Metsäntutkimuslaitos Kolarin tutkimusaseman tiedonantoja 27. 12. 1973 Martti Ryynänen Vajaasti tuleentuneiden männyn alkioiden luokittelu ja kasvatus Alkusan at Pohjois-Suomessa ja erityisesti Lapissa männyn siemenen kehittyminen ei yleensä ole vielä päättynyt kasvukauden lopussa. Epäedullisten ilmasto-olojen vaikutuksesta suuri, usein suurin osa Lapin männyn siemensadosta on vajaasti tuleentunutta. Metsäntutkimuslaitoksen Kolarin tutkimusaseman työohjelmaan kuuluu laaja tutkimus geneettisen informaation ja ilmaston vuoro vaikutuksista marginaalipopulaatioissa. Vajaasti tuleentuneen siemenen käyttöarvon tutkiminen katsottiin sopivaksi lähtökoh daksi männyn siemenen tuleentumista koskevaan selvitykseen ja samalla se on alkuosa edellä mainitusta isommasta tutkimuksesta. Tutkimus on tehty osaksi Helsingin yliopiston kasvitie teen laitoksella ja osaksi Metsäntutkimuslaitoksen Kolarin tut kimusasemalla. Aiheen ovat antaneet professori Veijo Y/artiovaara ja dosentti Veikko Koski, ja heiltä olen saanut ratkaisevasti tukea työssäni. Maat. metsät, lisensiaatti Erkki Numminen on esimiehenäni suh tautunut hyvin myötämielisesti työhöni, ja hän on myös tarkas tanut käsikirjoituksen kieliasun. Vaimoni LuK Leena Ryynänen on auttanut suuresti laboratoriotöissä. Yllä mainituille ja kaikille muille työssä avustaneille esitän parhaim mat kiitokseni. Kolarissa 1973-12-15 Martti Ryynänen Sisällysluettelo 1. Johdanto 1 2. Tutkimusaineisto ja menetelmät. 2 2.1. Siementen luokittelu ja idätys 2 2.2. Alkioiden kasvatuskokeet ..... 4 3. Tulokset ja niiden tarkastelu .. 5 4. Yhteenveto 17 Liitteet KIRJALLISUUTTA 1. Johdanto Kotimainen mänty (Pinus silvestris L 0) kasvaa Fennoskan diassa laajan levinneisyysalueensa pohjoisimmalla rajalla. Poh jois-Suomessa karut ilmasto-olot vaikeuttavat suuresti männyn uudistumista» Lapissa männyn siemenen tuleentuminen on yleensä vielä kesken kasvukauden päättyessä ja siemen jää laadullisesti heikoksi, vajaasti tuleentuneeksi» Usein -toistuvien huonojen siemenvuosien takia on varsinkin Skandinavian pohjoisosissa jo varhain kiinnitetty huomiota sie menen laatuun. Siemeniä on luokiteltu niiden käyttöarvon mukaan pääasiallisesti rakenteellisten, anatomisten ominaisuuksien avul la. Suomen olojen osalta HEIKINHEIMO (1921) ja KUJALA (1927) luokittelivat siemenet alkion 1. embryon ja siemenvalkuaisen 1. endospermin keskinäisten suhteiden mukaan. Ruotsissa kehitettiin siementen röntgenkuvaus 1950-luvun alussa (SIMAK ja GUSTAFSSON 1953 a ja h). Vuonna 1954 SIMAK ja GUSTAFSSON paransivat ja tarkensivat omaa luokitustaan. He luo kittelivat siemenet alkion pituuden ja alkio-ontelon pituuden suhteen perusteella. Tyhjä siemen kuuluu luokkaan 0, luokan I siemenissä on alkio-ontelo mutta ei alkiota, 11-luokassa alkio on pituudeltaan alle puolet alkio-ontelosta, 111-luokassa 1/2 - 3/4 alkio-ontelosta, ja täydet siemenet kuuluvat luokkaan IV. Yleisesti voitaneen sanoa,.että siemenluokkien 0-IV esiin tyminen ja varsinkin vaihtelu on osoitus häiriintyneestä alkion kehityksestä. LOGRAn (1967) mukaan varhaisalkioiden kuoleminen on todennäköisesti tärkein syy tyhjien siementen muodostumiseen. Embryologisissa tutkimuksissaan hän ei löytänyt yhtään täysin tyh jää edes 0-luokan siemenistä. I-luokkaan kuuluvissa siemenissä 2 oli kehittynyt endospermi ja alkio-ontelo, mutta röntgenkuvissa alkiota ei näkynyt. Todellisuudessa monet (30-50 i°) näistä sie menistä sisälsivät alkioita, jotka olivat varhaisalkiovaihetta pitemmälle kehittyneitä. Metsänuudistus pohjoisella marginaalialueella on suuresti riippuvainen sopivan männynsiemenen saannista. Sopivana voita neen pitää näihin oloihin- geneettisesti mahdollisimman hyvin so peutunutta materiaalia, jota käytännössä on paikallinen siemen. Hyviä siemenvuosia on tällä alueella harvoin, noin kymmenen vuoden välein. Metsäuudistusta vaikeuttaa vielä se, että näiden hyvien vuosien jälkeen tulisi ilmasto-olojen olla suotuisia myös taimien kunnolliselle kehittymiselle. Siemenen kehityksen ja tuleentumisen riippuvuus ilmastos ta lienee katsottava fysiologiseksi tapahtumaketjuksi. Fysio logian menetelmiä on havupuiden siementen tutkimisessa käytetty jo muutamien vuosien ajan varsinkin Japanissa, Kanadassa ja • USA:ssa. Taimituotannon fysiologista taustaa selvittävillä tut kimuksilla ja tutkimusmenetelmillä on todennäköisesti tulevaisuu dessa merkitystä myös ns. siemenviljelyssiemenen geneettisten ominaisuuksien selvittämisessä. Tässä tutkimuksessa on pyritty selvittämään männyn siemen ten vajaatuleentuneisuusastetta ja eri kehitysasteella olevien siementen itämistä ja alkioiden kasvua fysiologisten kasvatusme netelmien avulla. 2. Tutkimusaineisto ja menetelmät 2.1. Siementen luokittelu ja idätys Vajaasti tuleentuneen materiaalin saamiseksi kerättiin 3 syksyllä 1969 siemeniä arvioidun männynsiemenen tuleentumisrajan molemmin puolin Kolarista, Kittilästä, Sallasta, Suomussalmelta ja Sodankylästä. Siemenet röntgenkuvattiin ja luokiteltiin Met säntutkimuslaitoksella käytettävän luokituksen mukaan (liite 1). Huonon tuleentumisen takia siementen itävyys oli hyvin alhainen vaihdellen nollasta (Sodankylä, Vuotso) 27 prosenttiin (Kolari, Pohjasenvaara). Jatkokokeisiin kerättiin siemeniä puittain Kola rista, Pohjasenvaarasta, numeroiduista puista. Karistuksen jälkeen siemenet röntgenkuvattiin Ruotsinkylän jalostusasemalia. Esikokeissa oli todettu, että käytettäessä sekä SIMAK ja GUSTAFSSONin (1954) että Metsäntutkimuslaitoksen t luokittelua varsinkin luokan II siemenillä hajonta oli suuri. Tästä syystä tarkennettiin siementen luokittelu tutkimukseen so pivaksi jakamalla täydet siemenet alkion koon mukaan seitsemään luokkaan liitteen 2 mukaisesti. Idätyskokeet tehtiin Helsingin yliopiston kasvitieteen laitoksella. Siemeniä valaistiin 12 tuntia vuorokaudessa valais tuksen ollessa n. 1000 luksia ja lämpötilan +2O + I°C. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Saman erän siemeniä idätettiin myös petrimaljassa ravintoagaralustalla. Alustana oli MS-alusta so lukkoviljelyä varten (MURASHIGE ja SKOOG 1962, liite 3). Alku peräisestä valmistusohjeesta poikettiin sikäli, että huonosti säilyvän lAA:n (ji -indolyylietikkahappo) tilalla käytettiin vas taavaa synteettistä auksiinia 2,4-D:a (2,4-dikloorifenoksietik kahappo). Tulokset ovat taulukossa 2. Sopivan kasvuaineyhdistelmän löytämiseksi tutkittiin sekä kuorittujen että kuorimattomien siementen itämistä erilaisilla MS-alustoilla. Siemenet steriloitiin 2 min 3,3 piisellä natrium hypokloriitilla. Osa kuorittiin aseptisesti ns. laminaari siirrostuskaapissa Ja siirrettiin petrimaljoihin, osa siirrostet 4 tiin kuorimattomina. Kokeiltavina oli kolme alustaa, joista MS 1 sisälsi makro- ja mikroravinteiden ja vitamiinien lisäksi 0,1 ppm kinetiiniä ja 2 ppm 2,4-D:a. MS 2:ssa oli näiden asemesta 10 i» ( v /V) kookosmaitoa ja MS 3:sta kasvuaineet puuttuivat. Tu lokset on esitetty taulukossa 3. Alustoihin käytetyistä kemikaaleista pääosa oli E.Merck AG Darmstadt -valmisteita. Pyridoksiinin ja tiamiinin oli valmistanut P. Hoffman - La Roche & Co, Basel, mesoinositolin ja 2,4-D:n Pluka AG, Buchs SG. Kinetiinin toimitti Sigma Chem. Co.USA. Agarina oli Difcon (USA) Bacto-agar, sakkaroosi oli BDH:n (Englanti) Analar-valmiste. Käytettyjen reagenssien puh tausaste oli yleensä pro analysi tai purissimum, 2,4-D oli purum -astetta. Kasvualustaa varten tehtiin makroravinteista 10-kertainen kantaliuos, jota säilytettiin jääkaapissa +4° C. Mikroravinteiden kantaliuos oli 100-kertainen ja säilytys samoin +4° C. Vitamiinit, glysiini ja mesoinositoli olivat 2000-kertaisena kantaliuoksena, jota säilytettiin jäädytettynä -18° C. 2,4-D- ja kinetiiniliuok set tehtiin uudelleen joka kerran. 2.2. Alkioiden kasvatuskokeet Siementen vitaliteetti selvitettiin taustatiedoksi yksit täisten alkioiden kasvatuskokeisiin määrittämällä siementen itä vyys ja itämistarmo (taulukko 4). Kahden puun (73 ja 69) siemenillä tutkittiin eri siemen luokkiin kuuluvien alkioiden kasvamista sekä pelkällä agar-alus talla, että erilaisilla MS-alustoilla. Siemenet kuorittiin ja steriloitiin 2 min 3»3 piisellä Na0Cl:lla. Vesihuuhtelun (3-4 t) jälkeen siemenet halkaistiin preparointimikroskoopin alla 5 siirrostuskaapissa. Alkiot preparoitiin esille ja siirrettiin kasvamaan koeputkiin, yksi alkio kuhunkin, yhteensä 160 putkea puuta kohden. Alkioiden kasvaminen on esitetty taulukossa 5. Lisämateriaaliksi kerättiin v. 1971 Kolarista ns. vaippa siementä, erä n:o G 3-71-094. Siemenerän laatutiedot ovat taulu kossa 7, itäminen agar-alustalla ja preparoitujen alkioiden kas vaminen MSI-alustalla taulukoissa 8 ja 9. Alkioiden kasvun riippuvuutta endospermistä ja sen laadusta tutkittiin kasvattamalla embryoita siten, että alkion viereen aivan siihen kiinni asetettiin endospermin kappale. Kokeessa käytettiin sekä siemenen omaa että vierasta endospermiä. Tulok set kasvatuksista koeputkessa ja erlenmeyerpullossa ovat taulu kossa 10. 3. Tulokset ja niiden tarkastelua Röntgenkuvaus sopii hyvin siementen luokitteluun ja varsin kin tyhjien siementen osuuden selvittämiseen. Tottunut tulkitsija pystyy arvioimaan alkion koon suhteessa alkio-onteloon varsin tarkasti ja nopeasti. Taulukko 1. Siementen itäminen siemenluokittain imupaperilla (2 x S&S n:o 489) petrimaljassa. Siemenen alkuperä Kolari, Pohja senvaara. Siemenet kymmenestä puusta yhdistetty siemenluokittain. Siemen- mm Idätys vrk . 10 21 30 luokka M32M mm BE9 mm wm mm 4 355 228 64,2 300 84,5 315 88,7 3 600 261 43,5 469 78,2 510 85,0 3- 190 56 29,5 115 60,5 144 75,8 2+ 112 1 0,9 10 8,9 32 28,6 2 73 0 0,0 2 2,7 9 12,3 6 Taulukko 2. Siementen itäminen siemenluokittain M&S-alustalla (MURASHIGE & SKOOG 1962) petrimaljassa. Alustaa maljassa 0,5 cm paksulti. Siemenen alkuperä sama kuin taulukossa 1. Siementen idätyskokeissa (taulukot 1 ja 2) todettiin, että luokan 2 siemeniä ei kannattanut ottaa mukaan jatkotutkimuksiin. Näissä siemenissä on pohjoista materiaalia käytettäessä usein kaksi tai kolme alkiota. Embryogenian pysähdyttyä ilmastollisten syiden takia siemenen alkioista yksikään ei pääse kehittymään täysikokoiseksi, eikä kärkialkion dominanssi ehdi vaikuttaa. Metsäntutkimuslaitoksella käytettävä siementen luokitte luasteikko (liite 1) on ensisijaisesti tarkoitettu tuleentumis palvelun käyttöön. Tätä tutkimusta varten siemenet oli luokitel tava tarkemmin, ja uutta jaottelua voitaneen pitää tarkoituksen mukaisena tutkimuskäyttöön. Siemenluokkaan 2+ kuuluvista alki oista iti ihanneoloissa noin neljännes (23-28 ), Ruotsissa saatujen tulosten mukaan (MULLER-OLSEN ja SIMAK 1954) tällaisten siementen itävyys maahan kylvettynä on kuitenkin vain n. 5 $. Kokeiltaessa alkioiden kasvatusta keinotekoisilla ravintoalus toilla (taulukko 3) saatiin maksimitulokseksi 2+ -luokan siemenil le 4»3 s:n itävyys parhaalla alustalla. Huonommilla alustoilla siemenet eivät itäneet lainkaan. Siemenluokkaan 3- kuuluvat siemenet on aikaisemmassa la jittelussa otettu luokkaan 3. Uudella lajittelulla saatiin nämä Siemen- Siemeniä Itäminen (21 vrk) luokka kpl kpl 1° 4 100 82 82,0 3 100 74 74,0 3- 100 52 52,0 2+ 100 23 23,0 2 100 6 6,0 7 vielä selvästi vajaatuleentuneet eroamaan enemmän liiokan 3 sieme nistä» Hyvällä alustalla voitiin siemenluokan 3.alkioiden katsoa itävän n. 20 °Jo huonommin kuin täysin tuleentuneiden, luokan 4 siementen. Kokeilluista erilaisista kasvualustoista paras, (MSI) antoi likimain saman itämistuloksen kuin kylvettäessä siemenet « taimitarhalla muovihuoneeseen (SINKO 1969). Ilmeisesti voitaneen tässä tutkimuksessa käytetyllä menetelmällä laboratorio-oloissa saadut itämistulokset rinnastaa käytännön taimitarhatyössä saa taviin. Jacobsenin idätyslaitteessa saadaan käytännön tarkoituk siin usein liiankin korkeita itävyyslukuja. Epäkohdan korjaami seksi on ehdotettu (MELLER-OLSEN ja SIMAK 1954),. että itämispro sentin (itävyyden) lisäksi olisi otettava huomioon myös siementen itämistarmo. Tätä varten on suositettu ilmoitettavaksi siementen itävyys 10 vrk:n idätyksen jälkeen. Verrattaessa eri luokkiin kuuluvien siementen itämistarmoa ja itävyyttä huomattiin (taulukko 4)s> että luokkien 4 ja 3 välil lä oli suurempi ero siementen itämistarmossa kuin itämistulok sessa 30 vrk:n jälkeen. Täysin tuleentuneet siemenet itivät nopeimmin, mutta ero itämistuloksessa 21 vrk:n ja 30 vrk:n idätyksen jälkeen oli yllättävän pieni. Luokan 3 siemenet iti vät hitaammin, mutta itämistulos parani huomattavasti vielä viral lisen idätysajan (21 vrk) jälkeen» Idätettäessä luokan 3 sieme niä 30 vuorokautta saatiin jokseenkin sama tulos kuin luokan 4 siemenillä 21 vuorokauden idätyksen jälkeen. Siemenluokat 3- ja 2+ muodostivat toisen ryhmän ja niissä tämä itämisen viiväs tyminen oli vieläkin selvempää. Itämistapahtuman kulussa näytti eri puiden välillä olevan eroja. Puun 74 siemenet itivät hitaimmin ja puun 73 nopeimmin. Taulukko 3. Kuorimattomien ja kuorittujen, eri siemenluokkiin kuuluvien siementen itäminen eri laisilla kasvualustoilla petrimaljoissa. Alustaa maljassa 0,5 cm paksuudelta. Maljassa 10 sie mentä, siemeniä 70 kpl/luokka. Idätysaika 21 vrk. Valaistus 1 000 lx, 12 h/vrk, +2O + 1°C. Siementen alkuperä sama kuin taulukoissa 1 ja 2. MS 1 = MURASHIGE & SKOOG 1962 -alusta + 0,1 ppm kinetiiniä + 2 ppm 2,4-D. MS 2= * -"- +10%v /v kookosmaitoa MS 3 = -"- ilman kasvuaineita MS1 MS 2 MS 3 Siemenluokat Siemenluokat S iemenluokat 4 H PH 2+ 2 4 n 19 2+ 2 4 m 3- 2 + 2 Kuo rima 1 1 oma t kpl 53 41 23 3 1 40 31 21 2 - 30 19 5 1 - * 75,7 58,6 32,9 4,3 1,4 57,1 44, 3 30,0 2,9 0,0 42,9 27,1 7,1 1,4 0,0, Kuoritut kpl 41 24 17 - 1 34 21 5 - - 23 13 2 - - a). [ 24,3 0,0 1 /i /IP £ 30, 0 7,1 : 32,9 18,6 2,9 0,0 0,0 /° ,4 O 9 O 9 Taulukko 4. Siementen itämistarmo ja itävyys siemenluokittain Jacobsenin idätyslaitteessa. Idätysalustana 2-kertainen imupa peri Munktell's Seed Testing Paper Nr. 1701. Valaistus 1 000 lx 12 h/vrk, +2O + 1°C. Materiaali Kolari, Pohjasenvaara, kerätty puittain. Idätys neljänä toistona, taulukossa. esitetty toistojen keskiarvot, puu 74 luokka 4:80 kpl, puu 73 luokka 4:280 kpl, muissa 400 kpl. Siemenluokat 4 3 3- 2+ 10 21 30 10 21 30 10 21 g wm 21 g Puu vrk vrk vrk vrk vrk vrk vrk vrk 39 ES vrk 1 74 (80 kpl) kpl 48 71 74 214 274 340 122 218 233 85 133 198 1o 60,0 88,8 92,5 53,5 68,5 85,0 30,5 54,5 58,3 21 ,3 33,3 49,5 73 (280 kpl) kpl 201 253 253 281 358 365 171 294 314 71 I o l cL 1" 71 ,8 90,4 90,4 70,3 89,5 91,3 42,8 73,5 78,5 17,8 40,3 66,0 69 kpl 306 345 359 248 305 329 128 203 240 73 141 193 1" 76,5 86,3 89,8 62,0 76,3 82,3 32,0 50,8 60,0 18,3 35,3 48,3 66 kpl 292 343 346 222 704 324 163 227 243 77 174 °f0 73,0 85,8 se; c 76,0 81,0 40,8 56,8 60 8 1 Q V "56 0 5 yo Uw f u 10 Viime mainitun siemenistä ei 21 vrk: n idätyksen jälkeen yksikään siemen itänyt. Itämistulos 10 vrk:n idätyksen jälkeen (itämis tarmo) kuvaa mahdollisesti siementen laatua ja kykyä tuottaa taimia huonoissakin oloissa paremmin kuin varsinainen itämis prosentti (itävyys 21 vrk:n kuluttua)» Kehityksessään eri asteelle pysähtyneiden alkioiden kasvu kykyä tutkittiin siirtämällä embryot kasvamaan keinoalus toill e koeputkiin. Tulosten mukaan (taulukko 5) lähtivät kävyissä pisim mälle kehittyneet alkiot (luokka 4-) kasvamaan vieläkin nopeammin luokan 3 siemeniin verrattuna kuin mitä idätystuloksen perusteel la olisi ollut odotettavissa. Kymmenen vuorokauden kasvatuksen jälkeen kasvu oli pienimmilläänkin kaksinkertainen vähemmän tu leentuneisiin verrattuna. Edelleen voitiin panna merkille, että kasvatuksen päät tyessäkään (42 vrk) luokan 3 siemenet eivät olleet lähteneet kasvamaan yhtä lukuisasti kuin täysin tuleentuneet» Koska materiaali oli kasvatustilojen puutteessa suhteellisen pieni (320 koeputkea/32 alakoetta), taimien painoa ei punnittu. Silmämäärin arvioituna luokkien 4 ja 3 taimet olivat kuitenkin jokseenkin samankokoisia kasvatuksen päättyessä. Siemenluok kien 3- ja 2+ taimet olivat selvästi edellisiä hennompia ja pienempiä» Myös taimisaannon osalta nämä kaksi olivat omana ryhmänään selvästi edellisiä huonompia. Kasvatusalustoista oli kinetiiniä ja 2,4-D:a sisältävä (MSI) jonkin verran parempi kuin näiden asemesta kookosmaitoa sisältänyt MS2. Mahdollisesti erilaiseen tulokseen vaikuttaa se, että edellisessä oli jo mukana mesoinositoli, jota pidetään yhtenä kookosmaidon tärkeimmistä kasvua edistävistä aineosista. Pelkällä agar-alustalla kasvoivat puun n:o 73 siemenistä vain täysin tuleentuneet» 11 Taulukko 5. Eri siemenluokkiin kuuluvien alkioiden kasvaminen eri alustoilla, alusta kuten taulukossa 4. Siemenet kuorittu, steriloitu 2 min 3,3 % NaOCl, ster. vesihuuhtelu, alkiot prepa roitu erilleen. Kasvatus koeputkissa 42 vrk., yksi alkio/putki 10 putkea/luokka ja alusta. Idätysolot. Luku ilmaisee kasvamaan lähteneet alkiot (> 2-kertainen pituus), suluissa oleva myöhem min kuolleen. Plussalla (+) merkityt alkiot tummuneet. 4 3 3- 2+ 10 30 42 10 30 42 42 10 30 42 Puu 73 4 4 "2 6 5 1 2:++ - l 5: ++ 2 1 1 3: ++ 1 1 1 1 Alusta MS 1 MS 2 MS 3 1 1 + 1 1 Agar f ■ + ■ Puu 69 | 8: + 2 4 7: + 3 ■ - i 1 Alusta MS 1 MS 2 MS 3 5 2 (1) 1 1 (1) 2 1 1 1 1 1 1 O 1 1 1 1 6 1 Agar ■ 12 Kasvatuksen yhteydessä todettiin useissa alkioissa kasvu häiriöitä. Jo 10 vuorokauden kuluttua moniin alkioihin oli alka nut muodostua vaaleata, kallusmuodostuman kaltaista, erilaistuma tonta solumassaa (taulukko 6). Solukkoa muodostui useimmiten juu renkärkeen, harvemmin sirkkasilmuun.• Tavallisesti alkioista, joissa oli tätä epänormaalia kasvua, ei tullut normaalia tainta. Samankaltaista epänormaalia juuren kasvua on Pinus lambertjanalla todennut SACHER (1956). Runsaimmillaan kallusmuodostus oli pelkällä agarilla kasva tetuissa alkioissa. Ilmeisesti endospermin puuttuessa myös täysin tuleentuneet alkiot vaativat tietynlaisen kasvuaineyhdistelmän kehittyäkseen normaaleiksi taimiksi. Vaikka MSI-alusta on alun perin kehitetty kalluksen kasvattamista varten, voidaan sytokinii neja ja auksiineja sopivasti kombinoimalla saada solukoiden eri laistumiseen tarvittava hormoniyhdistelmä (vrt. myös MURASHIGE & SKOOG 1962). Männyllä ei aikaisemmin ole kasvatettu vajaasti tuleentu * neita alkioita. BARTELS käytti (1957 a ja b) täysin tuleentuneiden männyn alkioiden kasvatuksessa WHITEn (1943) alustaa, johon hän vielä lisäsi siementen endospermeistä tekemäänsä uutetta normaa lien taimien saamiseksi. Muilla mäntylajeilla tehdyissä kasva tuskokeissa on samoin käytetty yksinomaan tuleentunutta siementä, ja useimmiten on alustaan lisätty kookosmaitoa joko autoklavoi tuna tai aseptisesti membraanisuodattimen läpi (ks. esim. BROWN, C.L. & GIEFORD 1958, BERLIN & MIKSCHE 1965, HARVEY 1967, BONGA & FOWLER 1970, BROWN, D.J. ym. 1970). Kasvatuskokeissa todettiin (taulukko 5), että varsin monet alkiot alkoivat kyllä kasvaa, mutta tummuivat lähes mustiksi jat kettaessa kasvatusta yli kuukauden. Ensin taimien kasvu loppui ja sitten koko alkio tummui eikä vain juuri, kuten SACHERin 13 Taulukko 6. Eri siemenluokkiin kuuluvien alkioiden kallusmuodos tus eri alustoilla, alusta kuten taulukossa 4, materiaali ja kas vatus kuten taulukossa 5. Luku ilmoittaa alkiot, joihin on muo dostunut epäsäännöllistä, erilaistumatonta solukkoa. A 3 3- 2+ 10 30 ■ 42 10 ' 30 10 30 10 30 42 Puu 73 ■ Alusta MS 1 4 6 4 8 3 3 3 * 6 3 4 1 1 MS 2 ' 4 4 4 3 7 4 *— o 7 2 4 mm MS 3 6 2 2 3 3 5 3 2 4 5 Agar 6 6 6 6 9 6 7 9 6 2 3 Puu 69 ■ Alusta MS 1 4 r ■ 4 4 4 6 4 / 3 -7 2 6 3 4 C 2 1 i 6 O 2 MS 2 O 4 3 i ■— MS 3 8 5 4 • 6 2 4 2 2 4 2 8 4 Agar 8 8 ■ 8 4 4 4 ■ 2 2 2 14 tutkimuksessa vuodelta 1956. SACHERin työtä kritisoitaessa on esitetty (esim» BERIYN & MIKS GHE 1965), että syynä Juurten kasvun pysähtymiseen ja niiden tummumiseen olisi ollut Jatkuva valaistus ja autoklavoitu kookosmaito. Kun tässä kokeessa valaistus ei ollut jatkuva eikä kookosmaitoa alkioiden kasvun pysähtyminen ja niiden tummuminen ei voine johtua näistä syistä. Aikaisemmissa kasvatuskokeissa oli todettu luokkien 4 ja 3 siementen muodostavan yhden, ia luokkien 3- ja 2+ toisen ryhmän. Ryhmän sisällä kasvu oli lähes samankaltaista, mutta ryhmien välil lä oli melko suuri ero. Tästä syystä materiaaliksi jatkokokeisiin valittiin sellainen siemenerä, jossa oli riittävästi luokan 3 siementä (taulukot 1, 8 ja 9). Näin päästiin vertaamaan käytän nön kannalta mielenkiintoisia täysin tuleentuneita ja vähän vajaasti tuleentuneita alkioita. Taulukko 7. Materiaalin G3-71-094 laatu Luokka Siemenluokan OSUUS ia 1000-siemen paino g Siementen itävyys (täydet siemenet) 10 vrk 21 vrk 4 4,0 4,870 3 63,6 4,450 3- 9,6 3,932 2+ - 5,0 3,832 2 , _ 16,1 3,820 11,45# 12,40% 15 Taulukko 8. Eri luokkien siementen itäminen agar-alustalla (0,8 % w/v) petrimaljassa. Ster. 3,3 % NaOCl 2.min, ster. vesipesu. Materiaali G 3-71-09- Kolari, Pohjasenvaara. 10 siementä/malja, 4 maljaa/siemenluokka„ Taulukko 9. Eri luokkien alkioiden kasvaminen M&S -alustalla petrimaljassa. Menetelmä ja materiaali kuten taulukossa 8. 10 alkiota/malja, 4 maljaa/siemenluokka. Suluissa olevat ovat kuolleet. wm Siemenluokat WM 4 ■3 3- i 2+ ■ 21 30 30 10 21 I 30 I 1 7 7 7 5 6 7 2 3 5 ■■ WM| i 2 6 ' 8 8 4 5 ' r O 2 2 4 H 1 3 8 9 9 4 7 7 1 3 3 1 4 5 7 8 3 6 7 ! 2 4 4 HI ■ ■ 1 Siemenluokat Malja 4 3. 3- 2+ 10 30 42 10 30 42 42 10 30 42 ' 1 — 3 6 4 L _ y 3 (2) - 1 (1) 2 - 5 c 0 _ 2 2 - i 1 - - (1) 3 - 3 5 - 5 - i 1 - 3 1(3) 4 - 6 7 - ■5 5 * 2 2 (1) — 1 (1) 16 Endospermin laadun vaikutusta kehitysasteeltaan erilaisten alkioiden kasvuun tutkittiin asettamalla embryon. välittömään läheisyyteen endospermin kappale sekä omasta.siemenestä että vieraasta siemenestä (taulukko 10). Pelkällä agarilla koeputkessa kasvatettuna kasvoi viidestä intaktista siemenestä kolme normaa lia tainta sekä luokan 4 että luokan 3 siemenistä. Luokan 3- siemenistä kahdesta kehittyi normaalin näköinen taimi, luokan 2+ siemenistä yksikään ei itänyt. Alkiot, joiden viereen oli otettu pala saman siemenen endospermiä kuolivat sen jälkeen, kun ne olivat ensin kasvaneet yli kaksi kertaa alkuperäisen pituisiksi. Ilmeisesti alkioissa oli riittävästi varastoravintoa kasvun alkamiseen, mutta se ei riittänyt taimeksi asti kehittymiseen. Siemenluokan 3- alkioista vain yksi alkoi kasvaa, mutta sekin kuoli samassa vaiheessa kuin edelliset. Eniten vajaasti tuleentuneissa siemenissä (luokan 2+) varastoravinto ei ilmeisesti riittänyt itämisen alkamiseen, ja vieressä olleen endospermin varastoravintoa ei saatu mobilisoi / duksi ainakaan riittävässä määrin. Alkioista, joiden viereen oli asetettu pala vierasta, mutta samaan siemenluokkaan kuuluvan siemenen endospermiä tum muivat kaikki kasvunsa aloittaneet. Tummuminen tapahtui samoi hin aikoihin tai hieman aikaisemmin kun alkiot olivat pidentyneet kaksinkertaisiksi alkuperäisestä. Tummuminen oli samanlaista kaikissa siemenluokissa. Onko kyseessä jonkinlainen inkompa tibiliteetti- tai vasta-ainereaktio tai jokin muu, ei tämän tutkimuksen perusteella voida sanoa. .Ilmiö vaatisi tarkempia, varsinaisia immunologisia tutkimuksia. Vastaavanlaisesta ilmiös tä ei tekijä ole löytänyt mainintaa kirjallisuudessa. Endospermin vaikutusta männyn alkioiden kasvuun ei ole aikaisemmin tutkittu. Vajaasti tuleentuneilla, kauan 17 varastoiduilla tai vioittuneilla siemenillä tiedetään erittyvän kuoren läpi lukuisia erilaisia yhdisteitä, kuten aminohappoja, proteiineja, nukleiinihappoja, rasvoja, sokereita jne., enemmän kuin täysin tuleentuneilla, terveillä siemenillä (PEHA? 1972). Tämä saattaa liittyä jollakin tavalla vajaatuleentuneen siemenen endospermin ravintoaineiden mobilisaatioon ja siten myös alkioiden kasvuun. Alkioiden kasvatuskokeiden yhteydessä todettiin kaikissa niissä pulloissa, joissa oli endospermin kappale, kalluksen muodostusta endospermin palassa. Vähäisintä tämä oli tuleentu ne imm is s a siemenissä ja lisääntyi vajaatuleentuneisuuden kasvaessa (taulukko 10b). Erilaistumattoman solumassan kasvu oli yleensä voimakkaampaa niissä pulloissa, joissa oli saman siemenen alkio ja endosperminkappale. Syytä tällaiseen kasvuun ei vielä tiedetä. 4. Yhteenveto Tässä tutkimuksessa on fysiologiassa käytettävien kasva tusmenetelmien avulla selvitetty eri kehitysasteella olevien, vajaasti tuleentuneiden männyn siementen luokittelua, itämistä ja alkioiden kasvua. Tutkimuksen perusteella näytti itämistarmo kuvaavan sie menten laatua ja taimen muodostamiskykyä paremmin kuin pelkkä siementen itävyys. Käytetty siementen luokittelu erotteli selvästi vajaatu leentuneet siemenet (siemenluokat 2+ ja 3-) entistä paremmin vähemmän vajaasti tuleentuneista (luokka 3). Käytetyistä alustoista paras (MSI) erotteli siemenluokat 4 ja 3 omakseen ja luokat 3- ja 2+ omaksi ryhmäksi. Normaaliksi taimeksi kehittyäkseen vajaasti tuleentuneet männyn siemenet tarvitsivat endospermin tai tietynlaisen kasvu ainekombinaat ion kasvualus tas sa. Käytetty kasvatusmenetelmä näytti sopivan myös haploidisen endospermisolukon kasvattamiseen. Taulukko 10a. Endospermikappaleen vaikutus alkion kasvuun. Materiaali ja sterilointi kuten taulu kossa 7. Endospermi paloiteltu neljään osaan, yksi osa otettu alkion viereen siihen kiinni. Kas vatus koeputkessa, alustana agar (0,8 %w/v),idätysolot,lämpötila 23 + 1°C 0 Kasvatusaika 30 vrk. A = intakti siemen, B = embryo + pala omaa endospermiä, C = embryo + pala vierasta endospermiä, D* = agar + embryo, k = alkio kasvanut > 2 x alkuper. pituus, (k) = alkio pidentynyt, mutta kasvu pysähtynyt, T = alkio tummunut + mustaksi. Taulukko 10b. Kasvatus erlenmeyer-pullossa (200 ml, laajakaula), M&S-alus taa 75 ml. 5 alkiota/pullo, 4 pulloa/luokka ja käsittely. H = homeinf ektio, ( ) = alkio kuollut alettuaan kasvaa, + = yhteen en dospermiin muodostunut kallussolukon kaltaista kasvannaista. 4 3 * 3- 2+ I Putk i A B C D A B C I) A B C D A B _C D 1 2 3 4 n k (k) ' 00 (k) (k) T m T k V (k) (k) T - k (k) T - T-kTT--- T - - - T - T rp - V i rp K. V A. T T T JTi. k _L T T X*. (k) - \> ' 4 1 —- »7 — ~ ' — 1 pa 2+ ■ 3_ H ■■■£ Pullo A B C ' D A B c 1) A B C D A B c D 1 3 2 ++ (1) H -I- (1) 2 2 +++ (1) H + (1) (1) 1 (1) ++++ (1) H + - H 1 +++ - H ++4- - H 2 2 2 (1 ) (2) H 3 1 (1 ) — — — — — — — + + + + +++ ++ +++ ++ *7 3 1 + 2 1 ++ 1 J + ++ ++ ++ +++ + 7 3 1 . j t 7 1 -f-4- 4 + 3 + +++ +++ ++4 +++ Liite 1. Jako siemenluokkiin on seuraava: 0 Tyhjä siemen, siemenvalkuainen jäänyt muodostumatta hedelmöi tyksen puuttumisen tähden tai alkuaan kyllä muodostunut, «f mutta myöhemmin hävinnyt sen vuoksi, että alkio on kuollut letaalitekijoiden tai hyönteisvaurioiden vuoksi. 1 Alkio-ontelo tyhjä tai mikropylen päässä näkyy pieniä var haisalkioita, jotka eivät ole lähteneet kehittymään. Alkio abortti. II Alkio lähtenyt kehittymään, mutta sen kuva ei peitä 50 $ alkio-ontelon kuva-alasta. 111 Alkion kuva'peittää enemmän kuin 50 mutta vähemmän■kuin 70 fo alkio-ontelon kuva-alasta. Keskoset. (Täydessä, luon nollisessa kosteustilassaan olevassa siemenessä alkio täyt tää kirjaimellisesti kyllä koko alkio-ontelon. Valokuvausta varten siemen kuitenkin on pakko kuivata perusteellisesti, minkä jälkeen alkio täyttää keskimäärin 70 fo alkio-ontelosta). IV Alkion pinta-ala peittää yli 70 % alkio-ontelon kuva-alasta. Tuleentunut siemen. Liite 2. Siementen röntgenluokittelu 0: tyhjä siemen, jossa kuitenkin voi olla endospermin jätteitä 1: alkio-ontelo on muodostunut endospermiin, mutta on tyhjä 2-: alkio on, mutta suurin peittää alle 1/3 alkio-ontelosta 2: suurin alkio peittää selvästi alle puolet alkio-ontelosta 2+: suurin alkio peittää likimain puolet alkio-ontelosta 3-: suurin alkio peittää yli puolet, mutta alle 2/3 alkio-ontelosta 3: alkio peittää likimain 3/4 alkio-ontelosta 4: alkio peittää yli 3/4 alkio-ontelosta Lisäksi merkitään kaksi alkiota sisältävät kirjaimella d ja kolme alkiota sisältävät kirjaimella tr. Hyönteisvauriot merkitään kirjaimella T ja rikkinäiset kirjaimella R. Liite 3. MURASHIGE & SKOOGin, ravintoalusta A. Epäorgaaniset ravinteet B. Orgaaniset ravinteet sakkaroosi . 30 g/l agar 10 " Edamin . 1 " myo-inositoli ; 100 rng/1 glysiini ' 2,0 " lAA 1-30 " leinetiini 0,04-10 " nikotiinihappo 0,5 " pyridoksiini KCI 0,5 " tiamiini KCI 0,1 " Alus ta sis ältää: IT 60,0 mM K 20,0 » Ca 3,0 " M Z 1,5," S 1,6" ? '1,25" 01 6,0 ,! Xa • 0,2 " ?e o',l " I II . Makr oravin teet 2. Mikro ravint eet I i mg/1 mM il Iiii ' , mg/l I jm Ttl. KO- ' 4 ;> IGTO- 1650 1900 1-7 / 1 i •' 0' ' Q Q O O BO, j J KnS0 A *4 ' h 2 o 6,2 22,.3 100 100. • 2 HpO 440 3,0 ZnSO ,-4 4 jti 2 0 3,6 30. IvIsSO, -7 H? 0 KH 2 P0 4 : 570 170 1 ,5 1,25 TTT AJ 2*.a 2 iVio 0^ • 2 HgO 0,33 0,25 5,0 1,0 . 3Ta 9 -EDTA 37, 3 Sf a. 0,20 CuS0 £ -5 H2 0 0,025 0,1 ?aS0 A «7 H2 0 27, 3 Pe 0,10 COC12 -6 e2 o 0,025 0,1. I KIRJALLISUUTTA BARTELS, H. 1957 a. Kultur isoliertex* Koniferenembryonen I. - Naturwiss. 9:290-291. BARTELS, H. 1957 Td. Kultur isolierter Koniferenembryonen 11. - Naturwiss . 22: 595-596. BERLYN, G.?. and'MIKSCHE, J.P. 1965. Growth, of excised pine embryos and the role of the cotyledons during germination in vitro. -Amer. J. Bot. 52 (7):730-736. BONGA, J.M. and FOWLER , L.P. 1970. Growth and differentiation in gametophytes of Pinus resinosa cultures in vitro. -Can» J. Bot. 48: 2205-2207. BROWN, C.L. and GIFFOKD , E.M.Jr. 1958. The relation of the cotyledons to root development of pine embryos grown in vitro. -Plant Physiol. 33:57-64. BROWN, D.J. , Canvin, D.T. and ZILKEY, B.E. 1970. Growth and metabolism of Ricinus communis endosperm in tissue culture. -Can.J. Bot. 48:2323-2331. DOGRA, P.D. 1967. Seed sterility and disturbances in embryogeny in conifers with particular reference to seed testing and tree breeding in Pinaceae. -Studia For. Suec. 45: 1-97. EHRENBERG, 0. & GUSTAFSSON, 1. & PLYM FORSHELL, C. & SIMAK, M a 1955. Seed quality and the principles of forest genetics. -Kereditas 41: 291-366. HARYEY, A.E. 1967. Tissue culture of Pinus monticola on a chemically defined medium. - Can J. Bot. 45: 1783-1787. HEIKINHEIMO, 0. 1921. Suomen metsänrajametsät ja niiden vastainen käyttö. -Comm. Inst. For.Finl. 4: 1-71. KUJALA, V. 1927. Untersuchungen iiber den Bau und die Keimfähigkeit von Kiefern- und Fichtensamen in Finnland. -Comm.lnst. For. Finl. 12: 1-106. MURASHIGE, T. & SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid ■ growth and "bio assays with tobacco tissue Cultures. -Physiol. Plant. 15:473-497. MULLER-OLSEN , C. & SIMAK, M. 1954. X-ray photography employed in germination analysis of Scots pine (Pinus silvestris L.) - Medd.Stat.Skogsforskn.inst.44 (6): 1-19. PEHAP, A. 1972. Seed eluates on the germination blotter - a germinability test ? -Studia Por.Suec. 101:1-21. PLYM FORSHELL, C. 1953. Kottens och fröets utbilding efter själv-och korsbefruktning hos tall (Pinus silvestris L.). -Medd.Stat.Skogsforskn.-inst. 43 (10): 1-42. SACHER, J.A. 1956. Observations on pine embryos grown in vitro. - Bot.Gaz. 117:206-214. SIMAK, M. & GUSTAFSSON, A. 1953 a. Röntgenfotografering av skogsträdsfrö. -Skogen 5:1-4. SIMAK, M. & GUSTAFSSON, A. 1953 b. X-ray photography and sensitivity in forest tree species. -Hereditas 39:458-468. SIMAK, M. & GUSTAFSSON, Ä. 1954. Pröbeskaff enheten hos moderträd och ympar av tall. -Medd.Stat.Skogsforskn.inst. 44(2):l-73. SINKO, M. 1969. Nägot om groningsförloppet hos tallfrö i plast växthus. - Inst. Skogsföryngr. Skogshögsk. Rapp.Upps. 15:103-108. WIBECK, E. 1928. Det norrländska tallfröets grobarhet och anatomiska beskaffenhet. Norrl.Skogsv.förb.tidskr. 1:4-35. WHITE, P.R. 1943. A handbook of plant tissue culture. -The Ronald Press Co. N.Y. p.277.