, kyssäkaali, kiinankaali ja valko- kaali (Hrncirik & Velišek 1997). Punakaa- lissa oli glukosinolaattia selvästi valkokaalia vähemmän (Ciska et al. 1994). Viljeltyjen lajien lisäksi eroja havaitaan viljeltyjen sekä niiden jalostuksessa käytettyjen esi-isien vä- lillä. Luonnonvaraisten kaalikasvien on ni- mittäin havaittu sisältävän keskimäärin enemmän glukosinolaatteja kuin jalostet- tujen lajien (Cole 1997). Eri lajien glukosinolaatti-pitoisuuksien vaihtelut heijastavat eroja niiden muissa ai- neenvaihduntatuotteissa. Myös niihin on kiinnitettävä huomiota, sillä ne saattavat vaikuttaa glukosinolaatti-pitoisten kasvis- ten terveysvaikutukseen. Kolmen parsa- kaalilajikkeen indolyyli-, alkyyli- ja al- kenyyliglukosinolaatti-pitoisuudet erosivat 23 selvästi. Lajike, jossa indolylglukosinolaat- ti-pitoisuus oli korkein, sisälsi vähiten karo- teeneja (β-karoteeni, luteiini) sekä klorofyl- liä (klorofylli a ja b). Kaksi muuta lajiketta, joissa oli joko paljon tai vähän alkyyli- ja al- kenyyliglukosinolaatteja, sisälsivät molem- mat runsaasti klorofyllejä sekä karoteeneja (Schreiner et al. 1998). Parsakaalin gluko- raphani- ja α-tokoferoli-pitoisuuden, ali- faattisten glukosinolaattien ja γ-tokofero- li-pitoisuuden sekä glukonasturtiin ja γ-to- koferoli-pitoisuuden välillä havaittiin mer- kitsevät ja samalla positiiviset yhteydet. Sen sijaan yhteyttä ei havaittu indoliglukosino- laattien ja antioksidanttien välillä (Kushad et al. 1999). 2.4.2.2 Kasvilajike Ristikukkaisista kuten rypsistä ja rapsista on jalostuksen avulla pystytty tuottamaan 0- ja 00-lajikkeita. 0-lajikkeet tuottavat glukosinolaatteja, mutta erukahapon muo- dostuminen niistä on jalostuksen avulla poistettu lähes kokonaan. Sen sijaan 00-lajikkeet eivät tuota kum- paakaan rehuarvoa alentavaa komponent- tia. Suomessa viljellään tällä hetkellä aino- astaan rypsin ja rapsin 00-lajikkeita, joilla erukahappo- ja glukosinolaatti-pitoisuudet ovat alhaiset. Rapsin 0- ja 00-lajikkeet ovat tieteelli- sesti kiinnostava kohde, kun haluamme ymmärtää glukosinolaattien muodostumis- ta kasvissa sekä niiden vaihteluita eri olois- sa. Rapsin lehtien glukosinolaatti-pitoi- suuksissa sekä -koostumuksessa 00- ja 0-la- jikkeiden välillä ei ole aina havaittu eroja (Porter et al. 1991), vaikka toisinaan lehtien glukosinolaatti-pitoisuus on 00-lajikkeilla ollut matalampi kuin vastaavalla 0-lajik- keella (Krzymanska et al. 1996). Lehdissä olleet pitoisuuserot ovat olleet pienempiä kuin erot vastaavien lajikkeiden siemenissä (Krzymanska et al. 1996). Siementen glu- kosinolaatti-pitoisuudet kasvavat 0- ja 00-lajikeilla eri tavalla ja eri vaiheessa (Booth & Walker 1990). Rapsin 00-lajik- keilla indolyyliglukosinolaatit (erityisesti glukobrassikiini) olivat vallitsevia kehityk- sen alkuvaiheessa, kun taas 0-lajikkeilla ali- faattiset glukosinolaatit (glukobrassikana piini) olivat vallitsevana koko vegetatiivisen kasvun ajan (Krzymanska et al. 1996). Toi- sessa tutkimuksessa indolyyliglukosino- laattien pitoisuudet olivat 0- ja 00-rypsila- jikkeilla samat, mutta 00-lajikkella niiden osuus oli suurempi kokonaisglukosinolaat- tipitoisuudesta (Bilsborrow et al. 1993a). Erot glukosinolaatti-pitoisuuksissa eri lajikkeiden välillä saattavat olla suuria. Yli 25-kertaisia glukoraphaniini-pitoisuuseroja analysoitiin parsakaalilajikkeista, kun ali- faattisten glukosinolaattien pitoisuuserot ruusukaalin ja kukkakaalin kohdalla vaih- telivat vain kaksin- tai kolminkertaisesti (Kushad et al. 1999). Eri ruusukaalilajikkei- den lehtien glukosinolaatti-pitoisuudet vaihtelivat seitsemänkertaisesti (60–400 mg 100 g-1 FW). Siemenissä oli glu- kosinolaattia noin 30 kertaa enemmän (2000 mg 100 g-1 FW) kuin lehdissä (Hea- ney & Fenwick 1980). 2.4.2.3 Kehitysvaihe Kehitysvaihe on yksi merkittävimmistä te- kijöistä, jotka vaikuttavat glukosinolaattien (Bennett et al. 1996) sekä niitä muistuttavi- en syanogeenisten glukosinolaattien (Ben- nett et al. 1997a) muodostukseen. Jos kasvi kärsii stressistä, saattavat kehitysvaiheen ai- heuttamat muutokset glukosinolaattien synteesissä peittyä muiden tekijöiden alle. Glukosinolaattien biosynteesiä on ha- vaittu jo erilaistumattomassa kalluksessa (Poulsen 1996), vaikka yleensä se vaatii eri- laistuneen solukon (Mevy et al. 1997). Erityisesti lehdissä erityyppisten gluko- sino- laattien muodostuminen riippuu kehi- tysvaiheesta. Monien ristikukkaisten ha- vaittiin muodostavan indolyyliglukosino- laatteja vain nuorissa lehdissä (Bennett et al. 1996). Sen sijaan alkenyyli- ja aromaattis- ten glukosinolaattien muodostuminen al- kaa vasta kasvulehdissä (Bennett et al. 1997b). Näiden glukosinolaattien entsyy- 24 mitoiminta riippuu kehitysvaiheesta ja hi- dastuu solukon vanhetessa (Wallsgrove et al. 1995). Tavallisesti nuoret lehdet sekä lehtiruodit sisältävät enemmän glukosino- laatteja kuin vanhat (Koritsas et al. 1991, Merritt 1996, Bennett et al. 1997a). Poik- keuksena on keltasinappi, jolla vanhimpien lehtien havaittiin sisältävän lähes kolme kertaa enemmän glukosinolaatteja kuin nuorten (Karowe et al. 1997). Pato- geenisaastunnan jälkeen nuoret lehdet li- säävät glukosinolaattien muodostusta enemmän kuin vanhat kasvinosat (Koritsas et al. 1991). Rypsin nuorimman lehden ko- konaisglukosinolaattien, alifaattisen, aro- maattisen ja indolyyliglukosinolaattien pi- toisuudet kasvoivat taimettumisesta 40 vuorokauteen asti, jonka jälkeen pitoisuu- det laskivat tasaisesti tuleentumiseen saak- ka (Porter et al. 1991). Lehtien glukosinolaatti-muutoksista poiketen varsien glukosinolaatti-pitoisuus pysyi melko tasaisena kehitysvaiheesta riip- pumatta (Bennett et al. 1997a). Siementen glukosinolaatti-pitoisuus kasvaa kuivaa ja tuorepainoa kohden aina tuleentumiseen saakka (Milford & Evans 1991). Kasvua ha- vaitaan sekä rapsin 00- että 0-lajikeilla, jois- ta jälkimmäiset yltävät korkeimpiin pitoi- suuksiin (Bilsborrow et al. 1993a). Rikkipitoisten yhdisteiden jakautumi- nen lehdessä muuttuu kehitysvaiheen mu- kana. Nuorten lehtien kokonaisrikki-pitoi- suudesta 2 % esiintyi glutationina, 6 % glu- kosinolaattina, 50 % liukenemattomana rikkinä ja loput 42 % sulfaattina. Vanhoissa lehdissä 70–90 % kokonaisrikistä oli sul- faattina sekä glutationina, ja glukosinolaat- tina oli vain 1 % (Blake-Kalff et al. 1998). Monien kasvien vanhetessa kasvin kyky syntetisoida metioniinia (Doughty et al. 1991), tryptofaania ja fenylalaniinia huo- nontuu, mikä aiheuttaa myös näistä johdet- tavien glukosinolaattien pitoisuuksien vä- henemisen (Doughty et al. 1991, Halkier & Du 1997). 2.4.2.4 Kasvinosa Kasvin glukosinolaatti-koostumusta tut- kittaessa on tärkeää analysoida eri kas- vinosia. Eri osat saattavat nimittäin synte- tisoida täysin erilaisia yhdisteitä, eikä tietyn kasvinosan perusteella voida välttämättä tietää muiden kasvinosien koostumusta. Sinapin sirkkalehdet eivät syntetisoineet al- kenyyli- ja aromaattisia glukosinolaatteja, joita täysikasvuiset lehdet taas tuottivat (Bennett et al. 1997b). Glukosinolaatti-koostumuksen lisäksi glukosinolaattien pitoisuudet saattavat vaihdella paljon eri kasvinosien välillä (Haughn et al. 1991, Ludwig-Müller et al. 1997). Vaihtelut glukosinolaattien pitoi- suuksissa saattavat olla seurausta eri kas- vinosien erilaisista entsyymiaktiivisuuksis- ta. Peroksidaaseja on paikannettu kaikista rypsin ja kiinankaalin solukoista, mutta fla- vin-tyyppisten mono-oksygenaasi-entsyy- mien aktiivisuutta ei ole havaittu sirkkaleh- distä, eikä vanhoista lehdistä (Halkier & Du 1997). Vaikka siementen ja nuorten taimien glukosinolaatti-pitoisuuksilla ei näyttänyt- kään olevan yhteyttä, korreloivat litujen ja kolme-neljä viikkoa ennen korjuuta tuleen- tuneiden siementen glukosinolaattipitoi- suudet toisiaan (Milford & Evans 1991). Tämä saattaa johtua siitä, että glukosino- laatit kuljetetaan lidun seinämäsolukoista siemeniin, jotka eivät itse pysty syntetisoi- maan glukosinolaatteja. Siemenet ovat siis glukosinolaattien kohdesolukoita ja litujen seinämät lähdesolukoita (Bilsborrow et al. 1993a, Toroser et al. 1995). Litujen lisäksi muut kasvinosat saattavat toimia glu- kosinolaattien synteesipaikkoina (Bilsbor- row et al. 1993a). Litujen sijainti rypsin ku- kinnossa vaikuttaa muodostuvien siemen- ten glukosinolaatti-pitoisuuteen. Kukin- non alaosan lituihin muodostuu siemeniä, joiden glukosinolaatti-pitoisuus on yläosas- sa kasvavia suurempi (Booth & Walker 1990, Milford & Evans 1991). Juuret sisältävät maanpäällisiä osia enemmän glukosinolaatteja sekä nuorissa että korjuuvaiheessa olevilla kasveilla (Rosa 25 & Rodrigues 1998). Lehtien ja juurten glu- kosinolaatti-pitoisuuksien havaittiin olevan kääntäen riippuvaisia toisistaan ja vaihtele- van ultraradiaanisen rytmin mukaisesti. Kun pitoisuus oli lehdissä korkein, oli se juurissa alhaisin ja päinvastoin (Rosa & Rod- rigues 1998). Retiisillä juuren alaosa sisälsi yli kolme kertaa enemmän glukosinolaatte- ja kuin yläosa ja kuoriosa 10–50 % enem- män kuin juuren sisäosa (Lee et al. 1996). Pääjuuren on havaittu sisältävän korkeam- pia bentsyyliglukosinolaatti- sekä syano- geenisten glukosinolaattien pitoisuuksia kuin nuoret sivujuuret (Bennett et al. 1997a). 2.4.2.5 Satokomponentit Glukosinolaatti-pitoisten kasvien kuten rypsin, rapsin ja sinapin siemensato muo- dostuu satokomponenteista, joita ovat tu- hannen siemenen paino, siementen luku- määrä lidussa, litujen lukumäärä kasvissa sekä kasvitiheys neliömetriä kohden. Sadon ja satokomponenttien merkitystä glu- kosinolaatti-pitoisuudessa on tutkittu var- sin vähän. Rypsin glukosinolaatti-pitoisuu- den havaittiin laskevan jopa puoleen, kun siementen määrä lidussa kolminkertaistui (40 → 120 kpl m2). Tämä saattoi olla seu- rausta siitä, että litujen glukosinolaatti-va- rasto jakautui useammalle siemenelle. Tämä puolestaan johti siemenen glu- kosinolaatti-väkevyyden laskemiseen (Mil- ford & Evans 1991). Tuhannen siemenen painon lisääntymi- nen nosti rypsin siementen glukosinolaat- ti-pitoisuutta suoraviivaisesti (Jensen et al. 1996). Tämä ilmeisesti aiheuttaa siementen tilavuuspainon (kg/m3) kasvua. Tästä oli seurauksena glukosinolaattien lisääntymi- nen siemenissä. Korkea glukosinolaatti-pi- toisuus paransi siementen itävyyttä (Velas- co et al. 1998). Primääriaineenvaihdunnan tuloksena muodostuva öljy kuvaa öljykasveilla sadon laatua. Koska glukosinolaatit muodostuvat primäärisistä aineenvaihduntatuotteista, on oleellista tuntea eri tekijöiden riippuvuus toisistaan. Öljykasvitutkimuksessa määri- tettiin yhteensä 455 rapsilinjan sekä 44 ryp- silinjan öljy- ja glukosinolaatti-pitoisuudet. Öljy- ja glukosinolaatti-pitoisuuden välillä oli selvä yhteys molempien kasvilajien koh- dalla: korrelaatio oli positiivinen rypsillä (+0,39) ja negatiivinen rapsilla (-0, 14) (Bhardwaj & Hamama 2000). 2.5 Glukosinolaattien modifiointi Glukosinolaatin biologinen vaikutus riip- puu glykonin sekä aglykonin ominaisuuk- sista. Tämän takia jalostuksessa on mahdol- lista tarkastella molekyylin molempia osia. Jalostuksen mahdollisia menetelmiä ovat: glukosinolaatin kokonaismäärän lisäämi- nen tai vähentäminen, sivuketjun raken- teen manipulointi, uusien glukosinolaattien tuottaminen tai ajallisen ja paikallisen glu- kosinaatti-biosynteesin muuttaminen (Mit- hen & Campos 1996). Viidentenä vaihtoeh- tona on vaikuttaa tärkeiden välittäjäainei- den kuten glukosinolaattien esiintymiseen vaikuttavien hormonien pitoisuuteen. Esi- merkiksi salisyylihapon on todettu in- dusoivan juuri FMO-entsyymiä säätelevää geeniä (Wallsgrove et al. 1995), kun taas jasmonaattien ja askorbiinihappojen on to- dettu vaikuttavan myrosinaasin aktiivisuu- teen. Ristikukkaisten käyttöä rehukasvina on rajoittanut niiden sisältämät haitalliset glu- kosinolaatit. Klassisen kasvinjalostuksen avulla on pystytty poistamaan tai vähentä- mään oleellisesti rypsillä ja rapsilla esiinty- viä glukosinolaatteja (Brown et al. 1997, Halkier & Du 1997). Nykyään Suomessa viljeltävien lajikkeiden glukosinolaatti-pi- toisuudet ovatkin alhaiset. Öljykasvien 00-lajikkeet ovat malliesimerkkejä jalos- tuksen mahdollisuuksista muokata kasvien sekundääriaineenvaihduntaa (Chen & Heneen 1996). Tämän hetkinen kiinnostus on kohdis- tunut geenitekniikkaan ja sen mahdolli- suuksiin säädellä glukosinolaatti-biosyn- teesiä tai glukosinaattien hydrolyysiin liit- tyvien geenien toimintaa (Halkier & Du 26 1997). Kohteena voi olla sekä glukosino- laattien biosynteesi tai/ja myrosinaasin toi- minta (Bones & Rossiter 1996). Glu- kosinolaattien synteesiin ja niiden hydro- lyysiin liittyvien geenien toiminnat ovat usein riippuvaisia kasvinosasta tai kehi- tysasteesta. Tämä riippuu mm geenien toi- mintaan vaikuttavista tekijöistä, jotka saat- tavat olla aktiivisia vain tietyn aikaa tai tie- tyssä kehitysvaiheessa. Ajallisesti ja paikal- lisesti rajoittuneiden geeniaktiivisuuteen vaikuttavien tekijöiden hyväksikäyttö on- kin yksi mahdollisuus, kun glukosinolaat- tien synteesiä halutaan geeneettisesti muut- taa (Magrath et al. 1994). Glukosinolaatteihin liittyvän tiedon li- sääntyminen mahdollistaa yhdisteiden käy- tön esimerkiksi kemiallisina markkereina tutkittaessa kasvisolukon erilaistumista (Mevy et al. 1997). Kehitettyjen molekyyli- markkereiden avulla on mahdollista valita suuresta geenipopulaatiosta esimerkiksi runsaasti glukosinolaatteja tuottavat geno- tyypit, joilla saattaa kuitenkin olla hyvä tautien tai tuholaisten kestävyys (Campos de Quiroz & Mithen 1996). Biosynteeseihin vaikuttavien tekijöiden tunteminen yhdes- sä geeni- ja bioteknisten menetelmien kans- sa mahdollistavat sen, että glukosinolaat- tien modifioinnille voidaan asettaa uudet tavoitteet. Mielenkiintoinen tavoite voisi olla entistä terveellisempien ja kasvinsuoje- lua edistävien glukosinolaattien jalostami- nen eräisiin Suomessa viljeltyihin ristikuk- kaisiin. Kirjallisuus Andreasson, E. 2000. Structural and functional studies of the myrosinase-glucosinolate system in Arabidopsis thaliana and Brassica napus. Doctoral thesis. Uppsala: Swedish University of Agricultural Sciences. Agraria 208, 41 p. ISBN 91-576-5727-0. Asare, E. & Scarisbrick, D.H. 1995. Rate of nitro- gen and sulphur fertilizers on yield, yield compo- nents and seed quality of oilseed rape (Brassica napus L.). Field Crops Research 44: 41–46. Bending, G.D. & Lincoln, S.D. 1999. Characteri- sation of volatile sulphur-containing compounds produced during decomposition of Brassica juncea tissues in soil. Soil Biology and Biochemistry 31: 695–703. Bennett, R.N., Hick, A.J., Dawson, G.W. & Wallsgrove, R.M. 1995. Glucosinolate biosynthesis. Plant Physiology 109: 299–305. –, Kiddle, G., Hick, A.J., Dawson, G.W. & Wallsgrove, R.M. 1996. Distribution and acticity of microsomal NADPH-dependent monooxygenases and amino acid decarboxylases in cruciferous and non-cruciferous plants, and their relationship to fo- liar glucosinolate content. Plant, Cell and Environ- ment 19: 801–812. –, Kiddle, G. & Wallsgrove, R.M. 1997a. Biosynthesis of benzylglucosinolate, cyanogenic clucosides and phenylpropanoids in Carica papaya. Phytochemistry 45: 59–66. –, Kiddle, G. & Wallsgrove, R.M. 1997b. Involment of Cytochrome P450 in glucosinolate biosynthesis in white mustard. Plant Physiology 114: 1283– 1291. Bhardwaj, H.L. & Hamama A.A. 2000. Oil, erucic acid, and glucosinolate contents in winter hardy rapeseed germplasms. Industrial Crops and Prod- ucts 12: 33–38. Bilsborrow, P.E., Evans, E.J., Murray, F. & Zhao, F.J. 1993a. Glucosinolate changes in developing pods of single and double low varieties of au- tumn-sown oilseed rape (B. napus). Annals Applied Biology 122: 135–143. –, Evans, E.J. & Zhao, F.J. 1993b. The influence of spring nitrogen on yield, yield component and glucosinolate content of autumn-sown oilseed rape (Brassica napus). Journal of Agricultural Science, Cambridge 120: 219–224. Blake-Kalff , M.M.A., Harrison, K.R., Hawkwsford, M.J., Zhao, F.J. & McGrath S.P. 1998. Distribution of sulfur within oilseed rape 27 leaves in response to sulfur deficiency during vege- tative growth. Plant Physiology 118: 1337–1344. Bones, A.M. 1990. Distribution of β-thiglucosidase activity in intact plants, cell and tissue cultures and regenerant plants of Brassica napus L. Journal of Experimental Botany 41: 737–744. – & Iversen, T.H. 1985. Myrosin cells and myrosinase. Israel Journal of Botany 34: 351–376. – & Rossiter, J.T. 1996. The myrosinase- glucosinolate system, its organization and bio- chemistry. Physiologia Plantarum 97: 194–208. Booth, E.J. & Walker, K.C. 1990. Effect of harvest date and pod position on glucosinolates in oilseed rape (Brassica napus). Journal of the Science of Food and Agriculture 53: 43–61. – & Walker, K.C. 1994. Consequences of cruciferous weed contamination on rapeseed qual- ity and the effect of differing sulphur availability. 3. Congress of the European Society for Agronomy, Padova University, Albano-Padova. p. 582–583. –, Walker, K.C. & Schnug, E. 1991. The effect of site, foliar sulphur and nitrogen application on glucosinolate content and yield of oilseed rape (Brassica napus L.). In: Proceedings of 8th Interna- tional Rapeseed Congress. GCIRC, Saskatoon, Canada. p. 567–572. Bouchereau, A., Clossais-Besnard, N., Ben- saoud, A., Leport, L. & Renard, M. 1996. Water stress effects on rapeseed guality. European Jour- nal of Agronomy 5: 19–30. Brown, J., Brown, A.P., Davis, J.B. & Erickson, D. 1997. Intergeneric hybridization between Sinapis alba and Brassica napus. Euphytica 93: 163–168. Brudenell, A.J.P., Griffiths, H., Rossiter, J.T. & Bakes, D.A. 1999. The phloem mobility of glucosinolates. Journal of Experimental Botany 50: 745–756. Campos de Quiroz, H. & Mithen, H. 1996. Molecu- lar markers for low-glucosinolate alles in oilseed rape (Brassica napus L.). Molecular Breeding 2: 277–281. Champolivier, L. & Merrien, A. 1996. Effects of water stress applied at different growth stages to Brassica napus L. var. oleifera on yield, yield com- ponents and seed quality. European Journal of Agronomy 5: 153–160. Chen, B.Y. & Heneen, W.K. 1996. A novel Brassica campestris with no glucosinolate aliphatic compo- nents. Cruciferae newsletter 28: 82–83. Ciska, E., Martyniak-Przybyszewska, B. & Kozlowska, H. 2000. Content of glucosinolates in cruciferous vegetables grown at the same site for two years under different climatic conditions. Jour- nal of Agricultural and Food Chemistry 48: 2862– 2867. –, Piskula, M., Martyniak-Przybyszewska, B., Waszczuk, K. & Kozlowska, H. 1994. Gluco- sinolates in various cabbage cultivars grown in Po- land. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences 3: 119–126. Cole, R.A. 1997. The relative importance of glucosinolates and amino acids to the development of two aphid pests Brevicoryne brassicae and Myzus persicae on wild and cultivated brassica spe- cies. Entomologia Experimentalis et Applicata 85: 121–133. Doughty, K.J., Blight, M.M., Bock, C.H., Fieldsend, J.K. & Pickett, J.A. 1996. Release of isothiocyanates and other volatiles from Brassica rapa during infection by Alternaria brassicae. Phytochemistry 43: 371–374. –, Porter, A.J.R., Morton, A.M., Kiddle, G., Bock, C.H. & Wallsgrove, R. 1991. Variation in the glucosinolate content of oilseed rape (Brassica napus L.) leaves. II. Response to infection by Alternaria brassicae (Berk.) Sacc. Annals Applied Biology 118: 469–477. Du, L. & Halkier, B.A. 1996. Isolation of micro- somal enzyme system involved in glucosinolate biosynthesis from seedlings of Tropaeolum majus L. Plant Physiology 111: 831–837. –, Lykkesfeldt, J., Olsen, C.E., & Halkier, B.A. 1995. Involment of cytochrome P450 in oxime pro- duction in glucosinolate biosynthesis as demon- strated by an in vitro microsomal enzyme system isolated from jasmonic acidinduced seedlings of Sinapis alba L. Plant Biology 92: 12505–12509. Eriksson, S. 2000. Structural and functional stud- ies of myrosinases and associated proteins in Bras- sica napus and Sinapsis alba. Doctoral thesies. Uppsala: Swedish University of Agricultural Sci- ences. Agraria 216. 48 p. ISBN 91-576-5743-2. Falk, A., Xue, J., Lenman, M. & Rask, L. 1992. Se- quence of a cDNA clone encoding the enzyme myrosinase and expression of myrosinase in differ- ent tissues of Brassica napus. Plant Science 83: 181–186. Fischer, J. 1992. The Influence of different nitrogen and potassium fertilization on the chemical flavour composition of kohlrabi (Brassica oleracea var gongylodes L). Journal of the Science of Food and Agriculture 60: 465–470. 28 Giamoustaris, A. & Mithen, R. 1996. Genetics of aliphatic glucosinolates. IV. side-chain modification in Brassica oleracea. Theoretical and Applied Ge- netics 93: 1006–1010. Gijzen, M., McGregor, I. & Seguin-Swartz G. 1989. Glucosinolate uptake by developing rape- seed embryos. Plant Physiology 89: 260–263. Gleadow, R.M., Foley, W.J. & Woodrow, I.E. 1998. Enhanced CO2 alters the relationship be- tween photosynthesis and defence in cyanogenic Eucalyptus cladocalyx F. Muell. Plant, Cell and En- vironment 21: 12–22. Halkier, B.A. & Du, L. 1997. The biosynthesis of glucosinolates. Trends in Plant Science Reviews 2: 425–431. Haughn, G.W., Davin, L., Giblin, M. & Underhill, E.W. 1991. Biochemical genetics of plant second- ary metabolites in Arabidopsis thaliana. Plant Phys- iology 97: 217–226. Heaney, R.K. & Fenwick, R.G. 1980. Glucosi- nolates in Brassica vegetables. Analysis of 22 vari- eties of Brussels sprout (Brassica oleracea var. gemmifera). Journal of the Science of Food and Ag- riculture 31: 785–793. Hocking, P.J., Pinkerton, A. & Good, A. 1996. Re- covery of field-grown canola from sulfur deficiency. Australian Journal of Experimental Agriculture 36: 79–85. Hrncirik, K. & Velišek, J. 1997. Glucosinolate con- tent of common Brassicaceae family vegetables. Potravinárské Védy 15: 161–172. Höglund, A-S., Lenman M., Falk A. & Rask L. 1991. Distribution of myrosinase in rapeseed tis- sues. Plant Physiology 95: 213–221. Iversen, T.H. 1970. Cytochemical localization of myrosinase (β-thioglucosidase) in root tips of Sinapis alba. Protoplasma 71: 451–466. Jensen, C.R., Mogensen, V.O., Fieldsend, J.K., Milford, G.F.J., Andersen, M.N. & Thage, J.H. 1996. Seed glucosinolate, oil and protein contents of field-grown rape (Brassica napus L.) affected by soil drying and evaporative demand. Field Crops Research 47: 93–105. Jonsson, H. 1996. Svavel och svavlets samspel med kväve. Inverkan på olika grödors avkastning och kvalitet. Kungliga skogs- och lantbruksakade- miens Tidskrift 6: 51–56. Karowe, D.N., Seimens, D.H. & Mitchell-Olds, T. 1997. Species-specific response of glucosinolate content to elevated atmospheric CO2. Journal of Chemical Ecology 23: 2569–2582. Kelly, P.J., Bones, A. & Rossiter, J.T. 1998. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta 206: 370–377. Kimura, M., Tsushima, K., Kouno, I., Ichimura, M., Tomitaka, Y., Ito, H. & Anan, T. 1995. Pungent component concentrations of blanched japanese radish seedlings as affected by lighting period. Acta Horticulturae 390: 59–65. Koritsas, V.M., Lewis, J.A. & Fenwick, G.R. 1991. Glucosinolate responses of oilseed rape, mustard and kale to mechanical wounding and infestation by cabbage stem flea beetle (Psylliodes chryso- cephala). Annals Applied Biology 118: 209–221. Krzymanska, J., Lisiecka, E. & Nawrot, D. 1996. The content and composition of glucosinolates in genetically different varieties of oilseed rape (Bras- sica napus L.). Journal of Plant Protection Research 37: 104–108. Kundu, S. & Dhaka, R.P.S. 1996. Protein, oil and glucosinolate contents in some elite genotypes of Indian mustard (Brassica juncea L. (Czern & Coss). Journal Oilseeds Research 13: 149–150. Kushad, M.M., Brown, A.F., Kurilich, A.C., Juvik, J.A., Klein, B.A., Wallig, M.A. & Jeffery, E.H. 1999. Variation of glucosinolates in vegetable crops of Brassica oleracea. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47: 1541–1548. Lee, J-H., Yoo, I-O. & Min, B-H. 1996. Effect of cultivars and culture conditions on the punget princi- ple contents in radish roots. Journal of Korean Soci- ety for Horticultural Science 37: 349–356. Lenman, M., Falk, A., Xue, J. & Rask, L. 1993. Characterization of a Brassica napus myrosinase pseudogene: myrosinases are members of the BGA family of beta-glycosidases. Plant Molecular Biology 21: 463–474. Ludvig-Müller, J., Krishna, P. & Forreiter, C. 2000. A glucosinolate mutant of arabidopsis is thermosensitive and defective in cytosolic Hsp90 expression after heat stress. Plant Physiology 123: 949–958. –, Schubert, B., Pieper, K., Ihmig, S. & Hilgenberg, G. 1997. Glucosinolate content in suscebtible and resistant Chinese cabbage variet- ies during development of clubroot disease. Phytochemistry 44: 407–414. Magrath, R., Bano, F., Morgner, M., Parkin, I., Sharpe, A., Lister, C., Dean, C., Turner, J., Lydiate, D. & Mithen, R. 1994. Genetics of aliphatic 29 glucosinolates. I. Side chain elongation in Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Heredity 72: 290–299. –, Herron, C., Giamoustaris, A. & Mithen, R. 1993. The inheritance of aliphatic glucosinolates in Brassica napus. Plant Preeding 111: 55–72. Merritt, S.Z. 1996. Within-plant variation in concen- trations of amino acids, sugar and sinigrin in phloem sap of black mustard, Brassica nigra (L.) Koch (Cruciferae). Journal of Chemical Ecology 22: 1133–1145. Mevy, J.P., Rabier, J., Quinsac, A., Krouti, M. & Ribaillier, D. 1997. Glucosinolate contents of re- generated plantlets from embryoids of horseradish. Phytochemistry 44: 1469–1471. Milford, G.F.J. & Evans, E.J. 1991. Factors caus- ing variation in glucosinolates in oilseed rape. Out- look on Agriculture 20: 31–37. Mithen, R. & Campos, H. 1996. Genetic variation of aliphatic glucosinolates in Arabidopsis thaliana and prospects for map based gene cloning. Entomologia Experimentalis et Applicata 80: 202–205. Porter, A.J.R., Morton, A.M., Kiddle, G., Doughty, K.J. & Wallsgrove, R.M. 1991. Variation in the glucosinolate content of oilseed rape (Bras- sica napus L.) leaves. I. Effect of leaf age and posi- tion. Annals Applied Biology 118: 461–467. Poulsen, G.B. 1996. Glucosinolates in callus cul- ture of Brassica napus. Cruciferae Newsletter 18: 32–33. Rodman, J.E. 1991. A taxonomic analysis of glucosinolate-producing plants, part 1: phenetics. Systematic Botany 16: 598–618. Rosa, E.A.S. 1997. Daily variation in glucosinolate concentrations in the leaves and roots of cabbage seedlings in two constant temperatura regimes. Journal of the Science of Food and Agriculture 73: 364–368. – & Heaney, R. 1996. Seasonal variation in protein, mineral and glucosinolate composition of Portu- guese cabbages and kale. Animal Feed Science Technology 57: 111–127. –, Heaney, R.K., Portas, C.A.M. & Fenwick, G.R. 1996. Changes in glucosinolate concentrations in Brassica crops (B. oleracea and B. napus) through- out growing seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture 71: 237–244. – & Rodrigues, P.M.F. 1998. The effect of light and temperature on glucosinolate concentration in lhe leaves and roots of cabbage seedlings. Journal of the Science of Food and Agriculture 78: 208–212. Schnug, E. 1989. Double low oilseed rape in West Germany: sulphur nutrition and glucosinolate lev- els. Aspects of Applied Biology 23: 67–82. – 1990. Glucosinolates – fundamental, environ- mental and agricultural aspects. In: Rennenberg, H. et al. (eds.). Sulfur nutrition and sulphur assimilation in higher plants. Hague: SPB Academic Publishing. p 97–106. ISSN 90-5103-038-X. –, Haneklaus, S., Borchers, A. & Polle, A. 1995. Relations between sulphur supply and glutathione and ascorbate concentrations in Brassica napus. Zeitschrift Pflanzenernährung und Bodenkunde 158: 67–69. Schreiner, von, M., Schonhof, I. & Krumbein, A. 1998. Neue Dimension der Produktqualität-Bioakti- ve Substanzen im Gemüse. Gemüse 34: 80–84. Sharma, A. & Garg, S.K. 1996. Myrosinase activity in Brassica spp. Crop Research 11: 106–110. Siemens, H.D. & Mitchell-Olds, T. 1998. Induced defenses in Brassica plants: Evolution of pest- tests of theory. Ecology 79: 632–646. Sørensen, H. 1990. Glucosinolates: Structure, properties, function. In: Shahidi, F. (ed.). Canola and Rapeseed: Production, chemistry, nutrition and processing technology. New York: Van Norstrand Reinhold. p. 149–172. ISBN 0-442-00295-5. Springett, M.B. & Adams, J.B. 1989. Properties of Brussels sprouts thioglucosidase. Food Chemistry 33: 173–186. Taipalensuu, J., Andreasson, E., Eriksson, S. & Rask, L. 1997. Regulation of the wound-induced myrosinase-associated protein transcript in Brass- sica napus plants. European Journal of Biochemis- try 247: 963–971. –, Falk, A. & Rask, L. 1996. A Wound- and methyl jasmonate-inducible transcript coding for a myrosinase-associated protein with similarities to an early nodulin. Plant Physiology 110: 483–491. Thangstad, O.P., Winge, P., Husebye, H. & Bones, A. 1993. The myrosinase (thiglucoside glucohydrolase) gene family in Brassicaceae. Plant Molecular Biology 23: 511–524. Toroser, D., Wood, C., Griffiths, H. & Thomas, D.R. 1995. Glucosinolate biosynthesis in oilseed rape (Brassica napus L.) studies with 35SO4 2- and glucosinolate precursors using oilseed rape pods and seeds. Journal of Experimental Botany 46: 787–794. 30 van der Kooij, T.A.W., De Kok, L.J., Haneklaus, S. & Schnug, E. 1997. Uptake and metabolism of sulphur dioxide by Arabidopsis thaliana. New Phy- tology 135: 101–107. Velasco, L., Fernández-Martínez, J.M. & De Haro, A. 1998. Increasing erucic acid content in Ethiopian mustard through mutation breeding. Plant Breeding 117: 85–87. Velísek, J., Mikulcová, R., Míková, K., Kassahun, B.W., Link, J. & Davídek, J. 1995. Chemometric in- vestigation of mustard seed. Potravinárské Védy 13: 1–12. Wallsgrove, M.R., Bennett, N.R., Doughty, J.K., Schrijvers S. & Kiddle, G. 1995. Glucosinolate metabolism in diseased plants. Aspects of Applied Biology 42: 251–256. Xue, J., Jorgensen, M., Pihlgren, U. & Rask, L. 1995. The myrosinase gene family in Arabidopsis thaliana: gene oranization, expression and evolu- tion. Plant Molecular Biology 27: 911–922. –, Lenman, M., Falk, A. & Rask, L. 1992. The glucosinolate-degrading enzyme myrosinase in Brassicaceae is encoded by a gene family. Plant Molecular Biology 18: 387–398. –, Pihlgren, U. & Rask, L. 1993. Temporal, cell-specific, and tissue-preferential expression of myrosinase genes during embryo and seedling ex- pression of myrosinase genes during embryo and seedling development in Sinapis alba. Planta 191: 95–101. Yusuf, S.W. & Collins, G.G. 1998. Effect of soil sul- phur levels on feeding preference of Brevicoryne brassicae on Brussels sprouts. Journal of Chemical Ecology 24: 417–424. Zhao, F., Evans, E.J., Bilsborrow, P.E. & Syerrs, J.K. 1993. Influence of sulphur and nitrogen on seed yield and quality of low glucosinolate oilseed rape (Brassica napus L). Journal of the Science of Food and Agriculture 63: 29–37. –, Evans, E.J., Bilsborrow, P.E. & Syerrs, J.K. 1994. Influence of nitrogen and sulphur on the glucosinolate profile of rapeseed (Brassica napus L). Journal of the Science of Food and Agriculture 64: