Maa- ja elintarviketalous 99 Maa- ja elintarviketalous 99 99 Biotekniikka kauran jalostuksessa – Uudet menetelmät laadun parantamiseks i Kasvintuotanto Elina Kiviharju, Anneli Ritala, Alan Schulman, Leena Pietilä, Pirjo Tanhuanpää (toim.) Biotekniikka kauran jalostuksessa Uudet menetelmät laadun parantamiseksi Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus Maa- ja elintarviketalous 99 76 s. Biotekniikka kauran jalostuksessa Uudet menetelmät laadun parantamiseksi Elina Kiviharju, Anneli Ritala, Alan Schulman, Leena Pietilä ja Pirjo Tanhuanpää (toim.) ISBN 978-952-487-100-6 (Painettu) ISBN 978-952-487-099-3 (Verkkojulkaisu) ISSN 1458-5073 (Painettu) ISSN 1458-5081 (Verkkojulkaisu) www.mtt.fi/met/pdf/met99.pdf Copyright MTT Kirjoittajat Julkaisija ja kustantaja MTT, 36100 Jokioinen Jakelu ja myynti MTT, Tietohallinto, 36100 Jokioinen Puhelin (03) 4188 2327, Fax (03) 4188 2339 Julkaisuvuosi 2007 Kannen kuvat Elina Kiviharju MTT, Pirjo Tanhuanpää MTT, Tapani Suortti VTT Painopaikka Dark Oy 3 Biotekniikka kauran jalostuksessa Elina Kiviharju1), Anneli Ritala2), Alan Schulman1, 3), Leena Pietilä4) ja Pirjo Tanhuanpää1) 1) MTT, Biotekniikka- ja elintarviketutkimus, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etuni- mi.sukunimi@mtt.fi 2) VTT, PL 1000, 02044 VTT, etunimi.sukunimi@vtt.fi 3) MTT / BI Kasvigenomiikan laboratorio, Biotekniikan instituutti, PL 56, 00014 Helsingin yliopisto, etunimi.sukunimi@helsinki.fi 4) Boreal Kasvinjalostus Oy, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etunimi.sukunimi@boreal.fi Tiivistelmä Kauran lajikejalostuksella pyritään tuottamaan entistä satoisampia ja laaduk- kaampia lajikkeita. Bioteknisiä menetelmiä hyödyntämällä mahdollisuudet vastata rehu- ja elintarviketeollisuuden sekä viljelijöiden toivomuksiin para- nevat. Tässä hankkeessa kehitettiin ja sovellettiin biotekniikan menetelmiä kotimaisen kauranjalostuksen tueksi. Tutkittaviksi ominaisuuksiksi valittiin kauran sisältämä terveysvaikutteinen ravintokuitu β-glukaani, rehun energia- arvon kannalta tärkeä öljypitoisuus ja viime vuosina Suomeen levinnyt kau- ran lehtilaikkutauti. Lisäksi tutkittiin maaperän myrkyllisen raskasmetallin kadmiumin kertymistä jyviin. Tutkimuksessa koottiin yli kuusisataa DNA-merkkiä käsittävä geenikartta käyttäen pohjoismaista kauran risteytysjälkeläistöä, joka oli muokattu soluk- koviljelyssä haploidiavaiheen avulla täysin yhtenäisiksi DH-linjoiksi. Kartan avulla paikannettiin tutkittuihin ominaisuuksiin vaikuttavia geenejä. Tutki- muksessa löydettiin muun muassa seitsemän öljypitoisuuteen, kaksi β- glukaaniin ja monta lehtilaikkutautiin vaikuttavaa kromosomialuetta sekä kadmiumin kertymiseen vaikuttava suurivaikutteinen kromosomialue. Lisäksi kartoitettiin viljelyominaisuuksiin vaikuttavia geenejä. Ominaisuuteen vai- kuttavan geenin lähellä sijaitsevia DNA-merkkejä voidaan käyttää näiden ominaisuuksien merkkiavusteisessa valintajalostuksessa. Geeninsiirrot mahdollistavat niin sanotun täsmäjalostuksen eli vain halutun ominaisuuden aiheuttavan geenin siirtämisen lajikkeeseen. Lisäksi voidaan ylittää lajinsisäisen luonnollisen vaihtelun mahdollisuudet käyttämällä gee- niä, jota ei saada lajikkeeseen risteyttämällä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, voidaanko kauran β-glukaanipitoisuutta nostaa siirtämällä siihen tehokkaam- pi β-glukaanisyntaasigeeni. Tulosten perusteella suomalaisella kauranjalos- tuksella on käytettävissään toimiva geeninsiirtomenetelmä. Haploidijalostustekniikat, DNA-merkkiavusteinen valintajalostus ja geenin- siirtotekniikka ovat tämän päivän kauranjalostuksen ulottuvilla. Tulevaisuu- dessa nopeasti kehittyvät, koko genomin tutkimuksen eli genomiikan mene- telmät tarjoavat lisävälineitä kaurankin ominaisuuksien periytymisen ymmär- tämiseen ja jalostukseen. Avainsanat: kaura, Avena sativa, solukkoviljely, geenit, geenikartoitus, gee- nitekniikka, DNA, jalostus, molekyylibiologia, bioteknologia 4 Biotechnology in oat breeding Elina Kiviharju1), Anneli Ritala2), Alan Schulman1, 3), Leena Pietilä4) ja Pirjo Tanhuanpää1) 1) MTT, Biotechnology and Food Research, Myllytie 10, FIN-31600 Jokioinen, first name.last name@mtt.fi 2) VTT, PL 1000, 02044 VTT, first name. last name@vtt.fi 3) MTT / BI Plant Genomics Laboratory, Institute of Biotechnology, PL 56, 00014 University of Helsinki, first name.last name@helsinki.fi 4) Boreal Plant Breeding ltd, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, first name.last name@boreal.fi Abstract Oat cultivar breeding aims at higher yields and better quality. Novel biotech- nological methods give tools to breeders enabling more efficient responses to the demands of both the feed and food industries and the farmers and con- sumers. In this project, biotechnological methods were developed for oat cultivar breeding. The breeding aims that were chosen included: oat soluble bran β-glucan, which has positive health benefits in the diet; high oil content, which increases the energy value of feed; resistance to the oat leaf blotch disease, which has spread to the Finnish fields recently; and accumulation of the poisonous heavy metal cadmium in oat grains. A genetic linkage map consisting of over six hundred DNA markers was constructed for a Nordic oat cross population, which was developed into DH lines using the anther culture technique. Genes affecting the desired traits were mapped. Two chromosomal regions related to the β-glucan content, seven regions related to the oil content and several regions related to the leaf blotch disease were found. In addition, chromosomal region strongly affect- ing cadmium accumulation was identified. In addition, genes associated with agronomic traits were mapped. DNA markers linked closely to the gene mak- ing the effect can be used for marker assisted selection of these traits in culti- var breeding. Genetic transformation enables “targeted breeding”, whereby only the desired genes are transferred to the elite cultivar. In addition, valuable genes of other species can be used. The possibilities to improve oat β-glucan content by a more efficient β-glucansynthase transgene, was studied. Haploid breeding technologies, DNA-assisted selection and genetic transfor- mation techniques are available for the oat breeding already today. In future, rapidly developing possibilities to study the whole genomes (genomics) will open up new views to understand inheritance of the traits and breed better oat cultivars. Keywords: oats, Avena sativa, tissue culture, genes, gene mapping, genetic engineering, DNA, breeding, molecular biology, biotechnology 5 Alkusanat Suomi on kansainvälisesti yksi tärkeimmistä kaurantuottajamaista. Kaura on Suomelle tärkeä rehukasvi, mutta myös elintarvikekäytön toivotaan lisäänty- vän, koska kauran jyvä sisältää runsaasti terveydelle edullisia ainesosia. Kau- ran lajikejalostuksen tehtävänä on huolehtia, että laatuominaisuuksiltaan hy- viä, terveitä ja satoisia kauralajikkeita on saatavilla. Teollisuus, viljelijät ja kuluttajat vaikuttavat toiveillaan siihen mitä ominaisuuksia jalostetaan. Perin- teisen jalostuksen tueksi on kehitetty bioteknisiä menetelmiä tehostamaan lajikejalostuksen mahdollisuuksia vastata uusiin haasteisiin. Kauran osalta biotekniikkaosaaminen on ollut suhteellisen vaatimatonta, mutta viime vuo- sina molekyyligeneettistä tietoa on julkaistu enenevässä määrin. Jotta Suomi pysyisi jatkossakin kauranjalostuksen eturintamassa, olemme MTT:llä ja VTT:llä kehittäneet kauran bioteknisiä jalostustekniikoita. Tämä hanke perustuu MTT:llä kehitetyn kauran haploiditekniikan ja geenikartoi- tusosaamisen, VTT:llä kehitetyn kauran geeninsiirtomenetelmän, MTT:n ja Biotekniikan instituutin kasvigenomiikan yhteistoimintalaboratorion geno- miikkaosaamisen ja Boreal Kasvinjalostus Oy:n risteytys- ja kenttäkoetaito- jen hyödyntämiseen. Hankkeessamme ”Täsmäjalostusta teollisuuden tarpei- siin – uudet menetelmät kauran laatujalostuksessa” (vuodet 2003-2006) pyrit- tiin kauran laadullisten ominaisuuksien parantamiseen kehitettyjen menetel- mien avulla. Hanke jakautui kahteen osaprojektiin, 1) Kaksoishaploidit (DH) linjat kauran laatuominaisuuksien geenikartoituksessa, ja 2) Geeninsiirtojen hyödyntäminen jalostuksessa. Osaprojektissa 1) päävastuu oli MTT:llä ja tavoitteena oli löytää laatuominaisuuksiin (korkea β-glukaani-pitoisuus, kor- kea öljypitoisuus, alhainen kadmiumin kertyminen ja lehtilaikkutaudin kestä- vyys) liittyviä DNA-merkkejä käytettäväksi DNA-merkkiavusteisessa valin- nassa. Osaprojektissa 2) päävastuu oli VTT:llä ja tavoitteena oli nostaa kau- ran β-glukaanipitoisuutta geeninsiirron avulla. Tutkimusryhmään kuuluivat FT Elina Kiviharju, FT Pirjo Tanhuanpää, FT Outi Manninen ja professori Ph.D. Alan Schulman MTT Biotekniikka- ja elintarviketutkimuksesta; FaT Anneli Ritala, FT Heidi Holkeri, FT Marjatta Salmenkallio-Marttila, FT Tapani Suortti, Dos Anna Maria Nuutila ja Dos Kirsi-Marja Oksman-Caldentey VTT:sta; Ph.D. FT Ruslan Kalendar ja Alan Schulman MTT:n ja Biotekniikan instituutin Kasvigenomiikan yhteistoimin- talaboratoriosta; kauranjalostaja FK Leena Pietilä ja FT Nigel Kilby Boreal Kasvinjalostus Oy:stä sekä FM Veli Hietaniemi ja ETM Merja Eurola MTT Palvelulaboratoriosta. Lisäksi hankkeen toteuttamiseen osallistuivat lukuisat laborantit ja tekniset apulaiset, joiden panos tutkimuksen onnistumiselle oli äärimmäisen välttämätön. Hankkeen vastuullisena johtajana toimi FT Elina Kiviharju (sijaisena 3.9.2004- 1.1.2006 FT Pirjo Tanhuanpää). 6 Tutkimuksen ohjausryhmän puheenjohtajana toimi Maa- ja metsätalousmi- nisteriöstä maatalousneuvos Leena Vestala (v. 2003) ja ylitarkastaja Tuula Pehu (v. 2004 alkaen). Muut jäsenet olivat tutkimus- ja kehitysjohtaja Ilmo Aronen (Raisio yhtymä), professori Aarne Kurppa (MTT), professori Kaisa Poutanen (VTT), jalostusjohtaja Eero Nissilä (Boreal Kasvinjalostus Oy), teknologiajohtaja Ilkka Lehtomäki (Suomen Viljava Oy vuodet 2003-04), tutkimusryhmänjohtaja Petri Auvinen (Helsingin yliopisto) ja johtaja Pasi Lähdetie (Elintarviketeollisuusliitto ry). Toimijaorganisaatioiden lisäksi hanketta rahoitti Maa- ja metsätalousministe- riö, sekä kadmiumintutkimuksen osalta Raisio Yhtymän Tutkimussäätiö s.r., joille tutkimuksen toteuttajat haluavat lausua parhaimmat kiitokset. Jokioisissa huhtikuussa 2007 Elina Kiviharju MTT Biotekniikka- ja elintarviketutkimus 7 Sisällysluettelo Kauran laatuominaisuuksien geenikartoitus, Pirjo Tanhuanpää, Outi Manninen, Alan Schulman, Ruslan Kalendar, Veli Hietaniemi, Merja Eurola, Leena Pietilä ja Elina Kiviharju..........................8 Geeninsiirtojen hyödyntäminen jalostuksessa, Anneli Ritala, Tapani Suortti, Ruslan Kalendar, Marjatta Salmenkallio- Marttila, Kirsi-Marja Oksman-Caldentey, Alan Schulman ja Anna Maria Nuutila...........................................................................................................34 Biotekniikan mahdollisuudet kauranjalostuksessa, Elina Kiviharju, Anneli Ritala, Pirjo Tanhuanpää, Outi Manninen, Alan Schulman, Leena Pietilä................................................................................59 8 Kauran laatuominaisuuksien geenikartoitus Pirjo Tanhuanpää1), Outi Manninen1), Alan Schulman1,3), Ruslan Kalendar3), Veli Hietaniemi2), Merja Eurola2), Leena Pietilä4) ja Elina Kiviharju1) 1) MTT, Biotekniikka- ja elintarviketutkimus, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etuni- mi.sukunimi@mtt.fi 2) MTT, Palveluyksikkö, Laboratoriot, 31600 Jokioinen, etunimi.sukunimi@mtt.fi 3) MTT / BI Kasvigenomiikan laboratorio, Biotekniikan instituutti, PL 56, 00014 Helsingin yliopisto, etunimi.sukunimi@helsinki.fi 4) Boreal Kasvinjalostus Oy, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etunimi.sukunimi@boreal.fi Johdanto Kauran (Avena sativa L.) molekyyligeneettinen tutkimus on kehittynyt hi- taasti verrattuna maailmanlaajuisesti tärkeämpiin viljalajeihin, kuten ohraan, vehnään ja riisiin, oletettavasti siksi, että sen viljelyalat ovat huomattavasti pienemmät. Vähäisemmän panostuksen lisäksi kauran molekyyligeneettistä tutkimusta on hankaloittanut sen suuri heksaploidi perimä eli kromosomiston seitsemän kromosomin perussetti vastinpareineen on perimässä kolminkertai- sena (yhteensä 42 kromosomia). Kauran genomin DNA:n kokonaispituuden on arveltu olevan jopa 11 300 000 000 emäsparia. DNA-merkit eli geenimerkit ovat molekyylibiologian työkaluja, joiden avulla voidaan muun muassa paikantaa tärkeisiin ominaisuuksiin vaikuttavia geene- jä. Toivottuun ominaisuuteen riittävän läheisesti kytkeytyneen DNA-merkin avulla voidaan tätä ominaisuutta edustavat jalostuslinjat valita lajikejalostus- ohjelmassa jo ennen kuin toivottu ominaisuus, tai sen puute, voidaan havain- noida kasviyksilön ilmiasussa. Kauran molekyyligeneettistä tietoa on viime vuosina julkaistu enenevässä määrin. Heksaploidista kaurasta on jo olemassa geenikarttoja ja niitä on käytetty eri ominaisuuksiin vaikuttavien geenien paikantamiseen (O’Donoghue ym. 1995; Bush & Wise 1996; Holland ym. 1997; Jin ym. 2000; Wight ym. 2003; Kianian ym. 1999, 2000; Groh ym. 2001a ja b; De Koyer ym. 2004; Portyanko ym. 2001, 2005; Zhu & Kaeppler 2003; Zhu ym. 2003). Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tehdä geenikartta käyttäen pohjoismaista kauran risteytysjälkeläistöä ja edistää geenimerkkiavusteisen valinnan käyt- töönottoa Suomen lajikejalostuksessa. Tarkoituksena oli helpottaa jalostuslin- jojen valintaa toivottuihin ominaisuuksiin kytkeytyneiden DNA-merkkien avulla. Sen lisäksi, että valintaa voidaan tehdä varhaisessa kasvun vaiheessa ilman aikaa vieviä ja kalliita kemiallisia analyysejä ja kasvitaudin tartutusko- keita, vältytään ympäristöolosuhteiden kuten säätekijöiden valintaa hanka- 9 loittavalta vaikutukselta: vaikka toivottu ominaisuus ei jonain vuonna näkyisi kasvin ilmiasussa, sen aiheuttava geeni voidaan DNA-merkein todeta kasvin perimästä. Kaksoishaploideista jalostuslinjoista eli DH-linjoista (doubled haploid) koostuva geenikartoituspopulaatio helpottaa geneettisen analyysin tekemistä (Graner 1996). Hyöty perustuu linjojen täydelliseen yhtenäisyyteen eli homotsygotiaan ja korostuu tutkittaessa perimältään kauran kaltaista lajia. DH-linjoja voidaan kauralla tuottaa ponsiviljelyn avulla (Kiviharju ym. 2005). Jalostustavoitteita on monia riippuen sadon käyttökohteista. Elintarviketeolli- suutta kiinnostaa mm. β-glukaani, jota kaura sisältää runsaasti. Se on pääosin liukoinen ravintokuitu, joka vähentää riskiä sairastua sydän- ja sepelvaltimo- tauteihin. Terveydelle ehkä haitallisin raskasmetalli on maaperän kadmium. Sen kertyvyydessä eri kauralajikkeisiin on havaittu eroja, ja kuivina ja läm- piminä vuosina tietyillä maalajeilla kasvatetun kauran kadmiumpitoisuudet voivat hipoa sallittua 100 µg/kg raja-arvoa ja jopa ylittää sen. Elintarvikeraa- ka-aineiden raskasmetalliraja-arvoissa tähdätään mielellään alle lastenruokien ohjeistettujen 20-30 µg/kg maksimipitoisuuksien (Hietaniemi ym. 2002, Hau- tala 2002). On tärkeää karsia lajikejalostuksessa jalostuslinjat, jotka keräävät korkeita kadmiumpitoisuuksia. Noin 80 % kaurasta käytetään rehuksi ja rehulaadun kannalta tärkeimpiä jalostustavoitteita on energiamäärän lisääminen (Pullinen 1998). Tähän pääs- tään kauran öljypitoisuutta nostamalla. Etu on erityisen suuri hevosten rehus- sa (Kempe ym. 2001), joka on yksi vientikauran pääkohteista. Suomalainen kaura on ollut hyvin tervettä ja sitä on ollut helppo markkinoida laadukkaana ja puhtaana raaka-aineena. Muutaman viimevuoden aikana kau- ran lehtilaikkutauti (Drechslera avenae) on kuitenkin vallannut jalansijaa Suomessa (Kangas ym. 2002). Mahdollisen kasvavan kemiallisen kasvinsuo- jelutarpeen kustannukset ja torjunta-ainejäämät voidaan välttää jalostamalla taudinkestäviä lajikkeita ja niiden tarve on erityisen suuri torjunta-aineita välttävässä luomutuotannossa, johon kaura myös hyvin soveltuu. Tässä tutkimuksessa rakennettiin geenikartta pohjoismaiselle kauran DH- jälkeläistölle ja etsittiin yllämainittuihin ominaisuuksiin liittyviä DNA- merkkejä suomalaisen kauranjalostuksen geenimerkkiavusteisen valinnan tueksi. 10 Aineisto ja menetelmät Risteytysaineisto β-glukaani- ja öljypitoisuuden sekä kau- ran lehtilaikkutaudin kestävyyden geenikartoitusta varten Geenikartoitusta varten tarvitaan risteytysjälkeläistö, jossa on riittävän suuri vaihtelu kartoitettavien ominaisuuksien, β-glukaanipitoisuuden, öljypitoisuu- den, kadmiumin kertymisen ja kauran lehtilaikkutaudin kestävyyden suhteen. Pyrimme saamaan kartoituksen kohteena olevat ominaisuudet yhteen ristey- tykseen vähentääksemme risteyttämiseen, DH-linjojen tekemiseen sekä DNA-merkkien testaamiseen ja analysointiin kuluvaa aikaa. Tarkoitukseen valittiin Matilda × Aslak -risteytys (Kuva 1). Aslak on Boreal Kasvinjalostus Oy:n ja Matilda Svalöf-Weibull Ab:n lajike. Kadmiumin kertymisen osalta tiedossamme oli, että Matilda olisi vähän kadmiumia keräävä ja Aslak keski- tasoinen, mutta koska tiedot eivät olleet samoissa olosuhteissa tehdyistä ko- keista, perustettiin astiakoe asian selvittämiseksi. Kuva 1. Aslak × Matilda kartoitusjälkeläistön rakentuminen ja kartoitettavien ominaisuuksien ilmeneminen vanhemmissa (Saastamoinen 1999, Hietaniemi ym. 2002, Kangas ym. 2002). Kartoitusjälkeläistö x F1 Korkea β-glukaanipitoisuus - Keskimääräinen öljypitoisuus Herkkä kauran lehtilaikkutaudille Keskimääräinen β-glukaanipitoisuus Korkea öljypitoisuus DH- linjat Aslak Matilda Lehtilaikkutautia kestävä 11 Risteytysaineisto kadmiumin kertymiseen vaikuttavien gee- nien kartoittamiseksi - Astiakoe kadmiumin kertymisestä lajikkeisiin Kadmiumin kertymisen lajikevaikutuksen selvittämiseksi tehtiin kasvihuo- neella astiakoe, jossa kasvatusalustaan lisättiin kylvön yhteydessä kadmiumia Cd(NO3)2 x 4 H2O (Fluka) sisältävänä vesiliuoksena. Koe tehtiin neljällä kerranteella käyttäen koejärjestelyä, joka huomioi astian sijainnin pöydällä. Aslak keräsi hieman Matildaa enemmän kadmiumia kaikilla tasoilla (0, 0,5 ja 5,0 mg/kg Cd:tä lisätty) (Taulukko 1). Kerääjälajikkeeksi tiedetty Salo keräsi kuitenkin erittäin merkitsevästi enemmän kadmiumia kuin Aslak tai Matilda. Mitatut kadmiumpitoisuudet nousivat yllättävän suuriksi siihen nähden, että elintarvikekauran kadmiumrajana on 100 μg/kg. Lisäämäämme 0,5 mg kad- miumia kilossa kasvualustaa pidetään maaperästä mitattuna kohonneena pi- toisuutena, mutta se on vielä pitoisuus jota tavataan paikoin peltomaassa. Keskimäärin Suomen maaperän kadmiumpitoisuus on vuonna 1998 kerätyis- sä maanäytteissä ollut 0,18 mg/kg, tulosten vaihdellessa välillä 0,02-0,75 mg/kg (Mäkelä-Kurtto ym. 2003). Kokeemme tulokset eivät ole vertailukel- poisia peltomaan tuloksien kanssa, koska kadmium on luultavasti ollut hyvin helposti kasvien saatavilla käyttämästämme turve-kivennäismaa seoksesta, kun luonnonoloissa se on sitoutuneena maaperän ainesosiin. Koe sopii kui- tenkin lajikkeiden välisten erojen selvittämiseen. Astiakokeen tulosten perusteella päätettiin kasvattaa Aslak × Salo -jälkeläistö kadmiumin kertymisen tutkimista varten. Aslak risteytettiin Salon kanssa ja yhden F1-yksilön itsepölytyssiemenistä peräisin olevaa F2-jälkeläistöä (150 kpl) käytettiin ominaisuuteen vaikuttavien geenien etsimiseen. Taulukko 1. Kadmiumin kertyminen kolmen eri kauralajikkeen pääröyhyn jyviin esikokeessa, jossa kasvualustaan oli lisätty kadmiumnitraattia. Jyvien Cd pitoisuus µg kg -1 ± SE Cd lisäys mg kg -1 Aslak Matilda Salo 0 29,2 ± 2,8 26,2 ± 4,4 36,9 ± 4,5 0.5 695 ± 79 672 ± 107 1058 ± 61 5 6275 ± 353 6078 ± 458 9465 ± 966 SE= keskivirhe Aslak × Matilda DH-linjojen tuotto ja lisäys Geenikartoituspopulaatio edustaa Aslakin ja Matildan välille rekombinaatios- sa muodostuvia geneettisiä vaihtoehtoja, ja sen pitäisi sisältää vähintään sata linjaa ollakseen riittävän kattava. DH-linjat tuotettiin ns. ponsiviljelymene- telmän (synonyymi hedeviljely) avulla. Siinä siitepölyhiukkasen esiasteet saadaan solukkoviljelmissä erilaistumaan alkiorakenteiksi ja taimiksi. Näillä taimilla on vain yksinkertainen (haploidi) perimäannos (21 kromosomia kau- 12 ralla) eli munasolun kautta tulevat vastinkromosomit puuttuvat. Perimä kah- dentuu tavanomaiseksi (42 kromosomia) joko itsestään tai antimitoottisesti vaikuttavan kolkisiinin avulla. Aikaisempien ponsiviljelykokeiden perusteella Aslakin tiedettiin toimivan ponsiviljelyssä hyvin. Boreal Kasvinjalostus Oy toimitti käyttöömme 200 Aslak × Matilda F1- risteytyssiementä. Tarvittava määrä DH-linjoja tuotettiin kolmessa ponsivil- jelyerässä. Ponsiviljely tehtiin aiemmin kehittämällämme menetelmällä hiu- kan modifioiden (Kiviharju ym. 2005). Menetelmä oli pääpiirteittäin seuraava (Kuva 2): risteytyssiemenet kylvettiin, versot leikattiin siitepölyhiukkasten ollessa myöhäisessä yksitumavaiheessa, versot kylmäkäsiteltiin pimeässä +4°C:ssä 7 vrk, pintasteriloitiin 70% etano- lilla ja heteiden ponnet eristettiin kiinteän ja nestefaasin omaaville steri- loiduille induktioalustoille (W14 –suolat (Ouyang ym. 1987), MS-rauta (Murashige & Skoog 1962), 5 mg/l, 2,4-D + 0,5 mg/l BAP + 20 mg/l Et- hephon, 50 mg/l L-kysteiini ja 500 mg/l myo-inositoli, 10% maltoosi, neste- faasi sisälsi 10% Ficolia ja kiinteä 0,3% Phytagelia), ponnet lämpökäsiteltiin pimeässä +32°C:ssä 5 vrk ja viljelyä jatkettiin pimeässä +28°C:ssä. Koska meillä oli viitteitä eräällä lajikkeella himmeän valon (noin 40 µmol m -2 s -1 , 16/8 tunnin fotoperiodi) edullisesta vaikutuksesta induktiovaiheessa, kokei- limme sitä keskimmäisessä viljelyerässämme. Noin viiden viikon kuluttua Kuva 2. Kauran ponsiviljelyn päävaiheet. Haploidi siitepölyhiukkasen esiaste eli mikrospori Alkiorakenteiden indusoituminen Taimien erilaistuminen Ploidiatason määrittäminen ja haploidin perimän kahdentami- nen tarvittaessa DH-linjoja kasvihuoneella Kauran ponsiviljely Taimien juurrutus 13 kehittyneitä alkiorakenteita alettiin siirrostaa erilaistumisalustoille (W14- suolat, MS-rauta, 2 mg/l NAA + 0,5 mg/l kinetiini, 2% sakkaroosi, kiinteä alusta) valoon +25°C:een jatkamaan kehitystään taimiksi. Erilaistuneet taimet poimittiin pinseteillä juurrutusalustoille lasiputkiin tai tarkoitusta varten kehi- tettyihin muovipurkkeihin himmeään valoon. Alusta sisälsi MS-suolat, 0,2 mg/l NAA ja 2% sakkaroosia. Erilaistuneiden taimien ploidiatasot mitattiin lehdistä eristetyistä protoplasteista virtaussytometrillä (Becton Dickinson FACSort) (Kiviharju ym. 2000, Immonen ym. 1999). Haploidin perimäan- noksen omaavat kasvit käsiteltiin kolkisiinilla perimän kahdentamiseksi. Taimet siirrettiin kasvihuoneelle turve-kivennäismaaseosta sisältäviin verk- kopohjaruukkuihin, aluksi muovikuvun alle. Juurtuneet ja vahvistuneet tai- met siirrettiin 10-12 cm ruukkuihin ja kasvatettiin kasvihuonepöydillä alta- kastelussa. Tarkemmat ohjeet löytyvät yllä mainitusta julkaisusta. Siemensa- dot kerättiin talteen ja aineistoa lisättiin kenttäkokeita ja ominaisuusanalyyse- jä varten ensin kasvihuoneella ja vuodesta 2004 alkaen myös kentällä. DNA:n eristykset Aslak × Matilda DH-jälkeläistön lehdistä eristettiin DNA:t hieman muokatul- la CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) - menetelmällä (Poulsen ym. 1993). Aslak × Salo F2-jälkeläistön DNA:t eristettiin käyttäen DNEasy Plant Mini Kit:iä. Ennen eristystä lehdet murskattiin FastPrepTM FP120 – laitteella. DNA-pitoisuudet mitattiin GeneQuant II RNA/DNA Calculator – spektrofotometrillä. Kenttäkokeet Boreal Kasvinjalostus Oy teki Aslak × Matilda DH-linjoilla kenttäkokeet vuosina 2005 ja 2006. Vuonna 2005 aineisto riitti yhden neliömetrin ruuduil- le neljänä kerranteena. Varsinainen kenttäkoe tehtiin vuonna 2006 kuuden neliömetrin ruuduilla kolmella kerranteella. Kasvukausien säät poikkesivat huomattavasti toisistaan: vuoden 2006 kesä oli poikkeuksellisen lämmin. Ominaisuuksien analysointi Aslak × Matilda DH-aineiston β-glukaani- ja öljypitoisuudet (raakarasva) määritettiin MTT:n Palvelulaboratoriossa vuosien 2005 (yhdistetty näyte) ja 2006 (kolme kerrannetta erikseen) kenttäkokeista. β-Glukaanipitoisuus mää- ritettiin kuorituista kauran ytimistä entsymaattis-spektrofotometrisesti Mc- Clearyn ja Coddin (1991) -menetelmällä. Öljypitoisuus määritettiin gravi- metrisesti (näytteet hydrolysoitiin vahvalla suolahapolla ja rasva uutettiin dietyylieetterillä). β-Glukaani- ja öljypitoisuudet esitetään prosentteina kuiva- aineesta. 14 Menetelmät ja tauti-isolaatit kauran lehtilaikkutaudin kestävyyden kasvihuo- netestaukseen tuotettiin MTT:n projektissa: ”Pitkäkestoista lehtilaikkutautien kestävyyttä suomalaiseen ohraan ja kauraan”. Taudinkestävyydet määritettiin kasvihuonekokeessa infektoimalla DH-linjat kahdella eri lehtilaikkutauti- isolaatilla. Boreal Kasvinjalostus Oy määritti lisäksi viljelyominaisuuksiin ja muita laatuun liittyviä ominaisuuksia. Vuoden 2006 kenttäkokeesta määritet- tiin pituusluokan lisäksi myös todelliset pituudet (cm). Aslak × Salo F2- jälkeläistön kadmiumin kertyminen määritettiin kasvihuoneessa satunnaiste- tussa astiakokeessa käyttäen 0,5 mg/l Cd-lisäystä kasvatusalustassa. Van- hemmista kylvettiin neljä kerrannetta, mutta koska F2 –linjojen kaikki yksilöt ovat ainutkertaisia, niistä ei kerranteita ollut mahdollista käyttää. Kadmium mitattiin jyvistä, ja myös vanhempaislajikkeiden korsista ja juurista ICP-MS- menetelmällä (induced coupled plasma massaspektrometri) MTT:n Palvelu- laboratoriossa. DNA-merkit Tutkimuksessa käytettiin erilaisia PCR (Polymerase Chain Reaction) - pohjaisia DNA-merkkejä: mikrosatelliitteja, REMAP- (Retrotransposon- Microsatellite Amplified Polymorphism), IRAP- (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism), RAPD- (Random Amplified Polymorphic DNA), ISSR- (Inter Simple Sequence Repeat), SRAP- (Sequence-Related Amplified Polymorphism), AFLP- (Amplified Fragment Length Polymorphism) ja SNP (Single Nucleotide Polymorphism)- ja SCAR- (Sequence Characterised Amplified Region) merkkejä. PCR-pohjaiset merkit ovat helppokäyttöisiä ja soveltuvat hyvin myös käytännön jalostustyöhön. REMAP-, IRAP-, RAPD-, SCAR- ja ISSR-merkit havainnoitiin agaroosigeelillä, muut merkit sen sijaan automaattisella sekvensointilaitteella fluoresoivan leiman avulla. Mikrosatelliittit ovat muutaman emäksen toistojaksoista koostuvia alueita genomissa. Mikrosatelliitti monistetaan PCR:n avulla käyttäen sitä reunusta- valle alueelle suunniteltua alukeparia. Eri alleelien tunnistaminen perustuu toistojaksojen lukumäärän vaihteluun. Mikrosatelliitit ovat hyvin vaihtelevia ja niitä voidaan käyttää ns. ankkurimerkkeinä verrattaessa eri risteytysten pohjalta tehtyjä geenikarttoja toisiinsa. Kauralle kehitettyjä mikrosatelliitti- merkkejä on vielä suhteellisen vähän (Li ym. 2000, Holland ym. 2001, Pal ym. 2002, Jannink & Gardner 2005), mutta myös ohran (Becker & Heun 1995, Liu ym. 1996, Ramsay ym. 2000) ja rukiin (Hackauf & Wehling 2002) mikrosatelliitteja käytettiin tutkimuksessa. ISSR-merkit monistetaan käyttäen yhtä toistojakson sisältävää aluketta (Zietkiewicz ym. 1994). Retrotransposonimerkit perustuvat perimässä oleviin retroviruksia muistutta- viin sekvensseihin. Niitä on kehitetty MTT:n ja Biotekniikan instituutin Kas- vigenomiikan yhteistoimintalaboratoriossa Viikin Biokeskuksessa (Kalendar ym. 1999, Kalendar & Schulman 2006). REMAP-merkki on alue retrotrans- 15 posonin ja mikrosatelliitin välillä, IRAP-merkki on taas alue kahden retro- transposonin välillä. Työssä käytettiin sekä ohran retrotransposonimerkkejä että projektin aikana kauralle kehitettyjä spesifisiä retrotransposonimerkkejä (yhteensä kehitettiin 52 aluketta, joista 32 tuotti yksittäin käytettynä IRAP- merkkejä). RAPD-merkit monistuvat satunnaisilta alueilta lyhyitä alukkeita (10-11 emästä) käyttämällä, SRAP-geenimerkit intronien ja eksonien raja-alueille suunniteltujen alukkeiden avulla (Li & Quiros 2001). AFLP-merkit perustu- vat DNA:n pilkkomiseen ja monistumiseen (Vos ym.1995). Projektin aikana sekvensoitiin kadmiumin kertymiseen liittyvät RAPD- ja REMAP-merkit, joitakin kadmiumin kertymisen kandidaattigeenejä sekä öljypitoisuuteen vaikuttava kandidaattigeeni ACCaasi (asetyyli-CoA karbok- sylaasi) (Kianian ym. 1999). Sekvensointia varten monistetut bändit leikattiin geeliltä ja puhdistettiin (GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit). Puhdistetut DNA-fragmentit liitettiin vektoriin ja transformoitiin kemiallises- ti TOP10 -soluihin (TOPO TA Cloning Kit for Sequencing). Plasmidi-DNA puhdistettiin (FastPlasmid Mini kit) ja sekvensoitiin kummastakin suunnasta (MegaBACE™ 500 Sequencer). RAPD- ja REMAP-merkkien sekvenssien (sekvenssit geenipankissa) perus- teella suunniteltiin spesifiset alukkeet ja näin merkit saatiin muutettua luotet- tavimmiksi ja helpommin tulkittaviksi SCAR-merkeiksi (Sequence Characte- rised Amplified Region). Kianian ym. (1999) ovat julkaisseet kauralta rasvahapposynteesissä toimivan ACCaasi-entsyymin geenin sekvenssin. Tämän geenin vaikutus kauran öljy- pitoisuuteen on aiemmin todettu suureksi (siihen liittynyt QTL vastasi jopa 48% öljypitoisuuden vaihtelusta). Julkaistua sekvenssiä hyödyntämällä pyrit- tiin pääsemään öljypitoisuuteen vaikuttavaan geeniin käsiksi. ACCaasi-geeni sekvensoitiin osittain ja vanhempien väliltä löytyneiden erojen perusteella kehitettiin kaksi SNP–merkkiä, jotka tunnistivat spesifisesti Aslakin ja Matil- dan alleelit kahdesta eri ACCaasi-lokuksesta. Tilastolliset analyysit Geenikartta laadittiin JoinMap 3.0 (van Ooijen & Voorrrips 2001) - ohjelmalla käyttäen kytkentäkriteerinä LOD (logarithm of odds) -arvoa 8.0 – 10.0. Geneettiset etäisyydet (cM=centiMorgan) laskettiin käyttäen Kosambin kartoitusfunktiota. Laatuominaisuuksiin vaikuttavien kvantitatiivisten geeni- lokusten paikantamiseen käytettiin NQTL–ohjelmistoa (Tinker&Mather 1995). Merkkien segregaatio testattiin χ2 –analyysin avulla. Ominaisuusda- tan kuvailuun käytettiin SAS-ohjelmaa (Univariate Procedure, SAS Institute Ins., Cary, NC). 16 Aslak ja Salo –lajikkeiden välinen ero kadmiumin kertymisessä, sekä DNA- merkkien kytkeytyminen kadmiumin kertymiseen analysoitiin tilastollisesti käyttäen yleistä lineaarista mallia (GLM Procedure, SAS Institute Ins., Cary, NC) ja logaritmimuunnosta. Merkitsevyyden rajana käytettiin P ≤ 0.05. Kadmiumin kertymiseen liittyvien merkkien kytkentäanalyysi tehtiin MAP- MAKER 3.0 (Lander ym. 1987) –ohjelmalla. Geneettiset etäisyydet laskettiin käyttäen Haldanen kartoitusfunktiota. Kadmiumin kertymiseen liittyvän QTL:n (quantitative trait locus) paikantamiseen käytettiin MAPMA- KER/QTL-ohjelmaa. Cd:n kertymiseen liittyvien DNA-merkkien sekvenssejä verrattiin GenBank- ja EMBL-tietokannoissa oleviin sekvensseihin BLAST- ohjelmalla (Altschul ym. 1997). Tulokset ja tulosten tarkastelu Aslak × Matilda DH-linjojen tuotto Aslak × Matilda DH-linjat tuotettiin kolmessa ponsiviljelyerässä (Taulukko 2). Kaiken kaikkiaan heteen ponsia eristettiin 26 070 kappaletta, alkioraken- teita indusoitui 1393 ja niistä 13 % erilaistui vihreiksi taimiksi. Erilaistuneista taimista menetettiin osa juurrutuksessa ja kasvihuonesopeutuksessa, joten röyhylle asti kehittyi 148 tainta. Taimista 39% (58 kpl) oli virtaussytometri- analyysin perusteella kahdentanut kromosomistonsa (heksaploideja) ja 90 sai haploideina kolkisiinikäsittelyn. Albiinokasveja regeneroitui vain muutamia. Taimien tuottotehokkuus jäi tällä risteytysjälkeläistöllä alhaiseksi. Aslakista olemme parhaimmillaan tuottaneet 8 tainta sataa eristettyä pontta kohden ja Aslak × Lisbeth –risteytysjälkeläistöstä 30 tainta sataa pontta kohden, kun nyt tulos jäi 0,6:een kasviin sataa eristettyä pontta kohden. Taimientuottotehok- kuutta pudotti oletettavasti Matildan huono ponsiviljelyvaste: testasimme sen ponsiviljelyssä, eikä taimia saatu. Keskimmäisessä erässä (koe 2) testattu valon vaikutus induktiovaiheessa ei ollut eduksi tällä aineistolla. Ilman sitä Taulukko 2. Ponsiviljelytulokset Aslak x Matilda ponsiviljelystä. Koe Ponsia Alkiorakenteita Erilaistuneita vihreitä taimia Taimia alkioista Kasveja kasvihuo- neella kpl kpl /100 pontta kpl /100 pontta % kpl /100 pontta 1 7770 589 7,6 63 0,8 11 49 0,6 2 pimeä 3000 136 4,5 23 0.8 17 17 0,6 2 valo 11340 234 2,1 33 0,3 14 29 0,3 3 3960 434 11,0 67 1,7 15 53 1,3 Yht. 26070 1393 5,3 186 0,7 13 148 0,6 17 vihreitä taimia olisi saatu keskimäärin 0,8 sataa pontta kohden ja tarvittava ponsimäärä olisi kutistunut 70 prosenttiin nyt eristetyistä. Lopullisen kytken- täkartan kokoamiseen käytettiin 137 DH-linjaa. Ominaisuuksien analysointitulokset Aslak × Matilda DH-linjojen β-glukaanipitoisuudet vuoden 2005 kenttäko- keesta vaihtelivat välillä 2,8 - 5,9 % (keskiarvo 4,1 %). Vuoden 2006 kenttä- kokeen sadosta vaihteluväli oli 2,7 - 4,8 % (keskiarvo 3,7 %). Vuoden 2006 osalta arvot on laskettu kerranteiden keskiarvoista. Aslak × Matilda DH- linjojen jakautuminen β-glukaanipitoisuuksien suhteen sekä vanhempien pitoisuudet on esitetty kuvassa 3. Öljypitoisuuden suhteen vaihteluväli oli suurempi (Kuva 4). Jälkeläislinjojen öljypitoisuus vaihteli vuonna 2005 välillä 4,9 - 10.2 % (keskiarvo 7,8 %) ja vuonna 2006 välillä 6,2 - 10,1 % (keskiarvo 8,1 %). Korkean β-glukaanin ja erityisesti muutamat erittäin korkean öljypitoisuuden omaavat Aslak × Matil- da DH-linjat ovat ponsiviljelyn avulla saavutetun geneettisen yhtenäisyytensä vuoksi hyvin kiinnostavaa aineistoa kauran lajikejalostukseen. Kuva 3. Aslak × Matilda DH-kartoitusjälkeläistön β-glukaanipitoisuudet vuosi- en 2005 ja 2006 kenttäkokeiden sadosta luokiteltuina puolen prosenttiyksikön välein. Vanhempien pitoisuudet olivat vuonna 2005 Aslak 4,6 % ja Matilda 3,7 %, sekä vuonna 2006 Aslak 3,7 % ja Matilda 3,4 %. 18 Kuva 4. Aslak × Matilda DH-kartoitusjälkeläistön öljypitoisuudet vuosien 2005 ja 2006 kenttäkokeiden sadosta luokiteltuina prosenttiyksikön välein. Van- hempien pitoisuudet olivat vuonna 2005 Aslak 6,8 % ja Matilda 9,7 %, sekä vuonna 2006 Aslak 7,4 % ja Matilda 9,6 %. Kuva 5. Aslak × Matilda DH-kartoitusjälkeläistön lehtilaikkutaudin kestävyys kasvihuonealtistuskokeessa kahdella eri tauti-isolaatilla. Vanhempien tau- tisuusluokat olivat isolaatilla 1 tartutettuna Aslak 7,6 ja Matilda 3,2, sekä iso- laatilla 2 tartutettuna Aslak 5,7 ja Matilda 3,8. Luokitteluasteikon mukaan pienet arvot osoittavat kestävyyttä ja suuret alttiutta. 19 Lehtilaikkutaudin kasvihuonealtistuksessa jälkeläislinjojen tautisuus vaihteli isolaatti 1:tä käyttäen välillä 3,0 – 8,5 (keskiarvo 5,6) ja isolaatti 2:sta käyttä- en välillä 3,3 – 7,7 (keskiarvo 5,2). Jälkeläislinjojen jakaumat tautisuuden suhteen on esitetty kuvassa 5. Kenttäkoehavaintojen osalta vuoden 2005 tu- lokset on esitetty kuvassa 6. Tautisuus vaihteli tauti-infektion ilmenemisvai- heessa välillä 1,3 – 4,3 (keskiarvo 2,3) ja taudin maksimaalisessa esiintymis- vaiheessa välillä 2,0 – 7,0 (keskiarvo 4,0). Lehtilaikkutautia ei esiintynyt vuonna 2006. DH-linjojen agronomisten ominaisuuksien mittaustuloksia on esitetty taulukossa 3. Kuva 6. Aslak × Matilda DH-kartoitusjälkeläistön lehtilaikkutaudin kestävyys kenttäkokeessa vuonna 2005. Varhaisen vaiheen havainto Aslakista oli käy- tetyllä luokitteluasteikolla 3 ja Matildasta 1,5. Maksimaalisen infektiovaiheen havainto Aslakista 5,3 ja Matildasta 2,8. Kuva 7. Boreal Kasvinjalostus Oy:n perustama kenttäkoe Joki- oisten Kalsussa (kuva E. Kivi- harju). 20 T au lu kk o 3. A sl ak × M at ild a D H -k ar to itu sj äl ke lä is tö n ag ro no m is ia o m in ai su uk si a til as to lli si n lu vu in k uv ai ltu na v uo si en 2 00 5 ja 20 06 k en ttä ko ke is ta . H lp =h eh to lit ra pa in o, T jp = tu ha nn en jy vä n pa in o, K a= ke sk ia rv o, M ed =m ed ia an i, M in =p ie ni n ar vo , M ax =s uu rin ar vo , Q 1= a la kv ar tii li, Q 3= yl äk va rti ili , K H =k es ki ha jo nt a, S E =k es ki vi rh e. O m in ai su u s V u os i A sl ak M at ild a D H -l in ja t K a M ed M in M ax Q 1 Q 3 K H S E S at o , k g /h a 20 05 16 0 24 10 2 33 11 7 76 12 0 16 (1 21 4) 46 69 16 0 11 10 4 11 13 6 60 26 90 22 9, 8 S at o 20 06 51 88 47 78 43 59 44 09 10 83 64 91 36 47 51 06 10 25 51 H lp , k g 20 05 58 ,5 56 ,5 55 ,0 56 ,0 49 ,2 59 ,8 54 ,5 56 ,9 6, 95 0, 59 H lp 20 06 51 ,6 54 ,1 52 ,4 52 ,5 41 ,5 58 ,7 50 ,7 54 ,3 2, 79 0, 14 T jp , g 20 05 31 ,4 35 ,6 33 ,6 34 ,2 27 ,8 40 ,1 32 ,1 35 ,4 5, 00 0, 43 T jp 20 06 28 ,3 31 ,7 28 ,5 28 ,4 24 ,5 33 ,3 27 ,0 29 ,8 1, 86 0, 16 V al ku ai ne n , % 20 05 14 ,9 14 ,2 13 ,8 14 ,1 10 ,0 17 ,4 12 ,9 15 ,2 2, 62 0, 22 V al ku ai ne n 20 06 16 ,7 17 ,8 17 ,2 17 ,2 13 ,5 21 ,6 16 ,1 18 ,2 1, 69 0, 15 K as vu ai ka , p v 20 05 95 11 3 10 2, 9 10 3, 0 93 11 4 97 10 8 5, 75 0, 49 P itu u sl u ok ka 20 05 8 8 7, 58 8, 0 5 9 7 8 1, 07 0, 09 P itu u s, c m 20 06 71 ,0 69 ,7 67 ,0 67 ,0 44 89 60 73 8, 83 0, 44 T äh kä lle tu lo , p v 20 06 54 ,3 58 ,0 56 ,2 56 54 60 55 58 1, 7 0, 08 21 Geenikartoitus Aslak × Matilda DH – jälkeläistö: β-glukaani- ja öljypitoisuuteen sekä kauran lehtilaikkutaudin kestävyyteen vaikuttavien geenien kartoitus Geenikartoituksessa etsittiin ensin risteytysvanhemmissa monimuotoisia DNA-merkkejä, joilla sitten analysoitiin koko jälkeläistö. Kartoituksessa käytettyjen yksilöiden määrä oli 137. DH-jälkeläistö analysoitiin yhteensä 723 DNA-merkillä. Merkeistä 628 (377 AFLP-, 106 SRAP-, 59 REMAP-, 57 RAPD-, 12 ISSR-, 3 IRAP- ja 2 SNP-merkkiä sekä 12 mikrosatelliittia) sijoittui 28 kytkentäryhmään (ryhmissä enemmän kuin 4 merkkiä ja pituus yli 10 cM). Kartta on esitetty kuvassa 8, ja yhteenveto siitä Taulukossa 4. Merk- kien määrä ryhmissä vaihteli 6:sta 71:een. Kartan kokonaispituus oli 1545 cM. Viljellyllä kauralla on 21 kromosomiparia, mikä tarkoittaa, että jotkut löytämistämme ryhmistä kuuluvat samaan kromosomiin, mutta todennäköi- sesti sijaitsevat kromosomin eri varsissa. Kartan kokoamisessa käytettiin LOD-arvoa 9.0 muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta. LOD-arvoa 8.0 käytettiin järjestettäessä ryhmät 8, 23 ja 25, koska korkeampaa arvoa käyttämällä ne hajoaisivat, vaikka merkit kytkeytyvät toisiinsa vahvasti. Ryhmät 5 ja 6 sen sijaan järjestettiin käyttämällä LOD-arvoa 10.0, koska alemmalla arvolla ne menivät yhteen ja näytti siltä, että vain yksi merkki piti ryhmiä yhdessä. Suuri osa merkeistä (55 %) segregoitui DH-jälkeläistössä poiketen odotetusta lukusuhteesta 1:1. Vinoutuneet merkit kasaantuivat usein tiettyihin kytkentäryhmiin tai tietyille alueille kytkentäryhmissä. Suurin osa vinoutuneesti segregoituvista merkeistä oli vinoja Aslakin alleelin suuntaan (89 %). Tämä oli odotettavissa, koska Aslak toimi paremmin ponsiviljelyssä ja tällöin valintaa tapahtui solukkoviljelyasteella Aslakin suuntaan. Vinosti segregoituneet merkit sijaitsevat siis todennäköisesti kromosomialueilla, joissa on geenejä, jotka vaikuttavat elinkykyyn ponsiviljelyssä. Ilmiö on yleisesti tunnettu eri lajien DH-jälkeläistöissä (Foisset & Delourme 1996, Manninen 2000). Eri kytkentäkarttoja voidaan verrata toisiinsa ankkurimerkkien avulla. Ne ovat usein RFLP-merkkejä (Restriction Fragment Length Polymorphism) tai mikrosatelliitteja. Koska kaikkiin kauran kromosomeihin ei ole mikrosatelliitteja sijoitettu, voidaan meidän kytkentäryhmiämme verrata jo olemassa oleviin karttoihin vain osittain. Kuuden ryhmän vastaavuus olemassa oleviin karttoihin voitiin todentaa. Kartan laatimisessa käytettiin paitsi kauralle kehitettyjä mikrosatelliitteja, myös ohran, vehnän ja rukiin mikrosatelliitteja. Nämä toimivat kohtuullisesti, mutta monimuotoisuus oli vähäistä: 37 testatusta mikrosatelliitista vain kolme oli monimuotoista vanhempien välillä. 22 K uv a 8. K au ra n ge en ik ar tta , j ok a si sä ltä ä 28 k yt ke nt är yh m ää . D N A -m er kk ie n ni m et o n es ite tty k un ki n ky tk en tä ry hm än o ik ea lla p uo le lla ja et äi sy ys ry hm än p ää st ä va se m m al la p uo le lla . β -G lu ka an ip ito is uu te en ( vu on na 2 00 5: B G -0 5 ja v uo nn a 20 06 : B G -0 6) , ö ljy pi to is uu te en (v uo nn a 20 05 : R -0 5 ja v uo nn a 20 06 : R -0 6) ja le ht ila ik ku ta ut iin (k as vi hu on ee lla is ol aa tti 1 : L L1 ja is ol aa tti 2 : L L- 2 se kä p el lo lla 2 00 5: L L- P ) va ik ut ta vi en g ee ni al ue id en s um m itt ai ne n pa ik ka m er ki tty p ys ty vi iv oi lla . 23 24 25 26 27 Taulukko 4. Yhteenveto kauran geenikartasta. Vinosti segregoituvat merkit Ryhmä Merkkien määrä Pituus (cM) liikaa Aslakia liikaa Matildaa yht. 1 47 71 9 0 9 2 42 47 0 7 7 3 25 92 20 0 20 4 12 38 11 0 11 5 8 34 5 0 5 6 7 44 7 0 7 7 71 102 62 0 62 8 20 42 20 0 20 9 7 19 7 0 7 10 52 62 19 0 19 11 13 23 2 1 3 12 17 34 17 0 17 13 51 101 17 0 17 14 37 107 9 0 9 15 24 37 21 0 21 16 15 71 0 6 6 17 36 84 25 0 25 18 28 33 28 0 28 19 18 119 0 3 3 20 7 42 3 0 3 21 24 30 0 21 21 22 6 33 1 1 2 23 15 50 0 0 0 24 9 63 5 0 5 25 8 73 4 0 4 26 14 36 0 0 0 27 6 25 5 0 5 28 9 33 7 0 7 yht. 628 1545 304 39 343 QTL-analyysit (Kuva 8) pohjautuivat vuoden 2005 ja 2006 kenttäkokeiden ominaisuustietoihin. Öljypitoisuuteen vaikuttavia kromosomialueita löytyi seitsemän, näistä neljä oli samoja kumpanakin havainnointivuotena. Kukin QTL selitti 12 – 29 % öljypitoisuuden vaihtelusta ja Matildan alleelit lisäsivät öljypitoisuutta. Matilda on vanhemmista se, jonka öljypitoisuudet olivat kor- keammat. Öljypitoisuuteen vaikuttavaan kandidaattigeeniin, ACCaasiin, ke- hitettyjen SNP–merkkien avulla, pystyttiin paikantamaan öljypitoisuuteen vaikuttavat kromosomialueet suhteessa ACCaasi-geeneihin. Kaksi öljypitoi- suuteen vaikuttavista QTL-lokuksista sijoittui samoihin kytkentäryhmiin kuin 28 ACCaasi-lokukset, mikä vahvistaa ACCaasi-geenin vaikuttavan öljypitoisuu- teen myös meidän kaurajälkeläistössämme. β-Glukaaniin vaikuttavia kro- mosomialueita löytyi kaksi, jotka yhdessä selittävät 37 % ominaisuuden vaih- telusta populaatiossa. Aslakin alleeleilla on odotetusti β-glukaania lisäävä vaikutus, onhan Aslak risteytysjälkeläistön vanhemmista se, jolla on korke- ampi β-glukaanipitoisuus. Sekä β-glukaanin että öljypitoisuuden suhteen edulliset alleelit tulevat vain toiselta vanhemmalta; näin ollen tästä risteytyk- sestä ei ole odotettavissa geenikombinaatioita, jotka nostaisivat jälkeläislinjan ko. ominaisuudessa vanhempaislajiketta paremmaksi. Tämä näkyy erityisen selvästi öljypitoisuudessa, jonka suhteen jälkeläistöstä ei juurikaan löydy Matildaa parempia linjoja (Kuva 4). Lehtilaikkutaudin kestävyyttä testattiin kasvihuoneella kahdella eri isolaatilla ja havainnoitiin peltokokeissa. Kasvihuoneella toista isolaattia kohtaan löytyi kaksi vaikuttavaa kromosomialuetta (vaikutus 15 - 34 %) ja toista isolaattia kohtaan yksi (vaikutus 24 %). Vaikuttavat kromosomialueet olivat isolaattis- pesifisiä. Peltokokeissa löytyi kolme vaikuttavaa aluetta, joista yksi oli sama kuin kasvihuoneella löytynyt. Matildan alleelit lisäsivät lehtilaikkutaudinkes- tävyyttä. Virallisten lajikekokeiden perusteella oli odotettavissa eroja Aslakin ja Matildan kenttäkestävyydessä, Matildan ollessa kestävämpi, vaikka varsi- naisia suurivaikutteisia kestävyysgeenejä lehtilaikkutautia vastaan ei kum- massakaan lajikkeessa tiettävästi ole. Peltokokeissa löytyneillä kromosomi- alueilla saattaa siis esim. olla geenejä, jotka hidastavat taudin etenemistä. Kauran lehtilaikkutautia on tutkittu vähän ja saamiemme tulosten tulkitsemi- nen vaatii lisätutkimuksia. Mikäli kauraan halutaan jalostaa tehokkaasti lehti- laikkutaudin kestävyyttä, tulisi etsiä hyviä kestävyyslähteitä ja takaisinristeyt- tää suurivaikutteiset kestävyysgeenit kauran jalostusmateriaaliin. Tätä pro- sessia kyettäisiin suuresti helpottamaan kestävyysgeeneihin liittyvillä DNA- merkeillä. Myös agronomisia ominaisuuksia määritettiin ja niihin vaikuttavia geenilo- kuksia voitiin sijoittaa geenikartalle (Taulukko 5). Eri vuosina saattoi löytyä eri määrä ominaisuuteen vaikuttavia lokuksia, mikä on ymmärrettävää silloin, kun kyseessä ovat monimutkaisesti määräytyvät ominaisuudet, joihin ympä- ristöolosuhteet vaikuttavat. Vuodet 2005 ja 2006 olivat sääoloiltaan varsin erilaiset. Myös koeruudut olivat eri kokoisia, vuonna 2005 yhden neliön ruu- tuja ja vuonna 2006 kuuden neliön ruutuja, mikä vaikutti varsinkin sato- ominaisuuksien määrittämiseen. Tietyt kromosomialueet vaikuttivat useaan eri ominaisuuteen, esim. kytkentäryhmissä 7 ja 11 olevat QTL:t vaikuttivat sekä rasva- että valkuaisainepitoisuuteen. Jalostajan kannalta jalostettaviin ominaisuuksiin vaikuttavien geenien sijainti lähekkäin voi olla sekä etu että haitta. Jos edulliset geenimuodot eli alleelit tulevat ristetyksessä samalta van- hemmalta, kuten tässä tapauksessa öljy- ja proteiinipitoisuutta kohottavat alleelit Matildalta, ne on risteytyksissäkin helpompi säilyttää mukana kun ne sijaitsevat samalla kromosomialueella. Jos taas halutaan yhdistää kahden eri vanhemman edulliset ominaisuudet jälkeläistössä, ominaisuuksiin vaikuttavi- 29 en geenien sijaitseminen lähekkäin tekee jalostuksen työläämmäksi. Tarvi- taan hyvin suuri jälkeläistö, jotta kyetään löytämään jälkeläislinja, jossa re- kombinaatio on tapahtunut juuri noiden lähekkäin sijaitsevien geenien välis- sä. Silloin kun ominaisuuteen vaikuttivat useat lokukset, ominaisuutta lisäävä alleeli saattoi olla peräisin kummalta vanhemmalta hyvänsä. Tällaisia omi- naisuuksia olivat mm. valkuaispitoisuus, tuhannen jyvän paino, kasvuaika ja satoisuus. Näissä tapauksissa jälkeläistöstä on mahdollista löytää linjoja, jotka ovat tietyssä ominaisuudessa geneettisesti molempia vanhempiaan pa- rempia. Merkkiavusteisen jalostuksen avulla on mahdollista erottaa jälkeläi- sistä ne, jotka kantavat mahdollisimman suurta määrää edullisia alleeleita. Pitkälle edistyneessä merkkiavusteisessa jalostuksessa voitaisiin valita jo vanhemmiksi sellaiset lajikkeet, joiden geenit täydentävät hyvin toisiaan ja tuottavat vanhempiaan parempia jalostuslinjoja. Taulukko 5. Agronomisiin ominaisuuksiin vaikuttavien geenilokusten sijoittu- minen geenikartalle. Ominaisuudet mitattiin kahtena vuotena kolmea ominai- suutta lukuun ottamatta. Ominaisuus Kytkentä- ryhmä 2005 Kytkentä- ryhmä 2006 Ominaisuut- ta lisäävä alleeli yksittäisen QTL:n vai- kutus (%) Valkuaisainepi- toisuus 7, 11, 12, 19, 21 7, 11, 19, 21 Aslakilta ja Matildalta 11 - 35 Hehtolitrapaino 15, 19 12 Aslakilta 10 - 16 Tuhannenjy- vänpaino 7, 17, 27 27 Aslakilta ja Matildalta 9 - 13 Kasvuaika 12, 17, 19 - Aslakilta ja Matildalta 11 - 35 Pituus - 7, 9, 17 Aslakilta 17 – 32 Sato - 12, 19 Aslakilta ja Matildalta 14 - 41 Aslak × Salo F2 – jälkeläistö: kadmiumin kertymiseen vaikuttavi- en geenien kartoitus Kadmiumin kertymiseen Aslak ja Salo lajikkeisiin vaikuttivat lajike ja kas- vinosa (Kuvat 9 ja 10). Kadmiumpitoisuudet olivat suurimmat juurissa ja pienimmät jyvissä. Lajikkeiden välinen ero oli pienin juurissa ja suurin jyvis- sä. F2-kasvien jyviin kertyi kadmiumia keskimäärin 1575 µg/kg ja linjojen pitoi- suudet vaihtelivat välillä 650 - 3490 µg/kg. Yksilöiden jakautuminen ominai- suuden suhteen (Kuva 11) viittaa siihen, että kadmiumin kertymistä säätelee yksi suurivaikutteinen geeni yhdessä muutamien pienivaikutteisempien gee- nien kanssa. 30 ■ Juuri Korsi Jyvä K ad m iu m pi to is uu s µg /k g 0 1000 2000 3000 4000 Aslak Salo Kuva 9. Kadmiumin kertyminen Aslakin ja Salon juuriin, korsiin ja jyviin kasvi- huoneessa suoritetussa astiakokeessa, kun kasvatusalustana käytettyyn turve-kivennäismaa seokseen oli lisätty 0,5 mg/kg kadmiumia. Kuva 10. Astiakoe jossa tutkittiin kauralajikkeiden kadmiuminke- räämiskykyä kasvatusalustassa, johon oli lisätty kadmiumnitraat- tia. (kuvat E. Kiviharju) 31 Kuva 11. Kadmiumin kertyminen jyviin Aslak × Salo F2-jälkeläisissä. Van- hemmista on ilmoitettu neljän kerranteen keskiarvo. Kadmiumpitoisuus ana- lysoitiin ICP-MS –menetelmällä. Kadmiumiin liittyvää DNA-merkkiä etsittiin kandidaattigeenien sekä BSA- menetelmän (Bulked Segregant Analysis, Michelmore ym. 1991) avulla. Erot Aslakin ja Salon kadmiumin kertymisessä voivat johtua useastakin eri syystä. Astiakokeen tulokset viittasivat siihen mahdollisuuteen, että erot voisivat liittyä kadmiumin kulkeutumiseen kasvin sisällä (jyvissä suurempi ero ker- tymisessä kuin juurissa). Kandidaattigeeneiksi valittiin sen vuoksi kuljettaja- proteiineja (Clemens 2001): IRT2 riisiltä (vastaa Arabidopsiksen IRT1:tä, joka mahdollisesti kuljettaa kadmiumia), ZIP4 Arabidopsikselta (kuljettaa sinkkiä ja kadmiumia), LCT1 vehnältä (kuljettaa kalsiumia ja kadmiumia), Nramp3 riisiltä (kuljettaa rautaa ja kadmiumia), lisäksi fytokelatiinisyn- taasigeeni, joka inaktivoi kadmiumia. Näiden geenien sekvensseihin perustu- en suunniteltiin alukkeita ja yritettiin monistaa vastaavia geenejä kauralta. Osa geeneistä ei monistunut lainkaan ja osasta monistui tuote, joka ei kuiten- kaan sekvensointituloksen perusteella näyttänyt olevan haluttu geeni. Syynä on todennäköisesti se, että kun alukkeet on suunniteltu toisen lajin sekvenssin perusteella, täytyy monistettaessa käyttää melko alhaista kiinnittymislämpöti- laa, jolloin saattaa monistua vääriäkin geenejä. Kandidaattigeenilähestymis- tapa ei siis tuottanut tulosta. BSA-menetelmässä yhdeksän mahdollisimman vähän kadmiumia keräävän F2-yksilön ja yhdeksän mahdollisimman paljon kadmiumia keräävän F2- yksilön DNA:t yhdistettiin kahdeksi bulkkinäytteeksi. Bulkkeja testattiin 32 DNA-merkeillä ja jos löytyi bulkeissa monimuotoinen DNA-merkki, se ana- lysoitiin bulkkien yksittäisissä kasveissa. Mikäli merkki näytti liittyvän kad- miumin kertymiseen, se lopulta analysoitiin koko F2-jälkeläistössä. Aluksi kuitenkin testattiin Aslakia ja Saloa monimuotoisten DNA-merkkien löytä- miseksi yhteensä 218 RAPD-, 31 SRAP- ja 337 REMAP-alukeyhdistelmällä. Vanhemmissa monimuotoisista DNA-merkeistä (78 RAPD-, 26 SRAP- ja 73 REMAP-merkkiä) myös bulkeissa monimuotoisiksi todettiin kaksi RAPD-, 5 SRAP- ja 4 REMAP-merkkiä, jotka analysoitiin bulkkien yksittäisissä kas- veissa. Kadmiumin kertymiseen näytti kytkeytyvän neljä merkkiä (kaksi RAPD-merkkiä: AF15 ja AF20, yksi SRAP: me1em6 ja yksi REMAP: A002+(AC)9G), jotka analysoitiin koko F2-populaatiossa ja niiden liittyminen kadmiumin kertymiseen varmistui (Taulukko 6). Muut paitsi SRAP-merkki muutettiin helppokäyttöisemmiksi SCAR-merkeiksi. RAPD AF20 muuttui kodominoivaksi SCAR-merkkinä. Kaikki neljä merkkiä kartoittuvat lähelle toisiaan lyhyelle alueelle (10.2 cM), joka sisälsi kadmiumin kertymiseen vaikuttavan geenilokuksen. Lokus selitti kadmiumin vaihtelusta yli 50 % eli on suurivaikutteinen lokus. Taulukko 6. DNA-merkkien liittyminen kadmiumin kertymiseen (keskiarvo ± keskihajonta; yksilömäärä suluissa) varianssianalyysillä testattuna (F= tes- tisuure, R2 = se osa fenotyyppisestä vaihtelusta, joka voidaan selittää merkin avulla, P < 0.0001). A = yksilöt, joilla on merkki, C = yksilöt, joilta merkki puut- tuu; poikkeuksena SCAR AF20, joka oli kodominoiva, ja sen vuoksi A ja C edustavat yksilöitä, joilla on eri kokoiset alleelit ja B heterotsygootteja. DNA-merkki Cd:n kertyminen (µg/kg) F R2 A B C SCAR AF20 1151 ± 332 (37) 1463 ± 384 (69) 2107 ± 508 (44) 54,21 0,42 SCAR AF15 1702 ± 539 (118) - 1103 ± 257 (32) 44,05 0,23 SCAR A002+(AC)9G 1371 ± 411 (109) - 2117 ± 506 (41) 71,82 0,33 SRAP me1em6490 1388 ± 421 (104) - 2051 ± 549 (43) 66,79 0,31 Merkit sekvensoitiin ja verrattiin geenipankissa oleviin sekvensseihin. SCAR AF15 oli homologinen (nukleotidivastaavuus 225/267 = 87 %) vehnän WAK3 (wall-associated kinase) – geenin kanssa. WAKit kuuluvat resepto- rinkaltaisten kinaasien geeniperheeseen, ja niillä on monenlaisia tehtäviä mm. Arabidopsiksella WAK vaikuttaa alumiinitoleranssiin (Sivaguru ym. 2003) ja WAKin kaltainen proteini (WAKL4) indusoituu kuparilla, nikkelillä ja sin- killä (Hou ym. 2005). WAK3 saattaa siis olla Cd:n kertymisen kandidaatti- geeni, mutta asia vaatii lisäselvityksiä. 33 Yhteenveto Tässä tutkimuksessa laadittiin kauran geenikartta käyttäen pohjoismaista Aslak × Matilda risteytysjälkeläistöä. Kartta on ainutlaatuinen myös siksi, että siinä käytettiin ponsiviljelyssä tuotettua DH–jälkeläistöä. Karttaan pai- kannettiin useita laatu- ja taudinkestävyysominaisuuksiin vaikuttavia kro- mosomialueita, ja alustavissa analyyseissä löytyi myös viljelyominaisuuksiin vaikuttavia alueita. Kauranjalostaja voi käyttää karttaa apuna uusien lajikkei- den jalostamisessa, koska sen avulla saadaan tietoa näiden hyödyllisten omi- naisuuksien periytymisestä. Lisäksi lähellä toivottuun ominaisuuteen positii- visesti vaikuttavaa geeniä olevia DNA-merkkejä voidaan käyttää merk- kiavusteisessa valinnassa. Kaikki kartalle paikannetut ominaisuudet ovat sellaisia, joihin vaikuttaa useampi kuin yksi geeni, jolloin yksittäisen geenin vaikutus ei välttämättä ole kovin suuri. Tällöin DNA-merkeillä kannattaa valita useampaa geeniä yhtaikaa. Toista risteytysjälkeläistöä käyttäen (Aslak × Salo F2-jälkeläistö) löydettiin kadmiumin kertymiseen kytkeytyneitä DNA-merkkejä. Varsinkin SCAR AF15-merkki olisi erityisen sopiva käytettäväksi merkkiavusteisessa valin- nassa, koska se tunnistaa alhaisen keräytymisen suhteen homotsygootit yksi- löt. Merkki ei antanut risteytysjälkeläistössämme yhtään jalostajan kannalta ’haitallisen’ väärää tulosta eli osoittanut alhaiseksi kerääjäksi kasvia, joka itse asiassa olisikin kerännyt paljon kadmiumia. 34 Geeninsiirtojen hyödyntäminen jalostuksessa Anneli Ritala1), Tapani Suortti1), Ruslan Kalendar 2), Marjatta Salmenkallio- Marttila1), Kirsi-Marja Oksman-Caldentey1), Alan Schulman 2,3) ja Anna Maria Nuutila1) 1) VTT,Valtion teknillinen tutkimuskeskus, PL 1000, Tietotie 2, 02044 VTT, Espoo, etuni- mi.sukunimi@vtt.fi; 2) MTT / BI Kasvigenomiikan laboratorio, Biotekniikan instituutti, PL 56, 00014 Helsingin yliopisto, etunimi.sukunimi@helsinki.fi 3) MTT, Biotekniikka- ja elintarviketutkimus, Kasvigenomiikka, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etunimi.sukunimi@mtt.fi Johdanto Perinteinen viljelykasvien lajikejalostus on aikaa vievää. Nykyaikaisen bio- tekniikan avulla voidaan kuitenkin tehostaa ja lyhentää lajikkeenjalostusoh- jelmia. Lisäksi avautuu kokonaan uusia mahdollisuuksia muuttaa viljelykas- vien perimää. Näin viljelijöiden, kuluttajien ja teollisuuden toiveisiin voidaan vastata entistä nopeammin. Elintarviketeollisuutta kiinnostavat kauran terveysvaikutukset. Yhdysvallois- sa FDA hyväksyi kauratuotteisiin terveysväittämän "Runsaasti kauralesettä tai kaurahiutaleita sisältävä vähärasvainen ja -kolesterolinen ruokavalio voi alentaa sydäntautiriskiä". Tämä oli seurausta The Quaker Oats Companyn vuonna 1995 tekemästä anomuksesta, jonka tueksi he esittivät 37 tutkimusta vuosilta 1981 - 1994 (Paul ym. 1999). Kauran terveysvaikutukset yhdistetään pääosin kauran sisältämään β-glukaaniin. β-Glukaani on ravintokuitua, joka ei pilkkoudu ruuansulatusentsyymien vaikutuksesta. Suurin osa β-glukaanista (n. 60%) on ns. liukoista ravintokuitua, joka aiheuttaa seerumin kolesterolin alenemisen sekä tasapainottaa veren aterianjälkeistä glukoosi- ja insuliinipi- toisuuden nousua. Nämä terveysvaikutukset taas vähentävät riskiä sairastua sydän- ja sepelvaltimotauteihin. Ensimmäiset geeninsiirrot kasveihin tehtiin jo 1980-luvun alussa, mutta me- netelmät geenien siirtämiseksi viljoihin kehitettiin vasta 1990-luvulla partik- kelipommituksen tullessa laajaan käyttöön. Ensimmäisinä tuotettiin siirto- geeninen maissi vuonna 1990 (Fromm ym. 1990) ja riisi vuonna 1991 (Chris- tou ym. 1991). Somers ja työtoverit (1992) tuottivat ensimmäisen siirtogeeni- sen kauran käyttämällä embryogeenistä soluviljelmää partikkelipommituksen kohdemateriaalina. Myöhemmin Gless ja työtoverit (1998) raportoivat käyt- täneensä menestyksekkäästi myös kauran lehdentyvisolukkoa geeninsiirron kohteena. Useat ryhmät käyttävät edelleen embryogeenistä soluviljelmää kohdemateriaalina (Kaeppler ym. 2000). 35 Geeninsiirtojen avulla voidaan tehdä ns. täsmäjalostusta, eli kasviin voidaan siirtää ainoastaan juuri haluttu geeni. Lisäksi menetelmä mahdollistaa sen, että haluttua ominaisuutta koodaava geeni voidaan etsiä lajista, joka ei perin- teisillä menetelmillä risteytyisi esimerkiksi kauran kanssa. Tällaisella täsmä- jalostuksella voidaan vaikuttaa kasvin moniin eri ominaisuuksiin, mm. laatu- tekijöitä voidaan parantaa elintarvikekäyttöä varten. Risteytysjalostuksella voidaan vaikuttaa kauran β-glukaanipitoisuuteen kau- ralajikkeissa esiintyvän vaihteluin rajoissa (Holthaus ym. 1996, Humphreys & Mather 1996, Baur & Geisler 1996a, Baur & Geisler 1996b, Kibite & Ed- ney 1998). Moderni biotekniikka tarjoaa mahdollisuuden ominaisuuden täs- mäjalostukseen. Kauraan voidaan siirtää tehokkaampi β-glukaanisyntaasia koodaava geeni, ja siten nostaa β-glukaanipitoisuus korkeammalle tasolle kuin perinteisen risteytysjalostuksen keinoin on mahdollista. Kuluttajahyväksyntää GM-kasveja kohtaan voidaan todennäköisesti parantaa, kun sovellusgeeni on kasviperäinen, eikä kasveissa ole halutun sovellusgee- nin lisäksi merkkigeenejä. Lisäksi laatuominaisuuksien parantaminen, esi- merkiksi korkeamman β-glukaanipitoisuuden omaava kaura, lienee kuluttajil- le hyväksyttävämpi tavoite kuin esimerkiksi torjunta-aine tai viruskestävyy- den parantaminen. Heinäkasveissa esiintyvän (1->3)(1->4)-β-D-glukaanin biosynteesiä oltiin projektin alkaessa vasta selvittämässä, eikä sen tutkimises- sa oltu vielä päästy geenitasolle (Buckeridge ym. 1999). Toisaalta, ongelmaa oli lähestytty perinteisen biokemian keinoin. Geenikartoitus ja EST-krjastot (Expressed Sequence Taq) avasivat työhön uusia mahdollisuuksia. Tavoittee- na oli etsiä ohran EST-kirjastosta β-glukaanisyntaasigeeni homologiahaulla ja käyttää kasviperäistä geeniä geeninsiirroissa. Aineisto ja menetelmät Kauran mikrosporiviljely Kauran mikrosporiviljelymateriaalina käytettiin kotimaisia kauralajikkeita Aslak ja Veli. Materiaali kerättiin kasvihuoneelta mikrosporien ollessa kes- kiyksituma – aikaisessa kaksitumavaiheessa. Shokkikäsittelyinä käytettiin 1- 6 viikon +4ºC -kylmäsäilytystä avaamalla röyhyt petrimaljoille kostean suo- datinpaperin päälle. Mikrosporien eristyksessä tähkylöiden hienontamisessa käytettiin tehosekoitinta. Tähkylöiden kärjistä leikattiin puolet pois ja loppu- osa paloiteltiin mahdollisimman pieniksi paloiksi. Eristysliuoksena käytettiin 0,3M mannitolia ja mikrosporit kerättiin siivilöimällä ja sentrifugoimalla (85 g, 10 min) erilleen muusta solukkojätteestä. Elävien mikrosporien fraktio rikastettiin maltoosigradienttifuugauksella (25 % (w/v) maltoosi). Kasva- tusalustoina ja viljelymenetelminä käytettiin sekä Kiviharju ym. (2005) kau- ran ponsiviljelylle optimoimia olosuhteita, että ohran mikrosporiviljelylle optimoituja alustoja ja olosuhteita (Ritala ym. 2001). 36 Kauran solukkoviljely Kauran solukkoviljelmiä tuotettiin lajikkeista Kolbu, Aslak ja Veli käyttäen Somersin ja työtovereiden menetelmää (1992). Kypsät jyvät pintasteriloitiin seuraavan käsittelyn mukaisesti: 70 % etanoli kolme minuuttia, 8-10 % nat- riumhypokloriitti 20 minuuttia ja viisi huuhtelua steriilillä vedellä. Jyvien annettiin itää 2-3 vuorokautta pimeässä +22°C lämpötilassa. Jyvien kasvupis- teet eristettiin MS-pohjaiselle kasvualustalle (2mg/l 2,4-D, Murashige ja Skoog 1962, Bregitzer ym. 1989, Kaeppler ym 2000) ja kasvatettiin pimeässä +22°C lämpötilassa. Noin kolmen viikon kuluttua kasvupisteistä oli indusoi- tunut embryogeenistä kallusta. Solukot siirrostettiin noin kuukauden välein uusille kasvualustoille. Kaurasolujen soluseinien mikroskooppinen tarkastelu Kaurasolujen soluseinien mikroskooppinen tarkastelu suoritettiin Salmenkal- lio-Marttila ym. (2004) mukaan. Mikroskooppista tarkastelua varten kau- rasolukkoa levitettiin ohueksi kerrokseksi objektilasille ja näytteiden annet- tiin hiukan kuivahtaa. Sivelynäytteet värjättiin 0,001 % (w/v) Calcofluor White:lla (Fluorescent brightener 28, Aldrich, Saksa). Jyvät fiksoitiin 1 % glutaraldehydillä 0,1 M fosfaattipuskurissa pH 7,0, pestiin vedellä, kuivattiin nousevassa etanolisarjassa (50 % - 70 % - 94 %), imeytettiin muoviin ja po- lymeroitiin valmistajan ohjeiden mukaan (Historesin Embedding Kit, Reichert-Jung, Saksa). Näytteistä leikattiin mikrotomilla 4 µm leikkeitä. Leikkeet värjättiin 0,1 % hapan fuksiinilla (Gurr BDH Chemicals Ltd, Poole, UK) ja 0,01 % Calcofluorilla. Näytteitä tarkasteltiin Olympus BX-50 mikro- skoopilla UV-valossa (epifluoresenssi: eksitaatio 400–410 nm, emissio >500 nm): hapan fuksiini värjää proteiinin punaiseksi, calcofluorilla värjätyt solu- seinät erottuvat vaalean sinisenä, tärkkelys ei värjäydy vaan erottuu tumma- na. Fluoresoivassa valossa β-glukaania sisältävät soluseinät näkyvät vaalean sinisinä: heikko fluoresenssi indikoi matalaa β-glukaanin pitoisuutta, voima- kas fluoresenssi indikoi suurempaa β-glukaanin pitoisuutta. Näytteet valoku- vattiin käyttäen SensiCam PCO CCD kameraa (Kelheim, Saksa) ja AnalySIS 3.0 -ohjelmaa (Soft Imaging System, Münster, Saksa). β-Glukaanimääritykset HPLC-menetelmällä Solukkojen ja jyvien β-glukaanimääritykset tehtiin Suortti (1993) mukaan. Näytteet jauhettiin hienoksi ja liuotettiin 0,1N NaOH- 0,1% NaBH4 liuok- seen. Nestekromatografialaitteisto koostui Alliance-nestekromatografista ja M474-fluoresenssidetektorista (eksitaatio 410 nm ja emissio 430 nm). Ko- lonnit olivat µHydrogel 2000, 500 ja 250 (60°C lämpötilassa) ja eluenttina käytettiin 50 mM NaOH (500 µL/min virtausnopeudella). Kolonnin jälkeen eluenttiin sekoitettiin Calcofluor-reagenssia (400 µL/min, 120 mg/l väkevyi- 37 senä) ja muodostuneen fluoresoivan kompleksin fluoresenssi mitattiin. Kvan- titatiivisen analyysin pohjana käytettiin kaupallisen ohran β-glukaanin eri väkevyisiä standardiliuoksia. Molekyylipainon määrityksen pohjana käytet- tiin eri molekyylipainoisia β-glukaanistandardeja, joiden molekyylipaino oli määritetty valonsirontadetektorilla. Siirtogeenisten kaurasolukkojen tuottaminen Mikrobiaalisen geta-glukaanisyntaasin ekspressoimiseksi kaurassa rakennet- tiin geeninsiirtovektori pARM01, jossa mikrobiaalista 1,3-β-D- glukaanisyntaasia koodaava geeni (GSC1, Inoe ym. 1995) vietiin BamH1- fragmenttina konstitutiivisen maissin ubikitiini promoottorin (ubi) ja ensim- mäisen intronin (I) säätelyyn. Embryogeenistä kallusta (n. 16 – 18 viikkoa kasvupisteiden eristyksestä) pommitettiin pARM01- plasmidilla yhdessä pKRA-plasmidin kanssa. Jälkimmäinen sisältää siirtogeenisten solujen selek- tioapuvälineenä käytetyn herbisidiresistenssigeenin (bar) myös ubikitiini promoottorin ja ensimmäisen intronin säätelyssä. Geeninsiirto pommittamalla tehtiin laitteella Bio-Rad, PDS-1000/He käyttäen Wan & Lemaux (1994) ja Kaeppler ym (2000) menetelmiä. Pommitusta varten solukko siirrostettiin osmoosialustalle (0.2M mannitoli ja 0.2M sorbitoli) n. neljä tuntia ennen pommitusta (Kaeppler ym. 2000). Pommitettua solukkoa inkuboitiin os- moosialustalla n. 16 - 18 tuntia, jonka jälkeen se siirrettiin normaalille MS- pohjaiselle alustalle. Noin viikon kuluttua pommituksesta solukko siirrostet- tiin 3 mg/l fosfinotrisiini-selektiolle. Solukkoja kasvatettiin pimeässä +22°C:ssa. Selektiolla kasvamaan lähteneet solulinjat siirrostettiin uusille alustoille 3-4 viikon välein. Siirtogeenisten kaurasolukkojen regenerointi kasveiksi Siirtogeenisiksi PCR-analyysillä osoitetut solukot maljattiin MS-pohjaiselle alustalle (0,2 mg/l BAP, 2 mg/l NAA, 3 mg/l fosfinotrisiini; Bergitzer ym. 1989) valoon +22°C. Pienet regenerantit siirrettiin MS-pohjaiselle juurru- tusalustalle (ei kasvuhormoneja, 2 mg/l fosfinitrisiini; Bergitzer ym. 1989). Juurtuneiden versojen siirtogeenisyys varmennettiin PCR-analyysillä ja ne siirrettiin multaan kasvihuoneelle. Siirtogeenisten kaurasolukkojen ja kasvien analysointi PCR ja Southern blot –tekniikoilla Siirtogeenisyyden varmentamiseksi kalluksista ja kasvien lehdistä eristettiin totaali-DNA käyttäen CTAB-menetelmää (Murray ja Thompson 1980). Polymeraasiketjurektioanalyysiä (PCR) varten GSC1-geenille suunniteltiin seuraavat alukkeet: GSC1L 5´-AACCTTATCAGGGCCAAACG ja GSC1R 5´-GATATGACGAACTCTTTCCAGGG, joiden avulla PCR-ajossa amplifi- oidaan 899 bp-fragmentti. PCR-ajot tehtiin Peltier Thermal Cycler – laitteella 38 8PTC-2000, MJ Research), primerien kiinnittymislämpötilana (annealing) käytettiin 56°C ja syklejä ajettiin 35. Southern blot hybridisaatio – analyysiä varten digestoitiin 100 µg genomista DNA:ta Eco RI entsyymillä. Digestoitu DNA eroteltiin elektoforeesin avulla 0,8 % agaroosigeelissä. Geeli blotattiin Hybond-N (Amersham) kalvolle. Hybridisaatiokoettimena käytettiin digi-leimattua 899bp GSC1-fragmenttia (DIG High Prime DNA Labelling and Detection Kit, 1585614 Roche). Hyb- ridisaatiot, filtterien pesut ja detektiot tehtiin DIG-leimauskitin ohjeiden mu- kaan. Siirtogeenin ilmenemisen analysointi RT-PCR-tekniikan avulla Siirtogeenin ilmeneminen analysoitiin semi-kvantitatiivisen RT-PCR avulla Sasaki ym. (2005) mukaan. Solukoista eristettiin kokonais-RNA käyttäen Qiagen Rneasy Plant Mini Kittiä (74904). Seuraavaksi eristetty RNA kään- teistranskriptoitiin (RT) SuperScript III Rnase H transkriptaasilla (Invitro- gen). RT-tuotetta käytettiin templaattina PCR:ssa ja alukkeina toimivat GSC1L ja GSC1R ja DNA-polymeraasina käytettiin Taq. Semi- kvatitatiivisessa RT-PCR:ssa käytettiin kontrollina aktiinia. Tulokset ja tulosten tarkastelu Kauran mikrosporiviljely Yleisesti ottaen geeninsiirto haploideihin soluihin nopeuttaa siirtogeenisten kasvien tuottamista, koska siirtogeeni saadaan perimän kahdentamisen seura- uksena suoraan molempiin vastinkromosomeihin heti ensimmäisessä suku- polvessa. Projektissa "Kasvibiotekniikan soveltaminen kauranjalostuksessa" tehtiin alustavia geeninsiirtokokeita haploideihin embryogeenisiin solukko- linjoihin. Nämä linjat oli aloitettu ponsiviljelyssä tuotetuista haploideista kalluksista. Haploidien soluviljelmien tuottoa voidaan nopeuttaa, kun aikaa- vievä heteen ponsien eristämisvaihe jätetään pois ja viljellään eristettyjä mik- rosporeja. Eristettyjä mikrosporeja voidaan käyttää myös suoraan geeninsiir- ron kohdesolukkona. Toimiva mikrosporiviljelymenetelmä tehostaa kaksois- haploidien kasvien tuottoa myös jalostus- ja tutkimustarkoituksiin. Mikrospo- riviljelymenetelmiä on jo kehitetty useille muille viljalajeille, mm. ohralle ja vehnälle (Jähne ja Lörz 1995, Mordhost and Lörz 1993, Salmenkallio- Marttila & Kauppinen 1995, Touraev ym. 1996, Kunz ym. 2000, Ritala ym. 2001), mutta kauran mikrosporiviljelymenetelmää ei vielä ole julkaistu. Kauran mikrosporiviljelytekniikkaa lähdettiin kehittämään kotimaisille kau- ralajikkeille Aslak ja Veli. Näistä Aslak toimii hyvin ponsiviljelyssä ja Veli 39 geeninsiirroissa. Menetelmänkehitys pohjautui MTT:n kauran ponsiviljely (Kiviharju ym. 2005) ja VTT:n ohran ponsi- ja mikrosporiviljelyosaamiseen (Salmenkallio & Kauppinen 1995, Ritala ym. 2001) Kauran tähkylän kukkien kehitysvaihe oli hyvin erilainen, joten materiaali jaoteltiin tähkylän uloimman kukan heteiden mikrosporien kehitysvaiheen perusteella a) keski- ja myöhäisyksitumavaiheiseen ja b) myöhäisyksituma – aikainen kaksitumavaiheiseen materiaaliin. Kauran mikrosporieristyksissä onnistuttiin eristämään eläviä mikrosporeja, mutta niitä ei saatu jakaantu- maan (Kuva 1). Keskimäärin saanto oli 9000 elävää mikrosporia lähtömateri- aaliröyhyä kohden. Materiaalin elävyydessä oli kuitenkin havaittavissa vaih- telua - heinäkuun lopussa ja elokuun alussa kylvetyn materiaalin ollen paras- ta. Tällöin saanto oli parhaimmillaan 20 000 – 30 000 elävää mikrosporia lähtömateriaaliröyhyä kohti. Eristyksistä on kooste taulukossa 1. Viljelyvaste jäi kuitenkin puuttumaan ja eri parametrien vertailu oli mahdotonta. Toimi- vaa kauran mikrosporiviljelytekniikaa ei saatu kehitettyä. Kuva 1. Eristettyjä kauran mikrosporeja A) Aslak B) Veli Taulukko 1. Kauran mikrosporieristykset. Lähtömateri- aalin kylvö- aika Veli a) keski- myöhäis- yksituma- vaihe Veli b) myöhäis- yksituma- aikainen kaksituma- vaihe Aslak a) keski- myöhäis- yksituma- vaihe Aslak b) myöhäis- yksituma- aikainen kaksituma- vaihe Eristettyjen röyhyjen määrä (kpl) Heinäkuu 89 75 113 86 Elokuu 243 69 258 99 Syyskuu 169 18 59 - Yhteensä 501 162 430 185 Aseptisuus 94 % 65 % 77 % 56 % A B 40 Solukkoviljelmien ja niiden aloitusmateriaalien karakteri- sointi Solukkoviljelmien aloitusmateriaalina käytettyjen Aslak, Veli Ja Kolbu lajik- keiden jyvien ja apikaaliset meristeemien eli kasvupisteiden β-glukaanit mää- ritettiin sekä Calcofluor-värjäyksellä että HPLC-menetelmällä. Lajikkeiden jyvistä tehtiin poikkileikkaukset, joista värjättiin β-glukaani (Kuva 2). β- Glukaania oli jyvän endospermin soluseinissä, erityisen runsaasti β-glukaania oli tärkkelysendospermin subaleuronikerroksen paksuissa soluseinissä. Cal- cofluor-värjäyksen perusteella arvioitiin, että Kolbu-lajikkeen jyvissä olisi vähemmän β-glukaania kuin Veli- ja Aslak-lajikkeiden jyvissä. HPLC- mentelmällä määritettiin kuorittujen ja jauhettujen jyvien β-glukaanin määrä ja molekyylipainojakauma (Kuva5). Jyvien β-glukaani oli molekyylipainol- taan 1-2 miljoonan luokkaa ja eniten β-glukaania oli lajikkeessa Aslak (60 g/kg). Kolbussa (40 g/kg) ja Velissä β-glukaania oli saman verran (45 g/kg). Apikaalisista meristeemeistä tehdyissä poikkileikkauksissa perussolukon soluseinissä ei erottunut värjäytynyttä β-glukaania (Kuva 3). β-Glukaani oli värjäytynyt ainoastaan johtojänteiden puutuneissa paksuissa soluseinissä. Myöskin HPLC-menetelmällä todettiin kasvupisteiden sisältävän ainoastaan hyvin pieniä määriä β-glukaania (Kuva 5). A) Veli B) Aslak C) Kolbu D) Veli E) Aslak F) Kolbu Kuva 2. Kauran jyvän poikkileikkaus. a-c) Yleiskuva, d-f) erikoiskuva aleuroni- ja subaleuronikerroksesta; β-glukaani erottuu sinisenä, proteiini on värjätty punaiseksi. 41 Kuva 3. Kauran apikaalisen meristeemin eli kasvupisteen mikrorakenne. β- Glukaani erottuu sinisenä, proteiini on värjätty punaiseksi. Embryogeenisiä viljelmiä lisättiin ja n. 3 viikon ikäinen kallus analysoitiin sekä Calcofluor-värjäyksellä että HPLC-menetelmällä. Vanhempien kallusso- lujen seinät värjäytyivät β-glukaanivärjäyksellä, sen sijaan nuorten vielä ja- kautuvien solujen seinät eivät (Kuva 4). Veli-lajikkeen kallus näytti sisältä- vän hieman vähemmän β-glukaania kuin Aslak- ja Kolbu-lajikkeiden kallus. HPLC-menetelmällä määritettiin kalluslinjojen β-glukaanin määrä ja mole- kyylipainojakauma (Kuva 5). Kallusten β-glukaani oli molekyylipainoltaan noin 200 000 eli selvästi vähemmän polymeroitunutta kuin jyvien β-glukaani. Eniten β-glukaania oli lajikkeiden Aslak ja Kolbu kalluksissa (3 g/kg) ja hieman vähemmän Veli-lajikkeen kalluksessa (2 g/kg). 42 Kuva 4. Kaurakallusten mikrorakenne, soluseinien β-glukaani erottuu sinise- nä. ASLAK_natJYVÄ_10uL ASLAK_KASVUPIST E ASLAK_KALLUS F lu or es ce nc e -20,00 -10,00 0 ,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 110,00 120,00 130,00 Minu tes 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 b et a G L U K A A N I KOLBU_natJYVÄ _10uL KOLBU_KASVUPIST E KOLBU_KALLUS F lu or es ce nc e -20,00 -10,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 110,00 120,00 130,00 Minutes 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 b e ta G L U K A A N I VELI_natJYVÄ_10uL VELI_KASVUPIST E VELI_KALLUS F lu o re sc e nc e -20,00 -10,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 110,00 120,00 130,00 Minutes 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55 ,00 60,00 b et a G L U K A A N I A B C F lu or es ce nc e b et a G L U K A A N I F lu or es ce nc e b e ta G L U K A A N I F lu o re sc e nc e b et a G L U K A A N I F lu or es ce nc e b et a G L U K A A N I F lu or es ce nc e b e ta G L U K A A N I F lu o re sc e nc e b et a G L U K A A N I Kuva 5. Kauramateriaalien (jyvät, kasvupisteet ja n. 3 viikon ikäiset kallussolukot) β-glukaanimääritykset HPLC-menetelmällä (Lajikkeet A) Aslak, B) Kolbu ja C) Veli). 43 Mikrobiaalinen β-glukaanisyntaasi ja siirtogeenisten soluk- kojen tuottaminen partikkelipommituksella Professori Watanaben ryhmältä saatiin tutkimuskäyttöön hiivasta eristetty (1,3)-β-D-glukaanisyntaasin katalyyttistä yksikköä koodaavaa geeni (GSC1, Inoue ym. 1995). Tarkoituksena oli tutkia hiivaperäisen geenin vaikutusta kauran β-glukaanisynteesiin käyttäen kohdemateriaalina kauran solukkovil- jelmiä. Kauran eri lajikkeiden (Aslak, Kolbu, Veli) solukkoviljelmiä pommitettiin geeninsiirtovektorilla, jossa GSC1-geeni oli maissin ubikitiini promoottorin ja ensimmäisen intronin säätelyssä. Geeninsiirrossa käytettiin apuvektoria, joka sisälsi selektoitavan merkkigeenin (bar) myös ubikitiini promoottorin ja ensimmäisen intronin säätelyssä. Pommitettuja viljelmiä kasvatettiin fosfino- trisiiniselektiolla (3 mg/l) ja vähitellen aikaansaatiin siirtogeenisiä linjoja (Taulukko 2, Kuva 6). Viljelmät kasvoivat hitaasti ja niitä siirrostettiin n. neljän viikon välein uusille selektiomaljoille. Tuotettujen linjojen siirtogeeni- syys varmistettiin PCR-analyysillä sekä sovellusgeenin (GSC1) että merkki- geenin (bar) suhteen (Kuva 7). Kaikkiaan siirtogeenisiä linjoja tuotettiin 14 kappaletta. Niistä kahdeksan on alkuperältään Veli-lajiketta, viisi Aslak- lajiketta ja yksi Kolbu-lajiketta. Keskimääräinen GSC1-transformaatio- frekvenssi eli siirtogeenisiksi PCR:llä todettujen osuus selektiolla kasvavien linjojen määrästä oli kauralla 23 %. Solukkoviljelmien transformaatiofrek- venssin alhaisuus selittyy sillä, että selektiona käytetty bar-merkkigeeni- systeemi toimii erityisesti siirtogeenisten kasvien tuottamisessa. Tällöin ei- siirtogeeninen materiaali karsiutuu tehokkaimmin regeneraation ja juurrutuk- sen yhteydessä ja ns. karkurien määrä vähenee. Koska siirtogeeniset kauran solukkolinjat kasvoivat hitaasti, tuotettiin kontrollimateriaaliksi siirtogeenisiä ohran solukkolinjoja Pokko-lajikkeesta. Siirtogeenisen materiaalin tuottami- nen ohran Golden Promise-lajikkeesta ei onnistunut (Taulukko 2). Pommitettua Aslak-solukkoa fosfinotrisiiniselektiolla Pommitettua Kolbu-solukkoa fosfinotrisiiniselektiolla Kuva 6. Pommitettuja kauran solukkoviljelmiä fosfinotrisiiniselektiolla. Kontrolli selektiolla Pommitettua Veli-solukkoa fosfinotrisiiniselektiolla 44 Taulukko 2. Kooste siirtogeenisistä kauran solukkoviljelmälinjoista sekä kont- rollimateriaaliksi tuotetuista ohran solukkoviljelmälinjoista. Solukkoihin on siirretty GSC1-geeni ubikitiini promoottorin ja ensimmäisen intronin säätelys- sä (pAMR01) yhdessä vektorin kanssa, joka sisältää bar-merkkigeenin ubiki- tiini promoottorin ja ensimmäisen intronin säätelyssä. Lähtömateri- aali (Solukko) Tuotettujen linjojen lukumäärä GSC1-PCR bar-PCR GSC1- transformaatio- frekvenssi**) Veli (kaura) 27 8 + 17 – 2 kuollut 8 + 17 – 2 kuollut 30 % Aslak (kaura) 13 5 + 6 – 2 kuollut 5 + 6 – 2 kuollut 38 % Kolbu (kaura) 22 1 + 15 – 6 kuollut 3 + 13 – 6 kuollut 5 % Yhteensä (kaura) 62 14 + 38 – 10 kuollut 16 + 36 – 10 kuollut 23 % Pokko (ohra) 12 5 + 7 - *) 42 % Golden Promi- se (ohra) 3 3 - 3 + 0 % Yhteensä (ohra) 15 5 + 10 – 3 + 33 % *) Ohran Pokko-lajikkeen siirtogeenisiä linjoja tuotettaessa käytettiin npt2-merkkigeeniä **) PCR:llä siirtogeenisiksi todettujen osuus selektiolla kasvavien linjojen määrästä 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1093 bp - 805 bp - λ-PstI 516 bp - 1700 bp - 2840 bp - 5080 bp - 14055 bp - 893 bp Näytteet 1 - 8 Alkuperänä Veli-lajikkeen solukkoviljelmä Näytteet 10 - 15 Alkuperänä Aslak-lajikkeen solukkoviljelmä Kuva 7. Siirtogeenisten kauran solukkonäytteiden PCR-analyysi. PCR monistaa GSC1-geenistä 893 bp:n fragmentin (osoitettu kuvassa nuolella). Näytenumerot 1-7 ja 10-14 ovat GSC1-geenillä pommitettuja solukkonäytteitä ja numerot 8 ja 15 ovat ei-siirtogeenisiä kontrollinäytteitä. Näyte 9 on molekyylipainomarkkeri λ-PstI, näyte 16 on positiivinen plasmidikontrolli ja näyte 17 vesikontrolli. 45 Siirtogeenisten solukkojen mikroskooppinen tarkastelu ja β-glukaanin määrittäminen HPLC-tekniikalla Mikroskooppista tarkastelua varten kauran solukkoviljelmiä levitettiin ohueksi kerrokseksi objektilasille ja värjättiin Calcofluor White:lla. Fluore- soivassa valossa β-glukaania sisältävät soluseinät näkyvät vaalean sinisinä: heikko fluoresenssi indikoi matalaa β-glukaanin pitoisuutta, voimakas fluore- senssi indikoi suurempaa β-glukaanin pitoisuutta. Kaikissa kaurasolukoissa näkyi β-glukaanin fluoresenssia (Kuva 8). Kauran Aslak-lajikkeen ei- siirtogeenisessä kontrollinäytteessä (Kuva 8a) soluseinien fluoresenssi oli voimakkaampaa kuin Veli-lajikkeen ei-siirtogeenisessä kontrollinäytteessä (Kuva 8b). Kaikissa siirtogeenisissä kauralinjoissa soluseinien fluoresenssi oli voimakkaampaa kuin ei-siirtogeenisissä kontrollinäytteissä (Kuva 8). Kaikissa näytteissä nuorten jakautuvien solujen fluoresenssi oli heikkoa, mut- ta vanhat erilaistuneet solut fluoresoivat voimakkaammin. Siirtogeenisistä linjoista Aslak-lajikkeen linjan P4/8/1 solut fluoresoivat kaikkein voimak- kaimmin ja Veli-lajikkeen linjoissa P1/4/3 ja P1/4/6 fluoresenssi oli siirto- geenisistä kauralinjoista heikointa, kuitenkin selvästi voimakkaampi kuin ei- siirtogeenisissä kontrollilinjoissa (Kuva 8a-h). Kvantitatiivisen HPLC- menetelmän perusteella kuitenkin kävi ilmi, ettei siirtogeenisissä kauralin- joissa ollut enempää tai molekyylipainoltaan suurempaa β-glukaania kuin ei- siirtogeenisissä solukoissa (Taulukko 3). Sen sijaan siirtogeenisissä ohralin- joissa oli eroa verrattaessa samanikäiseen ei-siirtogeeniseen kontrollisoluk- koon (Kuva 9). Siirtogeenisten ohrasolukoiden β-glukaanimäärä sekä suurten polymeerien (> 1 000 000) määrä poikkesivat tilastollisesti merkittävästi (P<0,01) ei-siirtogeenisten näytteiden arvoista. Solukkoviljelmistä saatujen tulosten perusteella näytti siltä, ettei mikrobiaali- nen 1,3-β-glukaanisyntaasi nosta kauran solukkoviljelmien β-glukaani- pitoisuutta, eikä vaikuta itse syntetisoituvan β-glukaanin molekyylijakau- maan. On kuitenkin mahdollista, ettei erilaistumaton solukkoviljelmä välttä- mättä sovellu β-glukaanisyntaasin vaikutusten arvioimiseen. Lopullinen arvio mikrobiaalisen 1,3-β-glukaanisyntaasi vaikutuksista on tehtävä analysoimalla siirtogeenisten kasvien β-glukaanipitoisuutta ja molekyylipainojakaumaa. 46 ba c d e f g h Kuva 8. Mikroskooppilasille sivellyiden kauran solukkonäytteiden Calcofluor- värjäys. Kaikki solukot olivat neljän viikon ikäisiä. Näytteet a ja b ovat ei- siirtogeenisiä kontrollinäytteitä (a) lajike Aslak ja b) Veli). Näytteet c, d ja e ovat siirtogeenisiä GSC1-Veli-kallusnäytteitä ja näytteet f, g ja h siirtogeenisiä GSC1-Aslak-kallusnäytteitä. 47 Taulukko 3. HPLC-tulokset GSC1-geenin sisältävien siirtogeenisten ja ei- siirtogeenisten kauran ja ohran solukkoviljelmänäytteiden β- glukaanipitoisuuksista. Solukkoviljelmä Ikä vko β- glukaanipitoisuus g / kg (dw) Molekyylipaino (Daltons) Siirtogeeninen GSC1-Veli- kallus 4 14 – 15 270 000 – 340 000 Ei-siirtogeeninen Veli-kallus 4 19 260 000 Siirtogeeninen GSC1-Aslak- kallus 4 9 - 13 210 000 – 390 000 Ei-siirtogeeninen Aslak-kallus 4 13 170 000 – 280 000 Siirtogeeninen GSC1-Kolbu- kallus 4 *) 390 000 Ei-siirtogeeninen Kolbu-kallus 4 *) 150 000 Siirtogeeninen GSC1-Pokko- kallus 2 3 – 6 310 000 – 750 000 Ei-siirtogeeninen Pokko-kallus 2 4 – 6,5 430 000 Siirtogeeninen GSC1-Pokko- kallus 4 3 – 10 280 000 – 750 000 Ei-siirtogeeninen Pokko-kallus 4 4 440 000 *) Pieniä määriä 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 1 2 3 4 a b b b Kontr. β-g lu ka an im ää rä (g /k g dw ) P6 / 8E P6 / 8G P6 / 8F β-g lu ka an im ää rä (g /k g dw ) Kuva 9. Siirtogeenisten GSC1-geenin sisältävien ohran solukkolinjojen (P6 / 8E, 8G, 8F) ja ei-siirtogeenisen kontrollilinjan β-glukaanimäärät. Kirjaimilla a ja b merkittyjen näytteiden β-glukaanimäärät eroavat tilastollisesti merkittä- västi toisistaan (P < 0,01, n = 6). Mikrobiaalisen β-glukaanisyntaasin ilmeneminen siirto- geenisissä solukoissa Mikrobiaalisen 1,3-β-glukaanisyntaasin ilmeneminen todennettiin semi- kvatitatiivisen RT-PCR:n avulla sekä siirtogeenisissä kaurasolukoissa että ohrasolukoissa (Kuva 10). Kontrollina käytettiin aktiini RT-PCR:ää ja eks- 48 pressiotasot normalisoitiin sen avulla. Ekspressiotasoissa ja β- glukaanimäärissä ei kuitenkaan näyttäisi olevan korrelaatiota ja voidaan ai- noastaan todeta että mikrobiaalinen 1,3-β-glukaanisyntaasi ilmenee siirto- geenisissä näytteissä (Kuva 11). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Lane Sample 1, 16 ?-PstI 2, 3 Non-transgenic Veli 4, 5 P1 / 4 / 7 6, 7 P1 / 4 / 9 8, 9 Non-transgenic Aslak 10, 11 P2 / 9 / 2 12, 13 P4 / 8 / 1 14 H2O 15 Plasmid pAMR01 805 bp - 805 bp - 1093 bp - 1093 bp - A) - actin - GSC1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Lane Sample 1, 9, 22 ?-PstI 2, 3 Non-transgenic Pokko 4 – 8 P6 / 8E 10 – 13 P6 / 8G 14 – 18 P6 / 8F 19, 20 H2O 21 Plasmid pAMR01 - actin805 bp - 805 bp - 1093 bp - 1093 bp - - GSC1 B) Kuva 10. GSC1 mRNA:n ilmeneminen siirtogeenisissä kaurasolukoissa (A) ja ohrasolukoissa (B). Solukoista eristettiin kokonais-RNA (Qiagen Rneasy Plant Mini Kit 74904) ja käänteistranskriptoitiin (RT) SuperScript III Rnase H transkriptaasilla (Invitrogen). RT-tuotetta käytettiin templaattina ja PCR:ssa käytettiin Taq DNA polymeraasia. Semi-kvatitatiivisessa RT-PCR:ssa käytet- tiin kontrollina aktiinia. 49 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 Relative GSC1 expression level Amount of beta- glucan (g/kg dw) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 Relative GSC1 expression level Amount of beta- glucan (g/kg dw) A) B) Control Veli Control Aslak P1/4/ 7 P1/4/ 9 P2/9/ 2 P4/8/ 1 Control Pokko P6 / 8E P6 / 8G P6 / 8F Kuva 11. Suhteellinen GSC1 ekpressiotaso (normalisoitu aktiinin avulla) siir- togeenisissä A) kaurasolukoissa ja B) ohrasolukoissa. Solukoista, joista GSC1-ekpressio määritettiin myös β-glukaanipitoisuudet Mikrobiaalisen β-glukaanisyntaasin sisältävät siirtogeeniset T0- ja T1-polven kasvit Mikrobiaalinen 1,3-β-glukaanisyntaasi ei nostanut kauran solukkoviljelmien β-glukaanipitoisuutta. On kuitenkin mahdollista, ettei solukkoviljelmä sovel- tunut mikrobiaalisen β-glukaanisyntaasin vaikutusten arvioimiseen. Tämän vuoksi siirtogeenisiä linjoja regeneroitiin kasveiksi (Taulukko 4) ja istutettiin multaan kasvihuoneelle. Kasvien siirtogeenisyys analysoitiin PCR- tekniikalla. Lisäksi muutamien kallusten ja kasvien siirtogeenisyydet var- mennettiin Southern blot – menetelmällä (Kuva 12). Siirtogeenisistä Veli GSC1-linjoista regenerantteja saatiin kuudesta (6/8) ja siirtogeenisistä Aslak GSC1-linjoista regeneroitui kaksi (2/5). Ainoa siirtogeeninen Kolbu GSC1- 50 linja ei regeneroitunut. Kolbu-lajikkeesta siirtogeenisiä kasveja saatiin re- generoitua vain linjasta P2/11/1, johon oli integroitunut ainoastaan bar- merkkigeeni. Joka tapauksessa tämä oli ensimmäinen kerta, kun siirtogeeni- siä kasveja pystyttiin tuottamaan Aslak-lajikkeesta. Selektion voitiin todeta olevan tehokas, koska yhtä poikkeusta lukuun ottamatta kaikki kasvit olivat siirtogeenisiä selektiomarkkerin (bar) suhteen (63/64 = 98 %). Lisäksi myös kotransformaatio toimi hyvin, koska kaikissa regeneranteissa oli varsinainen mikrobiaalista β-glukaanisyntaasia koodava sovellusgeeni (GSC1). T0-kasvit tuleentuivat normaalisti kasvihuoneella, mutta sekä siirtogeenisten että ei- siirtogeenisten jyvätuotto oli huonoa. Siirtogeenisten kasvien ensimmäisen sukupolven (T0) kasveista 58 % (37/64) tuotti jyviä. Huono fertiliteetti voi siirtogeenisten kasvien kohdalla johtua tietysti itse siirtogeenistä tai siirto- geenin integraatiopaikasta. Jyväsato oli kuitenkin huono myös ei- siirtogeenisissä kasveissa, joten syynä voitiin hyvin todennäköisesti pitää pitkää solukkoviljelyvaihetta. Taulukko 4. Kooste regeneroiduista siirtogeenisistä kaurakasveista, ei- siirtogeenisestä kontrollimateriaalista ja niiden jyvämääristä (T0-polvi). Lajike Alkuperä T0- kasvit (lkm) PCR + (GSC1) PCR + (bar) Fertiilit kasvit (lkm) Jyvälkm (min-max) Veli P1 / 4 / 10 9 9 9 8 2 - 44 P1 / 4 / 9 6 6 6 5 2 - 12 P1 / 4 / 8 8 8 8 5 1 - 38 P1 / 4 / 7 9 9 9 2 3 ja 14 P1 / 4 / 6 11 11 11 10 4 - 106 P1 / 4 / 2 5 5 5 4 3 - 32 Yhteensä Veli Siirtogeeni- set 48 48 48 34 1 - 106 Kontrolli Veli 5 - - 3 2 - 3 Aslak P2 / 9 / 1 3 3 2 1 5 P2 / 9 / 2 9 9 9 - a - a Yhteensä Aslak Siirtogeeni- set 12 12 11 1 5 Kontrolli Aslak 5 - - 5 14 - 66 Kolbu P2 / 11 / 1 4 0 4 2 b 1 ja 6 P2 / 12 / 1 0 0 0 - - Yhteensä Kolbu Siirtogeeni- set 4 0 4 2 1 ja 6 Kontrolli Kolbu 5 - - 3 22 - 66 a Kaikki kasvit olivat steriilejä ja kuusi kasvia yhdeksästä oli myös fenotyypiltään pieniä b Näissä kasveissa oli vain bar-merkkigeeni 51 Lane Näyte 1. 1 kopio 2. 10 kopiota 3. Aslak, kontrolli (T1=2584) 4. Aslak kallus, P2/9/1 5. Aslak T0= 1870 6. Aslak T1= 2580 7. MW 8. Veli Kallus, P1/4/9 9. Veli T0=2008 10. Veli T1=2604 11. Veli T0=2009 12. Veli T1=2606 13. Veli T1=2610 14. 1 kopio 15. 10 kopioa 16. MW 1 2 3 4 5 6 7 - 23 130 bp - 9 416 bp - 6 557 bp - 4 361 bp - 2 322 bp - 2 027 bp - 564 bp - 23 130 bp - 9 416 bp - 6 557 bp - 4 361 bp - 2 322 bp - 2 027 bp - 564 bp 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Kuva 12. Siirtogeenisten kallusten, T0-regeneranttien ja T1-polven jälkeläisten Southern blot -analyysi. 52 T0-polven kasvien jyvistä idätettiin seuraavan polven (T1) kasveja (Taulukko 5) ja niiden jyvistä tehtiin β-glukaanimääritykset (Kuvat 13 ja 14). T1-polven jyväsato oli hieman parempi kuin T0-polven, eivätkä siirtogeeniset ja ei- siirtogeeniset huomattavasti eronneet toisistaan sadon suhteen. Fertiliteetti oli hieman noussut verrattaessa T0-polven siirtogeenisiin kasveihin; 68 % (26/38) siirtogeenisistä T1-polven kasveista tuotti jyviä. Siirtogeenisten ja ei- siirtogeenisten jyvien β-glukaanin määrissä ei näyttäisi olevan merkittävää eroa. β-Glukaanin määrän erilaisuus kasvihuoneolosuhteissa tuli kuitenkin selvästi ilmi verrattaessa kontrollimateriaaliin, joka oli kasvatettu pellolla (Kuva 13). Myöskään molekyylipainojakaumissa ei näyttäisi useimpien linjo- jen kohdalla olevan eroa siirtogeenisten ja ei-siirtogeenisten ryhmien välillä. Siirtogeenisen Veli linjan T1-kasvien 2602 ja 2603 näyttäisi poikkeavan ylei- sestä trendistä. Tämä vaatii kuitenkin lisäanalyysejä, että voitaisiin osoittaa eron johtuvan nimenomaan siirtogeenistä. Taulukko 5. Siirtogeeniset ja ei-siirtogeeniset T1-polven kaurakasvit. Lajike Solukko- alkuperä T0-kasvi a (numero) T1-kasvi GSC1 ja bar + Fertiilit T1-kasvit Jyvälkm (min-max) Veli P1 / 4 / 10 1868 2 2 37 ja 96 P1 / 4 / 10 1869 3 3 14 - 26 P1 / 4 / 9 2008 3 3 11 - 55 P1 / 4 / 9 2009 1 1 75 P1 / 4 / 8 1863 2 2 36 ja 114 P1 / 4 / 8 1865 2 2 30 ja 74 P1 / 4 / 7 2012 2 2 36 ja 55 P1 / 4 / 7 2015 1 1 29 P1 / 4 / 6 1894 3 3 5 – 30 P1 / 4 / 6 1895 1 1 158 P1 / 4 / 2 1876 2 2 49 ja 76 P1 / 4 / 2 1877 0 0 - Yhteensä Veli Siirto- geeniset 12 kpl 22 22 5 - 158 Aslak P2 / 9 / 1 1870 b 3 (4 c) 2 (2 c) 8 ja 12 P2 / 9 / 2 - - - - Yhteensä Aslak Siirto- geeniset 1 kpl 3 (4) 2 (2) 8 ja 12 Kolbu P2 / 11 / 1 d 1902 e (1 d) (1 d) 2 P2 / 11 / 1 d 1903 e (4 d) (2 d) 102 - 580 Yhteensä Kolbu Siirto- geeniset 2 kpl (4 d) (3 d) 2 - 580 taulukko 5 jatkuu… 53 Lajike Kontrollit T0-kasvi a (numero) T1-kasvi (ei- siirtog.) Fertiilit T1-kasvit (ei-siirtog.) Jyvälkm (min-max) Veli 2017 1 1 149 2019 2 2 33 ja 71 Yhteensä Veli Kontrollit 2 kpl 3 3 33 – 149 Aslak 2027 2 2 7 ja 31 2030 2 2 32 ja 33 Yhteensä Aslak Kontrollit 2 kpl 4 4 7 – 33 Kolbu 2023 2 2 31 ja 810 2024 2 2 275 ja 610 Yhteensä Kolbu Kontrollit 2 kpl 4 4 31 - 810 a Siirtogeenisten T0-kasvin jyviä (=T1-jyvät) idätettiin 3 kpl / kasvi. Ei-siirtogeenisesta kont- rollimateriaalista idätettiin 2 jyvää / kasvi. Kaikki jyvät eivät kuitenkaan itäneet. b T0-kasvi tuotti vain viisi jyvää, jotka kaikki idätettiin. Yksi itäneistä kasveista kuoli. c Kolmessa kasvissa oli sekä GSC1 että bar, ja yhdessä kasvista pelkästään bar (segregaatio), mutta se oli steriili eikä tuottanut jyviä. d Solukkolinjaan oli integroitunut ainoastaan bar-merkkigeeni e T0-kasvi 1902 tuotti vain yhden jyvän, joka iti, T0-kasvi 1903 tuotti kuusi jyvää, joista viisi iti Kuva 13. Siirtogeenisten ja ei-siirtogeenisten T1-kasvien jyvien β- glukaanipitoisuus (n=6). Kuvassa vihreällä alleviivattu kontrollimateriaali on pellolla lisättyä ja punaisella alleviivattu kasvihuoneolosuhteissa lisättyä. 0 10 20 30 40 50 60 K on tr. A sl ak K on tr V el i K on tr . K ol bu K on tr . A sl ak K on tr .V el i K on tr. K ol bu 25 80 A sl ak 25 81 A sl ak 25 88 V el i 25 90 V el i 25 93 V el i 25 95 V el i 25 97 V el i 25 98 V el i 26 00 V el i 26 02 V el i 26 04 V el i 26 06 V el i 26 08 V el i 26 09 V el i 26 14 K ol bu B et a- gl u ka an ip it oi su us (g /k g ) K on tr. A sl ak K on tr V el i K on tr . K ol bu K on tr . A sl ak K on tr .V el i K on tr. K ol bu 25 80 A sl ak 25 81 A sl ak 25 88 V el i 25 90 V el i 25 93 V el i 25 95 V el i 25 97 V el i 25 98 V el i 26 00 V el i 26 02 V el i 26 04 V el i 26 06 V el i 26 08 V el i 26 09 V el i 26 14 K ol bu B et a- gl u ka an ip it oi su us (g /k g ) 54 Kuva 14 A) Siirtogeenisten ja ei-siirtogeenisten T1-kasvien jyvien β-glukaanin molekyylipainojakauma (n=6). Mw = molekyylien molekyylipainon suhteen painotettu keskiarvo; Mn = molekyylien lukumäärän suhteen painotettu kes- kiarvo. Mw kuvaa parhaiten vaikutusta viskositeettiin. Kuvassa vihreällä alle- viivattu kontrollimateriaali on pellolla lisättyä ja punaisella alleviivattu kasvi- huoneolosuhteissa lisättyä. B) Inserttiin on eroteltu suuren ja pienen molekyy- lipainon omaavat jyvät (n=3, molemmissa ryhmissä). Kyseisten jyvien mole- kyylipainohajonta oli hyvin suuri, indikoiden hyvin heterogeenistä jyväsatoa. Kasviperäinen β-glukaanisyntaasi Projektin lopullisena tarkoituksena oli käyttää kasviperäistä β- glukaanisyntaasia kauran β-glukaanipitoisuuden nostamisessa. Ohran EST- kirjastosta sekä julkisista tietokannoista löydetyt potentiaaliset β- glukaanisyntaasit luokiteltiin neljääntoista ryhmään (Taulukko 6). Näistä suurin osa muistutti kalloosisyntaasia (eli 1,3-β-glukaanisyntaasia). Aluksi 0 500000 1000000 1500000 2000000 K on tr . A sl ak K on tr V el i K on tr . K ol bu K on tr . A sl ak K on tr .V el i K on tr . K ol bu 25 80 A sl ak 25 81 A sl ak 25 88 V el i 25 90 V el i 25 93 V el i 25 95 V el i 25 97 V el i 25 98 V el i 26 00 V el i 26 02 V el i 26 04 V el i 26 06 V el i 26 08 V el i 26 09 V el i 26 14 K ol bu B et a- gl uk aa ni n m ol ek yy li pa in o Mw Mn 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 2602 Veli 2602 Veli B et a- gl u ka an in m ol ek yy lip ai no Mw Mn A) B) K on tr . A sl ak K on tr V el i K on tr . K ol bu K on tr . A sl ak K on tr .V el i K on tr . K ol bu 25 80 A sl ak 25 81 A sl ak 25 88 V el i 25 90 V el i 25 93 V el i 25 95 V el i 25 97 V el i 25 98 V el i 26 00 V el i 26 02 V el i 26 04 V el i 26 06 V el i 26 08 V el i 26 09 V el i 26 14 K ol bu B et a- gl uk aa ni n m ol ek yy li pa in o K on tr . A sl ak K on tr V el i K on tr . K ol bu K on tr . A sl ak K on tr .V el i K on tr . K ol bu 25 80 A sl ak 25 81 A sl ak 25 88 V el i 25 90 V el i 25 93 V el i 25 95 V el i 25 97 V el i 25 98 V el i 26 00 V el i 26 02 V el i 26 04 V el i 26 06 V el i 26 08 V el i 26 09 V el i 26 14 K ol bu B et a- gl uk aa ni n m ol ek yy li pa in o B et a- gl u ka an in m ol ek yy lip ai no 55 lähdettiin kartoittamaan mahdollisuutta käyttää transkription jälkeistä geenien hiljentämistä eli ns. siRNA-tekniikkaa potentiaalien kasviperäisten geenien seulonnassa. Tämän ei kuitenkaan todettu soveltuvan juuri β- glukaanisyntaasien seulontaan. Ohessa tarkempi selvitys tekniikasta ja syistä, miksi se hylättiin. SiRNA-molekyylit (short interfering RNA) ovat 21 – 26 nukleotidia pitkiä RNA-elementtejä, jotka käynnistävät RNA:n hajottamisen muodostamalla RNA:n indusoiman hiljennyskompleksin (RISC). SiRNA- elementit tunnistavat kohteen Watson-Crick emäspariutumisen periaatteella. RNA:n hajottaminen on endonukleolyyttistä ja tapahtuu alueilla, jotka ovat homologisia siRNA-elementille. Lisäksi kasveissa on todettu siRNA- välitteisen geeninhiljenemisen leviävän itse kohdesekvenssistä myös ympä- röiviin sekvensseihin, jolloin lähes koko mRNA pilkkoutuu lyhyiksi pätkiksi. Klahren työryhmä (2002) osoitti siGFP-elementtien (green fluorecent pro- tein) pommituksen hiljentävän GFP-ekspression siirtogeenisissä tupakkakas- veissa. Heidän tutkimuksensa osoitti, että ainoastaan kaksijuosteiset siGFP- elementit saivat geenin hiljenemisen aikaan 38 % kasveista. Lisäksi he osoit- tivat, että jo kuuden emäksen epähomologia esti hiljenemisen eli hiljenemi- sen indusointi on todellakin sekvenssispesifiä. Samankaltaisia tuloksia on saanut Vanitharani työryhmineen (2003) elektroporoimalla siGFP- elementtejä tupakan solukkoviljelmiin. Ohran EST-kirjastosta ja julkisista tietokannnoista löydetyistä potentiaalisista kasviperäisistä β- glukaanisyntaaseista pystyttäisiin olemassa olevan tiedon pohjalta suunnitte- lemaan sekvenssispesifit siRNA-elementit. Näiden elementtien vaikutusta β- glukaanisynteesiin voitaisiin sitten analysoida pommittamalla niitä kauran solukkoviljelmiin. Ongelmaksi kuitenkin muodostuu aikaansaadun vaikutuk- sen detektoiminen. Partikkelipommituksella siRNA-elementtien siirto onnis- tuu vain murto-osaan pommitetuista soluista. Mikäli näissä soluissa tapahtuu β-glukaanisyntaasin hiljeneminen, solut eivät pysty jakautumaan ja muodos- tamaan kunnollista soluseinää, jonka keskeinen komponentti β-glukaani vil- joilla on. Ympäröivät solut kuitenkin kasvavat ja peittävät hiljentyneet solut alleen ja näin eroa ei saada näkyviin Calcofluor-värjäyksellä. Lisäksi alkupe- räiset kohdesolut sisältävät jo β-glukaania ja värjäytyisivät joka tapauksessa. Myöskään protoplasteja ei voida käyttää kohdemateriaalina, koska protoplas- tien regeneroituminen on viljoilla hyvin hankalaa, ja näin ei saada selkeää syytä soluseinän muodostumisen estymiseen (β-glukaanisyntaasin hiljenemi- nen >< huono protoplastin regeneraatio). Tämän kirjallisuusselvityksen ja mahdollisuuksien kartoituksen jälkeen päädyttiin siihen, ettei siRNA- tekniikkaa voida hyödyntää potentiaalisten kasviperäisten β- glukaanisyntaasien valinnassa. 56 Taulukko 6. Yhteenveto ohran EST-kirjastosta ja julkisista tietokannnoista löydetyistä potentiaalisista kasviperäisistä β-glukaanisyntaaseista. Ryhmä Kon- sen- sus Sek- vens- sien lkm HY/BI klooni t Isäntä Oletusfunktio BGS.0. 41 1847 14 3 Hordeum vulgare Potentiaalinen kal- loosisyntaasi BGS.0. 3 2069 29 1 Oryza sativa Kalloosisyntaasin kal- tainen proteiinifragmentti BGS.0. 26 666 1 0 Oryza sativa Potentiaalinen 1,3-β- glukaanisyntaasi BGS.0. 28 672 1 0 Hordeum vulgare Potentiaalinen kal- loosisyntaasi BGS.0. 34 597 1 0 Oryza Sativa OJ1029_F04.4 proteii- ni BGS.0. 43 532 2 0 Oryza Sativa Potentiaalinen glu- kaanisyntaasi BGS.0. 45 791 6 1 Arabidobsis thaliana Kalloosisyntaasin kata- lyyttisen alayksikön kaltainen proteiini BGS.0. 42 380 1 0 Oryza sativa Potentiaalinen glu- kaanisyntaasi BGS.0. 44 300 1 0 Oryza sativa Potentiaalinen glu- kaanisyntaasi BGS.0. 68 1421 9 2 Oryza sativa ESTs AU033035S1515 BGS.0. 47 654 1 0 Oryza Sativa Kalloosisyntaasin kal- tainen proteiinifragmentti BGS.0. 66 671 2 1 Oryza sativa ESTs AU033035S1515 BGS.0. 70 945 2 1 Oryza sativa ESTs AU033035S1515 BGS.0. 21 645 1 0 Hordeum vulgare Potentiaalinen kal- loosisyntaasi ∑ 14 300 - 2069 71 9 Projektin kapasiteetti ei riittänyt kaikkien neljäntoista ryhmän potentiaalien geenien kloonaamiseen, ja niinpä pyrittiin ensivaiheessa samaan lisätietoa β- glukaanisyntaasien sekvenssistä käyttämällä ns. RT-PCR (reverse transcrip- tase) tekniikkaa. β-glukaanipitoisuusanalyyseissä todettiin ohran Pokko- suspensiolinjan sisältävän paljon β-glukaania (6,5 g/kg dw). Tästä suspen- siolinjasta eristettiin RNAta ja sitä käytettiin templaattina RT-PCRssä pi- dempien β-glukaanisyntaasisekvenssien selvittämiseksi. PCR-alukkeet suun- niteltiin kahdelle pisimmälle ja mielenkiintoisimmalle cDNA:lle. RT-PCRien bändit ovat nähtävänä kuvassa 15. Näistä klooneista pitkä-VTT/9 ja lyhyt- VTT/13 sekvensoitiin molemmista päistä. Kloonin VTT/9 saadut sekvenssit 57 Kuva 15. Ohran Pokko lajikkeesta eritetyn RNA:n RT-PCR potentiaalisille kasviperäisille β-glukaanisyntaaseille suunnitelluilla alukkeilla. eivät menneet päällekkäin ja puuttumaan jäi n. 150 emäsparia. Klooni VTT/13 saatiin kokonaan sekvensoitua ja sen yhteenlaskettu kokonaispituus oli 1087 bp. Saatuja sekvenssejä verrattiin nukleotidi- ja proteiinitietokantoihin käyttäen BLASTn ja BLASTx – hakuja. BLASTn:ssä käytettiin hakukriteerinä nuk- leotidisekvenssiä ja BLASTx:ssä hakukriteerinä oli sekvenssin perusteella transloitu proteiini. Molemmilla sekvensseillä ehdottomasti parhaat vastaa- vuudet olivat 1,3-β-glukaanisyntaaseja ja kaikkein parhaat löydettiin riisin tietokannoista. Kloonille VTT/9 paras vastaavuus oli riisin mRNA sekvenssillä (AK071856, yli nukleotidien 514-1174, ollen 83 %:sti samanlainen). Proteiinihaun vastaa- vuudet kloonille VTT/9 eivät olleet erityisen hyviä. Vastaavuuksista paras oli puuvillan potentiaali kalloosisyntaasin alayksikkö (AAD25952, 1899 amino- happoa pitkä) ja toiseksi paras löytyi Arapidopsiksen glykosyylitransferaasi- perheestä (NP_ 850271, proteiini 48). Näiden vastaavuuksien perusteella arvioitiin, että olimme n. 500 aminohapon ja n. 1500 nukleotidin päässä VTT/ 9-geenin 5`päästä. 1 2 3 4 5 6 7 8 10 000 bp- 3000 bp- 2000 bp- 1500 bp- 1200 bp- 600 bp - 500 bp - 400 bp - . Vesi, alukkeet F47 and R48, 63°C 1. Molekyylipainomarkkeri 2. VTT/ 9, alukkeet F36 and R36, 55°C 3. Vesi, alukkeet F36 and R36, 55°C 4. VTT/ 10, alukkeet F36 and R36, 55°C 5 6. VTT/ 13, alukkeet F47 and R48, 63°C 7. VTT/ 14,alukkeet F47 ja R48, 63°C 8. Molekyylipainomarkkeri 58 Kloonin VTT/13 paras nukleotidivastaavuus oli riisin potentiaalia 1,3-β- glukaanisyntaasin mRNA:lla. (XM_550490, Oryza sativa, lajike Nipponbare, vastaavuus alkaa nukleotidista 4154, 86 %:sti samanlainen). Proteiinitasolla paras vastaavuus oli myös potentiaali 1,3-β-glukaanisyntaasi (BAD67750, vastaavuusalue oli aminohaposta 1484 aminohappoon 1734, kun koko prote- iinissa oli 1771 aminohappoa). Näin ollen näytti siltä, että olimme VTT/13- geenin osalta jopa n. 4200 nukleotidin päässä 5`päästä. Pisin ja täydellisin klooni valittiin jatkotutkimuksiin (klooni VTT/9). Kloonin keskeltä jäi puuttumaan n. 150 emäsparin mittainen alue, joka kloonattiin ja sekvensoitiin. Seuraavaksi ryhdyttiin hakemaan geenin (koodaavan alueen) 5´päätä. Yleensä mRNA:sta tehdyt cDNA-kloonit ovat useimmiten vajavaisia juuri geenin 5`päästä, johtuen siitä, että käänteistranskriptaasi irtoaa mRNA:sta reaktion aikana tai siitä, että RNA hajoaa osittain. Geenin 5´pään kloonaamiseksi käytimme RLM-RACE – tekniikkaa, joka erityisesti valitsee ne mRNA:t, joiden 5`pää on täydellinen. Tällöin tuotteen pitäisi olla koko- nainen. Aikaansaimme RLM-RACE-tuotteita, jotka kloonattiin ja sekvensoi- tiin. BLAST-vertailuissa kuitenkin kävi ilmi, etteivät kyseiset tuotteet toden- näköisesti olleet β-glukaanisyntaaseja. Professori Fincherin tutkimusryhmä (Adelaiden yliopisto) teki samaan aikaan läpimurron kasviperäisten β-glukaanisyntaasien kloonaamisessa (Burton ym. 2006). Jatkokloonaustöissä käytimme Burton ym. (2006) jukaisun riisise- kvenssejä (6 kpl) ja löysimme kuusi hyvää osumaa Schulmannin laboratorion EST-kirjastosta. Tämän perusteella voitiin olettaa, että ohrasta löytyy ainakin kuusi vastaavaa geeniä. Olimme kuitenkin auttamattomasti jääneet kilpajuok- sussa toiselle sijalle, koska kansainvälisessä kasvimolekyylibiologia kokouk- sessa (Adelaide, Australia 20-25.8.2006) Fincherin ryhmällä oli kaksi esitys- tä, joista kävi ilmi, että he olivat jo kloonanneet vastaavat geenit ohrasta. Fincherin tutkimusryhmän läpimurto kasviperäisten β-glukaanisyntaasien kloonaamisessa ja erityisesti se, että he olivat jo kloonanneet vastaavat geenit ohrasta syksyllä 2006, aiheutti sen, ettei tutkimusta kannattanut jatkaa alku- peräisen suunnitelman mukaisesti. Ei ollut järkevää lähteä toistamaan jo teh- tyä tutkimusta. Eräs vaihtoehto olisi tiedustella yhteistyömahdollisuutta ko. ryhmän kanssa. Voisimme pyytää heiltä tutkimuskäyttöön ja kauraan siirret- täväksi ohrasta eristetyt geenit. Projektia oli kuitenkin siinä vaiheessa jäljellä vain muutama kuukausi, mikä ei missään tapauksessa olisi riittänyt yhteis- työkuvion rakentamiseen. Näin ollen keskitimme projektin lopun resurssit jo tuotettujen siirtogeenisten kasvien karakterisoimiseen. 59 Biotekniikan mahdollisuudet kauranjalostuksessa Elina Kiviharju1), Anneli Ritala2), Pirjo Tanhuanpää1), Outi Manninen1), Alan Schul- man1,3), Leena Pietilä4) 1) MTT, Biotekniikka- ja elintarviketutkimus, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etuni- mi.sukunimi@mtt.fi 2) VTT, PL 1000, 02044 VTT, etunimi.sukunimi@vtt.fi 3) MTT / BI Kasvigenomiikan laboratorio, Biotekniikan instituutti, PL 56, 00014 Helsingin yliopisto, etunimi.sukunimi@helsinki.fi 4) Boreal Kasvinjalostus Oy, Myllytie 10, 31600 Jokioinen, etunimi.sukunimi@boreal.fi Johdanto Kauralajikkeen jalostus perinteisen osapopulaatiovalintamallin mukaisesti vie toistakymmentä vuotta (Kuva 10.). Bioteknisillä menetelmillä tähdätään la- jikkeenjalostusohjelmien tehostamiseen ja lyhentämiseen, jotta viljelijöiden, kuluttajien ja teollisuuden toiveisiin voitaisiin vastata mahdollisimman nope- asti. Tärkeimpinä lajikejalostuksessa käytettävinä bioteknisinä menetelminä voidaan pitää ns. DH-tekniikoita (doubled haploid eli kaksoishaploidi) ja toivottujen ominaisuuksien geenimerkkiavusteista valintaa risteytysohjelmis- sa. Geeninsiirtojen avulla jalostusohjelmissa hyödynnettävää geneettistä ma- teriaalia on mahdollista laajentaa tuomalla ominaisuuksia yli lajirajojen. Ko- ko genomin tutkimisen (genomiikan) menetelmät tuovat kehittyessään mah- dollisuuksia tutkia tarkemmin kaurankin ominaisuuksien geneettistä säätelyä ja löytää niihin vaikuttavia geenejä. DH-tekniikat Jalostaja luo vaihtelua jalostusaineistoonsa risteytysten avulla ja risteytysjäl- keläistön yksilöt ilmentävät ilmiasuissaan vanhempiensa geenien eri yhdis- telmiä. Toivotut ominaisuudet sisältävä geeniyhdistelmä täytyy saattaa vaih- telemattomaksi puhtaaksi linjaksi, jotta saavutettu ominaisuuskokonaisuus pysyy ja lajike voidaan laskea kauppaan. Perinteisessä osapopulaatio- valintamallissa riittävä yhtenäisyys saavutetaan itsepölytteisellä kauralla useiden vuosien (4-6) sukupolvikasvatuksilla (Kuva 1.). Tekemällä jalostus- linjasta DH-linja, täydellinen geneettinen yhtenäisyys (homotsygotia) saavu- tetaan jo yhdessä sukupolvessa. Lopullinen ajansäästö riippuu siitä jalostus- ohjelman vaiheesta, jossa DH-linjat tehdään, useista vuosista on kuitenkin kysymys. Ajansäästön lisäksi valintatehokkuus DH-aineistoa käytettäessä kasvaa, koska väistyvät geenimuodot eivät jää vallitsevien muotojen alle piiloon, ja toisaalta ympäristöolosuhteet eivät pääse ”valikoimaan” aineistoa lisäyksissä, kuten pellolla tapahtuu. Suoran jalostuskäytön lisäksi DH-linjat 60 ovat hyödyllistä materiaalia erilaisissa geneettisissä tutkimuksissa, joissa täydellinen homotsygotia yksinkertaistaa geneettisiä analyysejä, kuten tämän hankkeen geenikartoituksessa. Kauralla DH-linjoja kyetään tuottamaan etäisristeytysten kautta (Rines ym. 1997), jolloin vieraslajin (yleensä maissi) siitepölyn kromosomit eliminoitu- vat, mutta ehtivät indusoida munasolun kasvuun. Kehittyvä alkio eristetään elatusainealustalle, koska siemenvalkuainen ei kehity. Tällä menetelmällä DH-linjojen tuottotehokkuudet ovat jääneet ainakin toistaiseksi liian alhaisik- si ajatellen käyttöä lajikejalostuksessa. Ponsiviljely on toinen tekniikka, joka kauralla onnistuu. Kauran DH-linjojen tuotto ponsiviljelyssä on kehitetty MTT:ssä käyttökelpoiselle tasolle. Parhaimmillaan 30 kasvia (Aslak × Lis- beth) on saatu erilaistumaan sataa eristettyä heteen pontta kohden. Tavan- omaisempia ovat olleet kertaluokkaa pienemmät luvut, 1-2 kasvia sataa pont- ta kohden. Viimeisimmällä menetelmällämme noin 60 % testatuista kaurala- jikkeista tuotti ponsiviljelyssä kasveja, ja luku nousi 88 %:iin, jos toinen van- hempi oli tuottanut kasveja ponsiviljelyssä aikaisemmin. Se että ponsivilje- lymenetelmä ei toimi kaikilla lajikkeilla, asettaa rajoituksia sen hyötykäytöl- le. Ponsiviljely vaatii myös suhteellisen suuren työpanoksen, jolloin käytän- nön kustannukset helposti tulevat jalostusyhtiöille liian suuriksi. Kysymyk- seen tulee menetelmän soveltaminen lähinnä erittäin lupaaviin risteytysai- neistoihin. Kauran ponsiviljelyssä on kuitenkin potentiaalia ja odotettavissa on, että menetelmät tulevat paranemaan, koska tällä hetkellä maailmalla useissa laboratoriossa on tutkimushankkeita käynnissä kauran DH-linjojen tuottamiseksi ponsi- tai mikrosporiviljelyssä. Ponsien viljelyn sijasta eristet- tyjen mikrosporien viljely pudottaisi menetelmästä työlään ponsien eristys- vaiheen pois, jolloin ajansäästön vuoksi päästäisiin luultavasti alempiin tuo- tantokustannuksiin. Toistaiseksi kauran mikrosporiviljely ei ole onnistunut missään, mutta oletettavaa on, että toimivat menetelmät kehitetään monien muiden viljelykasvien tavoin tulevaisuudessa myös kauralle. Jalostajalla on mahdollisuus nopeuttaa risteytyslinjojen yhtenäistämistä pe- rinteiseen osapopulaatiovalintamalliin verrattuna myös käyttämällä ns. SSD- (single seed descent) menetelmää. Siinä kylvetään kaikki F1- kasvin tuotta- mat siemenet, mutta seuraavista sukupolvista aina vain yksi siemen per kasvi. Siten kasvihuonekasvatuksia käyttäen pohjoisissakin olosuhteissa voidaan risteytysjälkeläisistä kasvattaa useita sukupolvia yhden vuoden aikana ja saavuttaa huomattavaa aikasäästöä lajikejalostusohjelmissa. SSD- menetelmän haittana on, että siinä tarvitaan runsaasti kasvihuonetilaa ja että sekin on suhteellisen runsastöinen. SSD- ja ponsiviljelymenetelmää verratta- essa voidaan todeta, että molemmissa on omat etunsa. SSD-menetelmällä linjoissa ehtii tapahtua rekombinaatiota, kun taas ponsiviljelyssä edut painot- tuvat nimenomaisesti täydelliseen homotsygotiaan ja sen tuomaan valintate- hokkuuteen. 61 Kuva 1. Osapopulaatiovalintamalli ja DH-tekniikan mahdolliset sovellusvai- heet itsepölytteisellä viljalla kuten kaura. Geenikartoitus Geenikartta on DNA-merkkien eli satunnaisten DNA-jaksojen sijaintipaikko- ja kromosomeissa kuvaava kaavio, jota käytetään ominaisuuksiin vaikuttavi- en geenien paikantamiseen. DNA-merkkitekniikoita on useita ja niiden avulla DNA-molekyyleissä sijaitsevat eroavaisuudet saadaan silmin havaittaviksi. Geenikartoituksessa tarvitaan risteytysjälkeläistö, jossa seurataan DNA- merkkien periytymistä sukupolvelta toiselle. Tieto siitä, miten usein DNA- merkkejä kasvin perimässä vastaavat DNA-jaksot periytyvät yhdessä ja miten 62 usein erikseen, voidaan muuttaa karttaetäisyyksiksi käyttäen tietokoneohjel- mia. Kun jälkeläisten DNA-merkkitiedot ja ominaisuustiedot yhdistetään, voidaan tutkittuihin ominaisuuksiin vaikuttavat geenit paikantaa kartalle. Samalla saadaan selville näihin ominaisuuksiin vaikuttavien geenien määrät ja yksittäisten geenien vaikutuksen suuruus. Riittävän lähellä haluttuun omi- naisuuteen vaikuttavaa geeniä sijaitsevia DNA-merkkejä voidaan käyttää jalostuksen apuna (Kuva 2.). Merkkiavusteisen valinnan perusteena käytetään DNA-merkkiä, itse ominaisuutta ei siis tarvitse mitata. Lisäksi kasvukauden aikaiset sää-olosuhteet ja muut ympäristötekijät eivät vaikuta DNA- merkkeihin. Kuva 2. DNA-merkkeihin perustuvan merkkiavusteisen valinnan periaate. Esimerkkinä kauran dominoiva kääpiökasvugeeni (D), jota on mahdotonta valita pelkästään kasvin pituuden perusteella, koska lyhyet yksilöt voivat olla homo (DD)- tai heterotsygootteja (Dd). Sen sijaan kääpiökasvugeeniin tiukas- ti kytkeytyneen DNA-merkin avulla (a) voidaan valita homotsygootit yksilöt, jolloin yhden valintavaiheen jälkeen saadaan jälkeläistö puhdistettua pitkän kasvun aikaansaavasta geenimuodosta (d). Kasvit voidaan valita varhaisessa kasvuvaiheessa, koska DNA-merkki selvitetään pienestä lehdenpalasta. DNA-merkin käyttökelpoisuus riippuu siitä, kuinka lähellä geeniä merkki on. Jos merkin etäisyys geenistä on 10 cM, se tarkoittaa, että merkki antaa väärän tuloksen 10 %:ssa jälkeläisistä. Yli 10 cM:n päässä sijaitsevia merkkejä ei juuri kannata käyttää. Toisaalta jos voidaan käyttää kahta merkkiä, jotka reu- nustavat geeniä, voivat ne sijaita kauempanakin. Paras merkki on tietysti 63 sellainen, joka sijaitsee itse geenissä; tällaisia merkkejä voidaan kehittää kan- didaattigeenien avulla. Kandidaattigeenit ovat samalta tai eri lajilta jo sek- vensoituja geenejä, joiden tiedetään tai oletetaan vaikuttavan haluttuun omi- naisuuteen. Sekvensoimalla kandidaattigeeni haluamamme risteytysjälkeläis- tön vanhemmilta, voidaan niiden välisiin sekvenssieroihin perustuen kehittää DNA-merkki. Mikäli DNA-merkki sijaitsee liian kaukana geenistä, geenikar- tan avulla voidaan kuitenkin yrittää päästä lähemmäksi sitä ja kehittää uusia merkkejä. Käytännössä tämä on erittäin työlästä, eikä siihen kannata ryhtyä, ellei kyseessä ole erittäin suurivaikutteinen geeni ja tärkeä jalostettava omi- naisuus. DNA-merkkien käyttö on suhteellisen kallista, mutta toisaalta sääs- tetään runsaasti aikaa ja työtä. Jalostajan päätettäväksi jää, onko saavutettava hyöty panostuksen arvoinen. DNA-merkkitieto ei välttämättä ole siirrettävis- sä suoraan risteytysjälkeläistöstä toiseen. Siksi ennen merkkien käyttämistä pitää varmistaa, että ne ovat monimuotoisia ja osoittavat halutun geenimuo- don olemassaolon myös tutkittavassa aineistossa. Useita kauran kytkentäkarttoja on laadittu eri risteytyksiä käyttäen ja useisiin ominaisuuksiin vaikuttavia geenejä on jo paikannettu. Karttojen hyödynnet- tävyyttä vähentää se, että kytkentäryhmien vastaavuutta eri kartoissa ei usein- kaan tiedetä. Karttoja voidaan vertailla toisiinsa ns. ankkurimerkkien avulla (RFLP-merkkejä tai mikrosatelliitteja). RFLP-merkkien analysoiminen on työlästä ja kauralla on vielä toistaiseksi ollut saatavissa suhteellisen vähän mikrosatelliitteja. Mikrosatelliitteja ollaan kuitenkin kehittämässä kauralle lisää (mm. Becher 2007). Lisäksi kauralle on kehitetty ns. DArT-teknologiaa, joka tulee olemaan kau- pallisesti käytettävissä Australialaisen Diversity Arrays Technology Pty Ltd – yrityksen kautta. Menetelmä perustuu DNA:n hybridisaatioon mikrosirulle ja sen avulla pystytään analysoimaan kerralla jopa useita tuhansia DNA- merkkejä. DArT kehitettiin alun perin riisillä, mutta sitä on sovellettu jo 19 muullekin kasvilajille mukaan lukien ohra ja vehnä (Akbari ym. 2006). Geeninsiirto Viljojen geeninsiirrot on enimmäkseen tehty partikkelipommitusmenetelmän avulla. Kohdesolukkona voidaan käyttää epäkypsiä alkioita tai siitepölyhiuk- kasia, embryogeenisiä solukkoviljelmiä tai esimerkiksi kauralla lehdenty- visolukkoa. Agrobakteerin avulla tehty transformaatio toimii kaksisirkkaisten kasvien lisäksi yhä tehokkaammin myös useilla viljoilla, kuten ohralla. Me- netelmänä agrobakteerivälitteinen geeninsiirto on yksinkertaisempi, tehok- kaampi ja genomiin kiinnittyy lähes aina vain yhdestä kolmeen kopiota siir- togeenistä verrattaessa partikkelipommitukseen, jossa kopioluku voi olla jopa kymmeniä. Erityisesti vähäinen kopiomäärä tuo usein etuna stabiilin suku- polvesta toiseen säilyvän geenin ilmenemisen. Kauralle hyvin toimivaa agro- 64 bakteerivälitteistä menetelmää ei ole vielä julkaistu, mutta todennäköisesti se on tulevaisuuden vaihtoehto kaurallakin. Geeninsiirtotekniikan etuna on se, että jo hyväksi havaittuun geneettiseen taustaan, eli hyvään lajikkeeseen, voidaan siirtää toivotun ominaisuuden ai- heuttava geeni, ilman risteyttämisen väistämättä aiheuttamaa koko genomin sekoittumista. Näin uuden ominaisuuden omaava lajike on mahdollista saada kauppaan nopeammin, koska lajikkeen yhtenäistämiseen tarvitaan vain lyhyt itsepölytysvaihe. Lisäksi geeninsiirtotekniikka tuo mahdollisuuden hakea toivottu ominaisuus tarvittaessa lajista, joka ei perinteisin menetelmin ristey- tyisi kauran kanssa. Tarvittaessa voidaan liikkua myös kasvimaailman ulko- puolella ja hyödyllisiä ominaisuuksia on mahdollista hakea muista organis- meista, esimerkiksi bakteereista tai eläimistä. Tekniikkana geeninsiirto on herättänyt paljon keskustelua, ja suhtautuminen siirtogeenisiin lajikkeisiin on EU:n alueella ollut varauksellinen. Siirtogeeni- siä lajikkeita kuitenkin viljellään pienimuotoisesti EU:ssakin (mm. torjunta- ainekestävää maissia Espanjassa ja soijapapua Romaniassa). Siirtogeenisiä kauralajikkeita ei tiedettävästi ole toistaiseksi viljelyssä missään maailmassa. Siirtogeenisten lajikkeiden suhteen noudatetaan EU:ssa varovaisuusperiaatet- ta, jonka perusteella hakijan täytyy osoittaa lupaa hakeva lajike syöjälleen (ravinto- tai rehukäyttö) sekä ympäristölle riskittömäksi. Euroopan markki- noille tarkoitetut gm-lajikelupahakemukset käsittelee Euroopan elintarvike- turvallisuusviranomainen EFSA (European Food Safety Authority), ja arvi- ointiprosessissa kysytään jokaisen EU-maan kantaa hakemukseen. Hyväk- synnästä päätetään EU:n korkeissa hallintoelimissä. Voidaan perustellusti väittää että siirtogeeniset tuotteet ovat tällä hetkellä EU:n kaikkein tarkimmin testatut tuotteet. Tämän tutkimuksen perusteella kotimaisten lajikkeidemme geeninsiirtojalos- tuksessa tarvittavat menetelmät ovat saatavilla. Niiden mahdollinen käyttö lajikejalostuksessa on viimekädessä yhteiskunnallinen päätös, johon vaikut- tavat kuluttajien, elintarviketeollisuuden, viljelijöiden, päättäjien ja poliitik- kojen näkökannat. Riskien lisäksi on suotavaa arvioida myös geeninmuunte- lun tuomat hyödyt ja joissakin tapauksissa harkita myös käyttämättä jättämi- sen riskit. Genomiikka Genomiikalla tarkoitetaan elävän organismin koko perintöaineksen eli geno- min tutkimusta. Kasveilla koko genomin DNA:n emäsjärjestys on selvitetty lituruoholta ja riisiltä. Funktionaalinen genomiikka tutkii kaikkien geenien ja niiden koodaamien proteiinien toimintaa ja yhteispeliä. Mikrosirujen avulla on mahdollista tutkia eliön lähes kaikkien geenien samanaikaista ilmenemistä eri olosuhteissa. Vertaileva genomiikka käyttää eri lajien DNA- 65 sekvenssitietoa mm. evolutiikan kysymysten ratkaisemiseen. Vertailevaa genomiikkaa voidaan myös hyödyntää silloin, kun tutkittavasta kasvilajista itsestään ei ole genomitietoa saatavilla. Kauralle on toistaiseksi kehitetty vasta vähän genomiikan työkaluja. Geeni- kirjastoista löytyy vielä niukasti DNA-sekvenssitietoa. Lähetti-RNA- pohjaisia EST-tunnistesekvenssejä (Expression sequence tag) on tiedossa alle 10 000, kun esimerkiksi ohran genomikirjastoista niitä löytyy yli 200 000. EST-sekvenssit edustavat periaatteessa jotain tiettyä geenituotetta ja niitä hyödynnetään geenitoiminnan tutkimuksessa, esimerkiksi kun etsitään kandi- daattigeenejä halutulle ominaisuudelle (mikrosiruanalyysi). Kauran mik- rosirua ei vielä ole saatavissa, eikä sellaista ole lähiaikoina odotettavissa. Kaupalliset Affymetrixin ohralle ja vehnälle kehittämät mikrosirut eivät ko- vin hyvin sovellu kauralle, koska niissä käytetään näille lajeille spesifisiä lyhyitä DNA-jaksoja, joihin kauran mRNA:t eivät sitoudu kunnolla. Paras tällä hetkellä olemassa oleva vaihtoehto on ohran cDNA-siru, joka perustuu pitkiin komplementaarisen DNA:n jaksoihin, joihin myös hieman kaukai- semman lajin, kuten kauran, DNA voidaan saada kiinnittymään. Kandidaattigeenejä on mahdollista etsiä myös cDNA-AFLP-tekniikalla. Siinä materiaalina käytetään DNA:n sijasta mRNA:sta tehtyä cDNA:ta. AFLP- merkit monistuvat tässä sovelluksessa toimivista geeneistä. Sirutekniikasta poiketen eroja on mahdollista löytää missä tahansa ilmenevistä geeneistä, ei vain niissä, jotka on kiinnitetty sirulle. AFLP-menetelmä optimoitiin kauralle tässä projektissa. Ominaisuuteen kytkeytyneet merkit on mahdollista kloona- ta ja sekvensoida ja bioinformatiikan työkaluilla selvittää, mihin geeneihin ne osoittavat yhtäläisyyttä. Geenisekvenssejä voidaan verrata ohran, vehnän, riisin ja arolusteen EST-kirjastoihin ja riisin genomisekvenssi-dataan. Muilta kasveilta kertynyttä tietoa käytetään hyväksi geenisekvenssien annotaatiossa eli tulkinnassa. Näin pystytään rajaamaan löytyneistä kandidaattigeeneistä ne, jotka todennäköisesti vaikuttavat haluttuun ominaisuuteen. Kun geenit tunne- taan, voidaan tuottaa spesifisiä DNA-merkkejä käytettäväksi näiden ominai- suuksien merkkiavusteisessa valinnassa. Kun kauran genomitieto tulevaisuu- dessa lisääntyy, myös genomitutkimuksen ja kauran lajikejalostuksen mah- dollisuudet paranevat. 66 Hankkeen julkaisut Projektiryhmä on hankkeen aikana julkaissut seuraavat aiheeseen liittyvät julkaisut: KIVIHARJU, E. 2004. Doubled haploids from oat (Avena sativa L.) anther culture. Teoksessa: XI International palynological congress, 4–9 July, Granada, Spain. Polen 14: 28–29. KIVIHARJU, E. 2004. Production and use of anther culture derived DH-lines of oat. Teoksessa: Pirjo Peltonen-Sainio and Mari Topi-Hulmi (toim.). Pro- ceedings 7th International Oat Conference. Agrifood Research Reports 51: 70. KIVIHARJU, E., LAURILA, J., LEHTONEN, M., TANHUANPÄÄ, P., MANNI- NEN, O. 2004. Anther culture properties of oat x wild red oat progenies and a search for RAPD markers associated with anther culture ability. Ag- ricultural and food science 13, 1–2: 151–162. KIVIHARJU, E., MANNINEN, O., PIETILÄ, L., TANHUANPÄÄ, P. 2004. DNA marker for oat dwarfing gene. Teoksessa: Pirjo Peltonen-Sainio and Mari Topi-Hulmi (toim.) Proceedings 7th International Oat Conference. Agrifood Research Reports 51: 171. KIVIHARJU, E., MANNINEN, O., TANHUANPÄÄ, P. 2006. Geenikartoitus tehostaa kauranjalostusta. Koetoiminta ja käytäntö 63 (18.12.2006): 4. Saatavissa internetistä: http://www.mtt.fi/koetoiminta/pdf/mtt-kjak- v63n04s04b.pdf KIVIHARJU, E., MOISANDER, S., LAURILA, J. 2005. Improved green plant regeneration rates from oat anther culture and the agronomic performan- ce of some DH lines. Plant cell tissue and organ culture 81: 1–9. KIVIHARJU, E., RITALA, A., TANHUANPÄÄ, P., KALENDAR, R., OKSMAN- CALDENTEY, K.-M., SUORTTI, T., MANNINEN, O., HIETANIEMI, V., PIETILÄ, L., NUUTILA, A. M., SCHULMAN, A. 2006. Biotechnology in im- proving oat β-glucan content. Teoksessa: Dietary Fibre: Multifunctional complex of components, 12.–14.6.2006. s. 89–90. KIVIHARJU, E., TANHUANPÄÄ, P., MANNINEN, O., KALENDAR, R., SCHULMAN, A. 2006. Identification of DNA markers associated with cadmium accumulation in oat. Teoksessa: Eucarpia, November 13 to 17, 2006, Lleida, Spain. s. 167. MANNINEN, O., TANHUANPÄÄ, P., KALENDAR, R., SCHULMAN, A., PIE- TILÄ, L., KIVIHARJU , E. 2006. QTLs associated with quality traits in oat DH mapping population. Teoksessa: Eucarpia, November 13 to 17, 2006, Lleida, Spain. s. 104. 67 MANNINEN, O., TANHUANPÄÄ, P., TENHOLA-ROININEN, T., KIVIHARJU, E. 2004. Doubled haploids and genetic mapping in barley, rye and oat. Teoksessa: Johann Vollmann, Heinrich Grausgruber and Peter Ruck- enbauer (toim.) Genetic variation for plant breeding: proceedings of the 17th EUCARPIA general congress, 8–11 September 2004, Tulln - Austria. Vienna: Austria. s. 309. NUUTILA, A. M., LEHTO, K., OKSMAN-CALDENTEY, K-M. 2004. Trans- genic oat for improved BYDV resistance. Teoksessa: Pirjo Peltonen- Sainio and Mari Topi-Hulmi (toim.). Proceedings 7th International Oat Conference. Agrifood Research Reports 51: 88. RITALA, A., SALMENKALLIO-MARTTILA, M., OKSMAN-CALDENTEY, K-M, SUORTTI T., SCHULMAN A., NUUTILA A. M. 2004. Genetic engineering of β-glucan contents of oats. Teoksessa: Pirjo Peltonen-Sainio and Mari Topi-Hulmi (toim.). Proceedings 7th International Oat Conference. Agri- food Research Reports 51: 152. RITALA, A., SALMENKALLIO-MARTTILA, M., OKSMAN-CALDENTEY, K-M, SUORTTI T., SCHULMAN A., NUUTILA A. M. 2004. Genetic engineering of β-glucan contents of oats. Teoksessa: Johann Vollmann, Heinrich Grausgruber and Peter Ruckenbauer (toim.) Genetic variation for plant breeding: proceedings of the 17th EUCARPIA general congress, 8–11 September 2004, Tulln - Austria. Vienna: s. 508. RITALA, A., SUORTTI, T., KALENDAR, R., SALMENKALLIO-MARTTILA, M., OKSMAN-CALDENTEY, K.-M., SCHULMAN, A. & NUUTILA, A.M. 2006. Modifying beta-glucan content of oat by genetic engineering. 8th Int. Congr. Plant Molecular Biology (ISPMB). Adelaide, Australia, 20–25 Aug. 2006, s. 111. RITALA, A., TANHUANPÄÄ, P., HOLKERI, H., KALENDAR, R., SALMEN- KALLIO-MARTTILA, M. , SUORTTI, T., SARÉN, A.-M., PIETILÄ, L., KI- VIHARJU, E., OKSMAN-CALDENTEY, K.-M. , NUUTILA, A.-M., SCHUL- MAN, A. H. 2005. Quality breeding of oat. Teoksessa: Biotechnology Ha- vana 2005: For Sustainable Food Production.Havana, Cuba, 27.11.– 2.12.2005. s. 147. TANHUANPÄÄ, P. 2004. Täsmäjalostusta teollisuuden tarpeisiin – uudet menetelmät kauran laatujalostuksessa. NeoBio vuosiseminaari 2004. (Esitelmä). TANHUANPÄÄ, P., KALENDAR, R., LAURILA, J., SCHULMAN, A. H., MAN- NINEN, O., KIVIHARJU, E. 2006. Generation of SNP markers for short straw in oat (Avena sativa L.). Genome 49: 282–287. TANHUANPÄÄ, P., KALENDAR, R., MANNINEN, O., PIETILÄ, L., LAURILA, J., SCHULMAN, A., KIVIHARJU, E. 2004. Development of SNP markers for the oat dwarfing gene Dw6. Teoksessa: Johann Vollmann, Heinrich Grausgruber and Peter Ruckenbauer (toim.) Genetic variation for plant 68 breeding: proceedings of the 17th EUCARPIA general congress, 8–11 September 2004, Tulln - Austria. Vienna: s. 315. TANHUANPÄÄ, P., KALENDAR, R., SCHULMAN, A. KIVIHARJU, E. 2006. Uncovering of a major gene for grain cadmium accumulation in oat. Teok- sessa: Plant genomics European meetings 5, Venice, 11.–14.10.2006. TANHUANPÄÄ, P., KALENDAR, R., SCHULMAN, A., KIVIHARJU, E. A ma- jor gene for grain cadmium accumulation in oat (Avena sativa L.). Ge- nome, (Painossa). TANHUANPÄÄ, P., MANNINEN, O., KALENDAR, R., SCHULMAN, A., PIE- TILÄ, E., KIVIHARJU, E. 2006. The first oat linkage map constructed us- ing androgenetic DH lines. Teoksessa: Plant genomics European meet- ings 5, Venice, 11.–14.10.2006. TANHUANPÄÄ, P., MANNINEN, O., PIETILÄ, L., KALENDAR, R., SCHUL- MAN, A., KIVIHARJU, E. 2006. A DH population for mapping quality traits in oats (Avena sativa L.). Teoksessa: COST Action 851: Gametic Cells and Molecular Breeding for Crop Improvement, Final Workshop, February 10–11, 2006. Vienna. s. 24. TANHUANPÄÄ, P., MANNINEN, O., PIETILÄ, L., KALENDAR, R., SCHUL- MAN, A., KIVIHARJU , E. 2006. A DH population for mapping quality traits in oats (Avena sativa L.). Teoksessa: The International Conference "Hap- loids in Higher Plants III", Vienna-Austria, February 12–15, 2006. Vienna. s. 30. TANHUANPÄÄ, P., RITALA, A., KALENDAR, R., SALMENKALLIO- MARTTILA, M., SUORTTI, T., PIETILÄ, L., HOLKERI, H., SAREN, A.-M., OKSMAN-CALDENTEY, K.-M., NUUTILA, A.-M., SCHULMAN, A., KIVI- HARJU, E. 2005. Tailored oats for industrial demands - modern tech- niques for quality breeding of oats. NeoBio ja Lääke 2000 -posterinäyttely BioFinland05-tapahtumassa 26.–28.4.2005. (Posteri) TUVESSON, S., DAYTEG, C., HAGBERG, P., MANNINEN, O., TANHUAN- PÄÄ, P., TENHOLA-ROININEN, T., KIVIHARJU, E., WEYEN, J., FÖRS- TER, J., SCHONDELMAIER, J., LAFFERTY, J., MARN, M., FLECK, A. 2006. Molecular markers and doubled haploids in European plant bree- ding programmes. Euphytica. Online first, DOI 10.1007/s10681-006-9239- 8. Verkkoversio on ladattavissa sivulta http://www.springerlink.com/content/cr102291u4p58643/. Kirjallisuus Akbari M., Wenzl P., Vanessa C., Carling J., Xia L., Yang S., Uszynski G., Mohler V., Lehmensiek A., Kuchel H., Hayden M. J., Howes N., Sharp P., Rathmell B., Vaughan P., Huttner E., Kilian A. 2006. Diversity Arrays 69 Technology (DArT) for high-throughput profiling of the hexaploid wheat genome. Theoretical and Applied Genetics. 113: 1409-1420. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 3389- 3402. Baur, S. K. & Geisler, G. 1996. Vererbung des β-Glucangehaltes der Haf- erkaryopse. Journal of Agricultural and Crop Science 176: 315–322. Baur, S. K. & Geisler, G. 1996. Variabilität im β-Glucangehalt der Haferkary- opse von 132 Kulturhafer- und 39 Wildhafergenotypen. Journal of Agricul- tural and Crop Science 176: 151–157. Becher E. 2007. EST-derived microsatellites as a rich source of molecular markers for oats. Plant Breeding (verkkojulkaisu 21.2.2007 sivustolla www.blackwell-synergy.com), doi: 10.1111/j.1439-0523.2007.01330.x. Becker, J. & Heun, M. 1995. Barley microsatellites: allele variation and map- ping. Plant Molecular Biology 27: 835–845. Bregitzer, P., Somers, D. A. & Rines, H. W. 1989. Development and charac- terization of friable, embryogenic oat callus. Crop Science 29: 798–803. Buckeridge, M. S., Vergara, C. E. & Carpita, N. C. 1999. The mechanism of synthesis of a mixed-linkage (1->3),(1->4)-β-D-glucan in maize (Zea mays L.). Evidence for multiple sites of glucosyl transfer in the synthase com- plex. Plant Physiology 120: 1-12. Burton, R.A., Wilson, S.M., Hrmova, M., Harvey, A.J., Shirley, N.J., Medhurst, A., Stone, B.A., Newbigin, E.J., Bacic, A. & Fincher, G.B. 2006. Cellulose synthase-like CslF genes mediate the synthesis of cell wall (1,3;1,4)- β-D- glucans. Science 311: 1940–1942. Bush, A. L. & Wise, R. P. 1998. High-resolution mapping adjacent to the Pc71 crown-rust resistance locus in hexaploid oat. Molecualr Breeding 4: 13-21. Christou, P., Ford, T. L. & Kofron, M. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Bio/Technology 9: 957–962. Clemens, S. 2001. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and ho- meostasis. Planta 212: 475–486. Foisset, N. & Delourme, R. 1996. Segregation distortion in androgenic plants. Teoksessa: Jain, M. S, Sopory, S. K. & Veilluex, R. E. (toim.) In vitro hap- loid production in higher plants. Vol 2 -Applications. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands. 70 Fromm, M. E., Morrish, F., Armstrong, C., Williams, R., Thoma, J. & Klein, T. M. 1990. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. Bio/Technology 8: 833–839. Gless, C., Lörz, H. & Jähne-Gärtner, A. 1998. Transgenic oat plants obtained at high efficiency by microprojectile bombardment of leaf base segments. Journal of Plant Physiology 152:151–157. Graner, A. 1996. RFLP-mapping the haploid genome of barley (Hordeum vulgare L.). Teoksessa: Jain, S. M., Sopory, S. K. & Veilleux, R. E. (toim.) In vitro haploid production in higher plants. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. s. 127-150. Groh, S., Kianian, S. F., Phillips, R. L., Rines, H. W., Stuthman, D. D., We- senberg, D. M. & Fulcher, R. G. 2001a. Analysis of factors influencing milling yield and their association to other traits by QTL analysis in two hexaploid oat populations. Theoretical and Appied Genetics 103: 9–18. Groh, S., Zacharias, A., Kianian, S. F., Penner, G. A., Chong, J., Rines, H. W. & Phillips, R. L. 2001b. Comparative mapping in two hexaploid oat populations. Theoretical and Appied Genetics 102: 876–884. Hackauf, B. & Wehling, P. 2002. Identification of microsatellite polymor- phisms in an expressed portion of the rye genome. Plant Breeding 121: 17–25 Hautala, J. 2002. Kaura – lastenruokien arvo-osa. Kaurasta elinvoimaa semi- naari, Jokioinen 2.10.2002, s.42–44. Hietaniemi, V., Könkö, K., Aro, H., Eurola, M., Pihlava, J.-M. & Kontturi, M. 2002. Terveysvaikutteinen kaura ja kaurafraktiot. Kaurasta elinvoimaa seminaari, Jokioinen 2.10.2002, s. 4–17. Holland, J. B., Helland, S. J., Shaporova, N. & Rhyne, D C. 2001. Polymor- phism of PCR-based markers targeting exons, introns, promoter regions, and SSRs in maize and introns and repeat sequences in oat. Genome 44: 1065–1076. Holland, J. B., Moser, H. S., O’Donoughue, L. S. & Lee, M. 1997. QTLs and epistasis associated with vernalization responses in oat. Crop Science 37: 1306–1316. Holthaus, J. F., Holland, J. B., White, P. J. & Frey, K. J. 1996. Inheritance of β-glucan content of oat grain. Crop Science 36: 567–572. Hou, X., Tong, H., Selby, J., Dewitt, J., Peng, X. & He, Z. H. 2005. Involve- ment of a cell wall-associated kinase, WAKL4, in Arabidopsis mineral re- sponses. Plant Physiology 139: 1704–1716. 71 Humphreys, D. G. & Mather, D. E. 1996. Hereditability of β-glucan, groat percentage, and crown rust resistance in two oat crosses. Euphytica 91: 359–364. Immonen, S., Tauriainen, A., Manninen, O. 1999. Assessment of green re- generants from rye and triticale anther cultures. Teoksessa: Clement, C., Pacini, E., Audran, J. C. (toim.) Anther and pollen: from biology to bio- technology. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, s. 237–245. Inoue, S. B., Takewaki, N., Takasuka, T., Mio, T., Adachi, M., Fujii, Y., Miya- moto, C., Arisawa, M., Furuichi, Y. & Watanabe, T. 1995. Characterization and gene cloning of 1,3- β-D-glucan synthase from Saccharomyces cere- visiae. European Journal of Biochemistry 231: 845–854. Jannink, J.-L. & Gardner, S. W. 2005. Expanding the pool of PCR-based markers for oat. Crop Sciece 45: 2383–2387. Jin, H., Domier, L. L., Shen, X. & Kolb, F. L. 2000. Combined AFLP and RFLP mapping in two hexaploid oat recombinant inbred populations. Ge- nome 43: 94–101. Jähne, A. & Lörz, H. 1995. Cereal microspore cultures. Plant Science109: 1– 12. Kaeppler, H. F., Menon, G. K., Skadsen R. W., Nuutila, A. M. & Carlson, A. R. 2000. Transgenic oat plants via visual selection of cells expressing green fluorescent protein. Plant Cell Reports 19: 661–666. Kalendar, R., Grop, T., Regina, M., Suoniemi, A. & Schulman, A. H. 1999. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DANN fingerprinting techniques. Theoretical and Appied Genetics 98: 704–711. Kalendar, R. & Schulman, A. H. 2006. IRAP and REMAP for retrotransposon- based genotyping and fingerprinting. Nature Protocols 1: 2478–2484. Kangas A., Kedonperä A., Laine A., Niskanen M., Salo Y., Vuorinen M., Jau- hiainen L. & Mäkelä L. 2002. Viljalajikkeiden taudinalttius virallisissa laji- kekokeissa 1991–2001. MTT:n selvityksiä 9. Jokioinen: MTT. s. 43–45. Kempe, R., Särkijärvi, S., Saastamoinen, M., Ahtila, L. & Kommeri, U. 2001. Kaura hevosten ja koirien ruokinnassa ja rehujen raaka-aineena. Teok- sessa: Salovaara, H., Sontag-Strohm, T. (toim.). Kaurasta elinvoimaa: maa- ja metsätalousministeriön rahoittamat kansallisen kauraohjelman tutkimushankkeet 1998–2000. Helsingin yliopisto. Elintarviketeknologian laitos. EKT-sarja 1221: 109–126. Kianian, S. F., Phillips, R. Ll, Rines, H. W, Fulcher, R. G., Webster, F. H. & Stuthman, D. D. 2000. Quantitative trait loci influencing β-glucan content in oat (Avena sativa, 2n=6x=42) Theoretical and Appied Genetics 101: 1039–1048. 72 Kianian, S. F., Egli, M. A., Phillips, R. L., Rines, H. W., Somers, D. A., Gegenbach, B. G., Webster, F. H., Livingston, S. M., Groh, S., O’Donoughue, L. S., Sorrels, M. E., Wesenberg, D. M., Stuthman, D. D. & Fulcher, R. G. 1999. Association of a major groat oil content QTL and an acetyl-CoA carboxylase gene in oat. Theoretical and Appied Genetics 98: 884–894. Kibite, S. & Edney, M. J. 1998. The inheritance of β-glucan concentrations in three oat (Avena sativa L.) crosses. Canadian Journal of Plant Science 78: 245–250. Kiviharju, E., Moisander, S. & Laurila, J. 2005. Improved green plant regen- eration rates from oat anther culture and the agronomic performance of some DH lines. Plant cell tissue and organ culture 81: 1–9. Kiviharju, E., Puolimatka, M., Saastamoinen, M., Pehu, E. 2000. Extension of anther culture to several genotypes of cultivated oats. Plant Cell Reports 19: 674–679. de Koeyer, D. L., Tinker, N. A., Wight, C. P., Deyl, J., Burrows, V. D., O'Donoughue, L. S., Lybaert, A., Molnar, S. J., Armstrong, K. C., Fedak, G., Wesenberg, D. M., Rossnagel, B. G. & McElroy, A. R. 2004. A mo- lecular linkage map with associated QTLs from a hulless x covered spring oat population. Theoretical and Applied Genetetics 108: 1285–1298. Kunz, C., Islam, S. M. S., Berberat, J., Peter, S. O., Büter, B., Stamp, P. & Schmid, J. E. 2000. Assessment and imrpovement if wheat microspore derived embryo indusction and regeneration. Journal of Plant Physiology 156: 190–196. Lander, E. S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, A., Daly, M. J., Lincoln, S. E., & Newburg, L. 1987. MAPMAKER: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1: 174–181. Li, C. D., Rossnagel, B. G. & Scoles, G. J. 2000. The development of oat microsatellite markers and their use in identifying relationships among Avena species and oat cultivars. Theoretical and Appied Genetics 101: 1259–1268. Li, G. & Quiros, C. F. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its appli- cation to mapping and gene tagging in Brassica. Theoretical and Appied Genetics 103: 455–461. Liu, Z. W., Biyashev, R. M. & Saghai Maroof, M. A. 1996. Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theoretical and Appied Genetics 93: 869–876. 73 Manninen, O. 2000. Assoviations between anther-culture response and mo- lecular markers on chromosomes 2H, 3H and 4H of barley (Hordeum vul- gare L.). Theorethical and Applied Genetics 100: 57–62. McCleary, B. V. & Codd R. 1991. Measurement of (1-3)(1-4)-β-D-glucan in barley and oats: a streamlined enzymic procedure. Journal of the Science of Food and Agriculture 55: 303–312. Michelmore, R. W., Paran, I. & Kesseli, R. V. 1991. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregat- ing populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828–9832. Mordhorst, A. P. & Lörz, H. 1993. Embryogenesis and development of iso- lated barley (Hordeum vulgare L.) microspores are influenced by the amount and composition of nitrogen sources in culture medium. Journal of Plant Physiology 142: 485–492. Murashige, T. & Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 437–497. Murray, H. G. & Thompson, W. F. 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Resesearch 8: 4321–4326. Mäkelä-Kurtto, R., Louekari, K., Nummivuori, S., Sippola, J., Kaasalainen, M., Kuusisto, E., Virtanen, V., Salminen, R., Tarvainen, T. & Malm, J. 2003. Kadmium Suomen peltoekosysteemeissä: pitoisuuksia, taseita ja riskejä. Maa- ja elintarviketalous 27. Jokioinen: MTT. 51s. ISBN 951-729-769-6. O’Donoughue, L. S., Kianian, S. F., Rayapati, P. J., Penner, G. A., Sorrels, M. E., Tanksley, S. D., Phillips, R. L., Rines, H. W., Lee, M., Fedak, G., Molnar, S. J., Hoffman, D., Salas, C. A., Wu, B., Autrique, E. & Van Deyn- ze, A. 1995. A molecular linkage map of cultivated oat. Genome 38: 368– 380. Ouyang, J. W., Jia, S. E., Zhang, C., Chen, X. & Feng, G. 1989. A new syn- thetic medium (W14) for wheat anther culture. Annu. Rep. Inst. Genetics, Academia Sinica 1987–1988: 91–92, Beijing. Pal, N., Sandhu, J. S., Domier, L. L., & Kolb F. L. 2002. Development and characterization of microsatellite and RFLP-derived PCR markers in oat. Crop Science 42: 912–918. Paul, G. L., Onk, S. L. & Geiger, C. J. 1999. The Quaker Oats health claim: A case study. Journal of Nutraceuticals, Functional and Medicinal Foods 1: 5–32. Portyanko, V. A., Chen, G., Rines, H. W., Phillips, R. L., Leonard, K. J., Ochocki, G. E. & Stuthman, D. D. 2005. Quantitative trait loci for partial resistance to crown rust, Puccinia coronata, in cultivated oat, Avena sativa L. Theoretical and Applied Genetics 111: 313–324. 74 Portyanko, V. A., Hoffman, D. L., Lee, M. & Holland, J. B. 2001. A linkage map of hexaploid oat based on grass anchor DNA clones and its relation- ship to other oat maps. Genome 44: 249–265. Poulsen, G. B., Kahl, G. & Weising, K. 1993. Abundance and polymorphism of simple repetitive DNA sequences in Brassica napus L. Theoretical and Appied Genetics 85: 994–1000. Pullinen, T. 1998. Oats: A strategic Assessment. Prepared for the Finnish Ministry of Agriculture and Forestry. Sparks Companies, Inc, Memphis, TN, USA / Bio Business Consulting, Riihimäki, Finland. Ramsay, L., Macaulay, M., degli Ivanissevich, S., MacLean, K., Cardle, L., Fuller, J., Edwards, K. J., Tuvesson, S., Morgante, M., Massari, A., Maes- tri, E., Marmiroli, N., Sjakste, T., Ganal, M., Powell, W. & Waugh, R. 2000. A simple sequence repeat-based linkage map of barley. Genetics 156: 1997–2005. Rines. H. W., Riera-Lizarazu, O., Nunez, V. M., Davis, D. W. & Phillips, R. L. 1997. Oat haploids from anther culture and from wide hybridisations. Te- oksessa: Jain, S. M., Sopory, S. K. & Veilleux, R. E. (toim.) In vitro haploid production in higher plants, Kluwer, Dordrecht 4: 205–221. Ritala, A., Mannonen, L. & Oksman-Caldentey, K.-M. 2001. Factors affecting the regeneration capacity of isolated barley microspores (Hordeum vul- gare L.). Plant Cell Reports 20: 403–407. Sasaki, K., Ohara, K. & Yazaki, K. 2005. Gene expresiioin and characteriza- tion of isoprene synthase from Populus alba. FEBS Letters 579: 2514– 2518. Saastamoinen, M. 1999. Aslak-oat. Boreal Research Report 9. 15 s. ISBN 952-5133-08-7. Salmenkallio-Marttila, M., Heiniö, R.-L., Myllymäki, O., Lille, M., Autio, K & Poutanen, K. 2004. Relating microstructure, sensory and instrumental tex- ture of processed oat. Agricultural and Food Science 13:124–137. Salmenkallio-Marttila M, Kauppinen V. 1995. Efficient regeneration of fertile plants from protoplasts isolated from microspore cultures of barley (Hor- deum vulgare L.). Plant Cell. Rep. 14: 253–256. Sivaguru, M., Ezaki, B., He, Z.-H., Tong, H., Osawa, H., Baluška, F., Volk- mann, D. & Matsumoto, H. 2003. Aluminium-induced gene expression and protein localization of a cell wall-associated receptor kinase in Arabi- dopsis. Plant Physiology 132: 2256–2266. Somers, D. A., Rines, H. W., Gu, W., Kaeppler, H. F. & Bushnell, W. R. 1992. Fertile, transgenic oat plants. Bio/Technology 10: 1589–1594. 75 Suortti, T. 1993. Size-exclusion chromatographic determination of beta- glucan with postcolumn reaction detection. Journal of Chromatography 632: 105–110. Tinker, N. A. & Mather, D. E. 1995. MQTL: software for simplified composite interval mapping of QTL in multiple environments. JAG 1:2. Saatavissa in- ternetistä: http://wheat.usda.gov/jag Touraev, A., Indrianto, A., Wratschko, I., Vicente, O. & Heberle-Bors, E. 1996. Efficient microspore embryogenesis in wheat Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperature. Sexual Plant Reproduction 9: 209–215. Vanithrani, R., Chellappan, P. & Fauquet, C.M. 2003. Short interfering RNA- mediated interference of gene expression and viral DNA-accumulation in cultured plant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100: 9632–9636. Van Ooijen, J. W. & Voorrips, R. E. 2001. JoinMap® 3.0. Software for the calculation of genetic linkage maps. Plant Research International, Wagen- ingen, the Netherlands. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuipe, M. & Zabeau, M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407– 4414. Wan, Y. & Lemaux, P. G. 1994. Generation of large numbers if independently transformed fertile barley plants. Plant Physiology 104: 37–48. Wight, C. P., Tinker, A., Kianian, S. F., Sorrells, M. E., O’Donoughue, L. S., Hoffman, D. L., Groh, S., Scoles, G. J., Li, C. D., Webster, F. H., Phillips, R. L., Rines, H. W., Livingston, S. M., Armstrong, K. C., Fedak, G. & Molnar, S. J. 2003. A molecular marker map in ‘Kanota’ × ‘Ogle’ hexaploid oat (Avena spp.) enhanced by additional markers and a robust framework. Genome 46: 28–47. Zietkiewicz, E., Rafalski, A, & Labuda, D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction am- plification. Genomics 20: 176–183. Zhu, S. & Kaeppler, H. F. 2003. A genetic linkage map for hexaploid, culti- vated oat (Avena sativa L.) based on an intraspecific cross 'Ogle/MAM17- 5'. Theoretical and Applied Genetics 107: 26–35. Zhu, S., Kolb, F. L. & Kaeppler, H. F. 2003. Molecular mapping of genomic regions underlying barley yellow dwarf tolerance in cultivated oat (Avena sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 106: 1300–1306. 76 Maa- ja elintarviketalous -sarjan kasvintuotantoteemassa ilmestyneitä julkaisuja 2007 99 Biotekniikka kauran jalostuksessa. Uudet menetelmät laadun paranta- miseksi. Kiviharju, E., Ritala, A., Schulman, A., Pietilä, L., Tanhuan- pää, P. (toim.) 76 s. Hinta 20 euroa. 2006 91 Suomen kansallisten kasvigeenivarojen pitkäaikaissäilytysohjeet. Vi- herrakentamisen kasvit. Aaltonen ym. 253 s. Hinta 25 euroa. 89 Suomen kansallisten kasvigeenivarojen pitkäaikaissäilytysohjeet. He- delmät ja marjakasvit. Aaltonen ym. 160 s. Hinta 25 euroa. 85 Suomen kansallisten kasvigeenivarojen pitkäaikaissäilytysohjeet. Vi- hannes, yrtti- ja rohdoskasvit. Ahokas, ym. 99 s. Hinta 20 euroa. 84 Pohjoisessa kasvatettujen yrttien aromisuus. Galambosi & Serenius. 113 s. Hinta 25 euroa. 78 Population structure of Pyrenophora teres, the causal agent of net blotch of barley. Serenius, M. 60 s. Hinta 20 euroa. 2005 67 Viljojen kehityksen ja kasvun ABC. Peltonen-Sainio , P. ym. 72 s. Hin- ta 6 euroa. 1 Ruokohelven viljely ja korjuu energian tuotantoa varten. 2. korjattu painos. Pahkala, K. ym. 31 s. Hinta 15 euroa. Julkaisuviitteet löytyvät sarjojen internetsivuilta www.mtt.fi/julkaisut/sarjathaku.html. Maa- ja elintarviketalous 99 Maa- ja elintarviketalous 99 99 Biotekniikka kauran jalostuksessa – Uudet menetelmät laadun parantamiseks i Kasvintuotanto Elina Kiviharju, Anneli Ritala, Alan Schulman, Leena Pietilä, Pirjo Tanhuanpää (toim.) Biotekniikka kauran jalostuksessa Uudet menetelmät laadun parantamiseksi