K A L A T U T K I M U K S I A F I S K U N D E R S Ö K N I N G A R 188 Päivi Eskelinen (toim.) Vesihome kalanviljelyn vaivana Onko taudin torjuntaan menetelmiä? Helsinki 2003 Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos Vastaava toimittaja: Raimo Parmanne Kansi: Vesihomeen rihmastoa. Kuva: Anna Alaranta ISBN 951-776-408-1 ISSN 0787-8478 Edita Prima Oy Helsinki 2003 Sisällys VESIHOME JA VESIHOMETARTUNTA ............................................................................................1 Päivi Eskelinen ja Pia Vennerström TAUDINAIHEUTUSKYKYINEN VESIHOMEKLOONI (SAPROLEGNIA SP.) SUOMESSA JA RUOTSISSA ................................................................................................................ 7 Päivi Pylkkö MALAKIITTIVIHREÄN VAIHTOEHDOT HAUDONNASSA......................................................... 13 Päivi Eskelinen, Päivi Pylkkö ja Erja Konttinen MALAKIITTIVIHREÄN VAIHTOEHDOT KALOJEN VESIHOMEEN TORJUNTAKYLVETYKSISSÄ .......................................................................................................... 35 Yrjö Lankinen ja Anu Halttunen VESIHOMEEN TORJUNTA RAVUN MÄDIN HAUDONNASSA................................................... 49 Anna Alaranta, Jaakko Haverinen ja Päivi Eskelinen Vesihome ja vesihometartunta Päivi Eskelinen1 ja Pia Vennerström2 1) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos, Laukaan kalantutkimus ja vesiviljely, Vilp- pulantie 415, 41360 Valkola 2) Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitos, Patologian tutkimusyksikkö, PL 45, 00581 Helsinki 3 1. Vesihomeet ovat yleisiä makean veden sieniä Vesihome on yleinen nimitys vedessä eläville sienille. Kalojen vesihometartunnoissa on tavattu useita eri lajeja, mutta Suomessa kyseessä on yleisimmin ollut Saprolegnia –lajiin kuuluvat sienet. Ne ovat makean veden sieniä, joita esiintyy kaikkialla maail- massa. Myös murtovedessä on todettu vesihometartuntoja, joskin harvemmin. Sieni- rihmat kasvavat vedessä johonkin alustaan kiinnittyneenä pumpulimaisena kasvusto- na. Useimmat vedessä esiintyvät sienilajit ovat harmittomia kaloille ja muille vesieli- öille. Saprolegnia-sienen elinkierto on monimutkainen, ja siihen kuuluu useita vaiheita, joissa sieni voi lisääntyä. Sieni lisääntyy sekä suvullisesti että suvuttomasti. Suvuton lisääntyminen on yleisempää (Noga 1993). Siinä sienirihma voi tuottaa siimallisia iti- öitä, primäärisiä parveiluitiöitä (zoosporeja), jotka asettuvat sienirihman lähelle ja muodostavat lepoitiön. Tämä lepoitiö voi kasvattaa uutta sienirihmaa tai muodostaa sekundäärisiä parveiluitiöitä, jotka voivat kulkeutua vedessä kauaskin, koska ne pys- tyvät liikkumaan siimojen avulla paljon pidemmän ajan kuin primääriset parveiluitiöt. Sekundäärisiä parveiluitiöitä pidetään pääasiallisena homesienen leviämistapana. Ne voivat elää vapaina useita päiviä tai asettua lepoitiöksi, joka alkaa kasvattaa sienirih- maa, kun olosuhteet tulevat sopiviksi. Vesihomeen lisääntyminen suvuttomasti itiöimällä mahdollistaa perimältään täysin samanlaisten kloonien muodostumisen. Itiöimisen vuoksi vesihomesienet ovat tehok- kaita leviämään paikasta toiseen, ja jos itiöstä vielä muodostuu lepoitiö, se selviytyy pitkiä aikoja hyvinkin kehnoissa oloissa. 2. Mikä vesihometartunta on? Vesihometartunta on kalojen tautitila, jonka vedessä esiintyvät homesienet aiheuttavat. Ulkoisesti kaloissa näkyvä homekasvusto koostuu suuresta määrästä sienirihmoja eli hyyfejä, jotka näkyvät vaaleana pumpulimaisena kasvustona kalan pinnalla. Home nä- kyy parhaiten, kun kala on vedessä. Vedestä nostetussa kalassa kasvusto vaikuttaa lä- hinnä limaiselta kohoumalta. Kaloja sairastuttavat monet vesihomesienet, jotka kuuluvat Saprolegnia-, Achlya-, Aphanomyces-, Leptolegnia-, Leptomitus- ja Pythiopsis–sukuihin. Vesihome kalassa voi olla yhden lajin kasvusto tai useamman lajin sekakasvusto. Tavallisimmat vesiho- meen aiheuttajat kuuluvat meillä Saprolegnia parasitica-diclina –kompleksiin, ja juuri näitä lajeja vesihomeeseen kuolleista kaloista onkin viime vuosina eristetty. Tässä la- jikompleksissa on useita geneettisesti erilaisia muotoja. Osa niistä on erikoistunut esiintymään vain tietynlaisissa paikoissa tai tietyillä kaloilla. Vesihomeen katsotaan olevan yleisimmin toissijainen taudinaiheuttaja. Jotta vesihome voisi aiheuttaa taudin, kalan vastustuskyvyn pitää olla heikentynyt (Pickering ja Chris- tie 1980). Vastustuskyky saattaa heikentyä jonkun muun taudin, ihovaurion tai ulkoi- sen häiriötekijän seurauksena. Joissain tapauksissa on epäilty, että vesihome olisi ensi- sijainen taudinaiheuttaja. Vesihometartuntaa on viime vuosina todettu ilman selvää al- tistavaa tekijää sekä luonnonkaloissa että viljelyssä Suomen lisäksi ainakin Norjassa, Espanjassa, USA:ssa, Englannissa ja Japanissa (Poppe ja Hegge 2000, Johnsen ja Ugedal 2001). Vesihometartuntoja on esiintynyt lohella, siialla, kirjolohella, taimenilla ja nieriällä. Vesihometta esiintyy kaikkina vuodenaikoina, mutta kalanviljelylaitosten tautihuiput osuvat yleensä kevääseen ja syksyyn, kun veden lämpötila muuttuu. Myös smolttiu- tuminen, sukukypsymisen aiheuttamat fysiologiset muutokset kalassa sekä lisääntymi- nen altistavat kaloja vesihometartunnalle. Pickering ja Christie (1980) havaitsivat, että sukukypsät taimenkoiraat sairastuvat naaraita helpommin vesihometartuntaan. Kalan 4 puolustusvasteessa vuodenkierron mukaan tapahtuvat muutokset on kytketty vakaviin sienitartuntoihin esimerkiksi Tyynenmeren alueella. Koska vedessä on aina veden luontaiseen eliöstöön kuuluvien vesihomesienten itiöitä, kala ei voi välttyä niiltä, ja niitä esiintyy normaalistikin kalan pinnalla. Kalan ihon li- massa on monenlaisia puolustusjärjestelmän soluja ja aineita, jotka eliminoivat vierai- ta tunkeutujia. Kun kalan vastustuskyky jostain syystä on heikentynyt, kalan ihon pin- nalla olevat itiöt tunkeutuvat kalan ihoon ja alkavat kasvattaa ohuita sienirihmoja ihol- le ja ihon sisälle. Itiön kasvu rihmaksi ja tunkeutuminen kalan ihoon edellyttää toden- näköisesti muutoksia ihossa. Kaloihin muodostuvat sienikasvustot kylvävät tehokkaas- ti itiöitä veteen. Vesihometartunnan saanut kala kuolee lopulta homeen vaurioittamas- ta ihosta vuotavien ruumiinnesteiden menetyksen seurauksena. Suomessa vesihometartuntaan sairastuneiden kalojen muutokset muistuttavat UDN (ulcerative dermal necrosis) -oireyhtymässä kuvattuja muutoksia, mutta eivät kuiten- kaan täytä tälle taudille asetettuja kriteerejä. Vesihome tarttuu helposti myös kuolleisiin mätimuniin, joista sienirihmat leviävät elävään mätiin. Mätiin tarttuvat vesihomeet ovat samoja lajeja kuin kalojen vesihome- tartuntaa aiheuttavat sienet. 3. Vesihometartuntojen levinneisyys ja torjunta Vesihometartuntoja ja niistä johtuvia kalojen kuolemia on raportoitu eri puolilla maa- ilmaa. Meillä vesihometartuntoja alkoi esiintyä 1990-luvun puolivälissä, ja erityisesti niitä raportoitiin vuosituhannen vaihteessa (Leinonen 1999, Vennerström et al. 1999, Pylkkö ja Vennerström 2000, Pylkkö et al. 2001.). Viime aikoina vesihometartuntoja on ollut vähemmän. Tautitapauksia on esiintynyt sekä viljelylaitoksilla että laitoksilta istutetuissa järvilohissa ja taimenissa, jonkin verran myös onkilammikoiden kirjolo- hissa. Luonnonkaloista on satunnaisia hometartuntahavaintoja. Toistaiseksi ainoa tapa hoitaa hometartuntoja kalanviljelylaitoksilla ovat kylvetykset. Kylvetysten tarkoituksena on pitää veden vesihomeitiöiden määrä mahdollisimman pienenä, tämä on tarpeellista varsinkin riskiaikoina keväällä ja syksyllä. Malakiittivih- reäkylvetysten poistuminen hometartuntojen hoitomenetelmien valikoimasta on huo- mattavasti hankaloittanut vesihometaudin torjuntaa. Malakiitti on ollut tehokas ja käyttökustannuksiltaan edullinen aine homeen ennaltaehkäisyyn ja torjuntaan erityi- sesti mädin haudonnassa. Kun kalojen hometartunta yleistyi, malakiittia käytettiin menestyksellä myös kalojen homesienten kurissa pitämiseen. Homeeseen jo sairastu- neita kaloja ei yleensä kuitenkaan kyetä kylvetyksillä pelastamaan, ja niiden nopea poistaminen altaista on erittäin tärkeätä, koska homekasvustot ovat pahimpia homeen kylväjiä ja levittäjiä. Kalojen vesihomeen hoitoon on esitetty useita aineita, joista osa jo on vesiviljelykäytössä muihin tarkoituksiin, tai ne ovat tyypiltään sellaisia, että ne eivät vaadi erityistä hyväksymismenettelyä. Vesihomeen torjunnassa kylvetykset ovat kuitenkin vain taudin oireiden hoitoa ja tau- din leviämisen mahdollista ennaltaehkäisyä. Vaikka vesihometartunnan hoitoon voi- taisiinkin löytää tehokkaita kylvetyskemikaaleja, itse taudin syiden sekä leviämis- ja ennaltaehkäisytapojen löytäminen vasta voisi auttaa pääsemään taudista eroon ja luo- maan viljelyyn sellaisia uudenlaisia toimintatapoja, joiden avulla vesihometartuntaa voidaan hallita. On myös mahdollista, että kyseessä on arvoituksellinen, syklisesti esiintyvä oireyhtymä, joka häviää ja ilmaantuu joskus vuosien perästä uudelleen. 5 Kirjallisuus Leinonen, T. (toim.) 1999. Hoitotoimien ja allashydrauliikan vaikutuksista vesiho- meen esiintymiseen Laukaan ja Kainuun kalanviljelylaitoksissa. Kala- ja riistaraport- teja nro 144. 19 s. Johnsen, B.O. & Ugedal, O. 2001. Soppinfeksjoner (Saprolegnia spp.) på laksefisk i Norge – statusrapport. NINA Oppdragsmelding 716: 1-34. Noga, E.J. 1993. Water mold infections of freshwater fish: recent advances. Annual Rev. of Fish Diseases 291-304. Poppe, T.T. & Hegge, O. 2000. Sopp, en alvorlig trussel mot hunderørreten. Jakt & Fiske 8/2000: 120-126. Pickering, A.D. & Christie, P. 1980. Sexual differences in the incidence and severity of ectoparasitic infestation of the brown trout, Salmo trutta L. J. Fish Biol. 16: 669- 683. Pylkkö, P. & Vennerström, P. (toim.) 2000. Vesihomeitiöiden lukumäärät ja vesiho- metartunnat Laukaan, Kainuun ja Taivalkosken kalanviljelylaitoksissa. Kala- ja riista- raportteja nro 194. 50 s. Pylkkö, P., Eskelinen, P., Rahkonen R. & Vennerström, P. 2001. Vesihomeessa kalat pukeutuvat turkkiin. Suomen Kalastuslehti 1/2001: 8-9. Vennerström, P., Pylkkö, P., Säkki, S. & Leinonen, T. 1999. High mortality among brood fish in Finland due to infection by Saprolegnia sp. ”Diseases of fish and shell- fish”, 9th International Conference of European Association of Fish Pathologists, 19- 24th September 1999, Rhodes, Greece. Abstract book, p. 226. Poster. Taudinaiheutuskykyinen vesihomeklooni (Saprolegnia sp.) Suomessa ja Ruotsissa Päivi Pylkkö Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos, Laukaan kalantutkimus ja vesiviljely, Vilppu- lantie 415, 41360 Valkola nykyinen osoite: Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus, Turkistutkimus, Turkis- tie 8, 69100 Kannus 9 1. Vesihomesienten lajinmääritys Muutaman viime vuoden aikana on Suomen ja Skandinavian alueella lisääntynyt vesi- homesienen (Saprolegnia sp.) sairastuttamien ja vesihometartuntaan kuolleiden kalo- jen määrä. Vesihomeen vaivaamia kaloja löytyy sekä luonnosta että viljelyoloista. Lai- tosviljelyssä olevista kaloista erityisen herkkiä vesihometartunnalle näyttävät olevan siika ja järvilohi. Kuolleisuus, jossa ainoa määritetty taudinaiheuttaja kuuluu Sapro- legnia sp. –sieniin, saattaa edetä parvessa nopeasti, ja jopa 90 % parven kaloista voi kuolla vesihometartuntaan. Vesihomekasvusto näkyy pääsääntöisesti kalan pinnalla vaaleana ja pumpulimaisena peitteenä. Sienen peittämän alueen laajuus vaihtelee. Vesihomesienen rihmastoa on kyetty eristämään myös kalan sisäelimistä (Khoo 2000, Hussein et al. 2001, Grandes et al. 2001). Vesihomesienilajien tunnistus on aiemmin perustunut sienten suvullisen lisääntymisen rakenteellisten ominaisuuksien tunnistamiseen (Willoughby 1978, Neish ja Hughes 1980). Lisäksi lajitunnistuksessa on käytetty sienten lepoitiöiden tuotantotapoja. Labo- ratoriossa sieni lisääntyy harvoin suvullisesti, minkä vuoksi lajintunnistukseen käyte- tään nykyisin perimän tyypittämiseen kehitettyjä molekyylibiologisia menetelmiä mm. geenimonistusta. Geenimonistuksen (RAPD-PCR, random amplification of poly- morphic DNA polymerase chain reaction) avulla on kyetty menestyksellä erottamaan Saprolegnia sp. -vesihomesienen alalajeja (Lee ja Taylor 1990, Diéguez-Uribeondo et al. 1996, Bangyeekhun et al. 2001). Tässä raportissa kuvatun tutkimuksen tarkoituksena oli soveltaa molekyylibiologisia menetelmiä Suomessa eristettyjen Saprolegnia sp. -kantojen vertailuun. Perimän ra- kenteen selvittämisen avulla tutkittiin, millaisia vesihometaudin aiheuttajat ovat ja mi- ten vesihomesienet ovat Suomessa levinneet. 2. Suomen vesihometartunnoissa sieni on perimältään usein sama Vesihometartunnan saaneista lohikaloista (järvitaimen, siika, kirjolohi, puronieriä, jär- vilohi ja lohi), jokiravusta ja kalankasvatusaltaiden vedestä eristettyjen 31 sienikannan perimä analysoitiin RAPD-PCR menetelmällä Upsalan yliopiston evoluutiobiologian osastolla vuonna 2001. Viljeltyjen kalojen vesihomenäytteet oli eristetty Laukaasta, Paltamosta, Rautalammilta ja Tervosta ja luonnonkalan näyte Helsingin seudulta. Jo- kiravun vesihome-eristys oli peräisin Temmesjoelta. Vesinäytteet olivat Laukaasta ja Paltamosta. Näiden kantojen itiötuotantomuotoja käytettiin apuna sienilajin varmen- tamiseksi. Vertailussa oli mukana myös kaksi ruotsalaista vesihomekantaa. Tyypityk- sen apuna käytettiin perimältään tunnettuja Saprolegnia diclina –vesihomesienen ns. pankkikantoja (Sdi 2003h ja Sdi ATCC #42062). Perimältään yhtenäinen (95,9 %:n samankaltaisuus) ryhmä Saprolegnia sp. -tartuntoja aiheuttaneista kannoista muodostui 26:sta eristetyistä 31 kannasta (Bangyeekhun et al. 2003). Tästä käytettiin nimeä ryhmä 1. Se on maantieteellisesti laajalle levinnyt (kuva 1). Ryhmä 1 muodosti kasvullisen rihmaston lepoitiövaiheen jälkeen. Laaja levinnei- syys viittaa sienikannan tehokkaaseen taudinaiheutuskykyyn. Eristetyistä kannoista löydettiin myös kolme muuta perimältään epäyhtenäistä ryhmää (ryhmät 2, 3, ja 4), joita kutakin edusti yhdestä kolmeen eristystä. Ryhmät 3 ja 4 tuottivat itiöitä ilman le- poitiövaihetta, kun taas ryhmä 2 käyttäytyi ryhmän 1 kaltaisesti. Lepoitiötuotanto yh- distyy selvästi sienen perimään. Sienilajin kykyä tuottaa peräkkäin useita sukupolvia sekundäärisiä parveiluitiöitä on usein pidetty tehokkaan taudinaiheutuskyvyn merkki- nä, tai tätä ominaisuutta voidaan käyttää patogeenisten vesihomesienikantojen tunnis- tamiseen. Suomalaista vesihomesienikannoista laajimmalle levinneellä ei tätä ominai- suutta ollut. Taudinaiheutuskyvyn ominaisuuksien tunteminen vaatii siten lisäselvityk- siä meillä voimakkaasti tautia aiheuttavilla Saprolegnia sp. -kannoilla. 10 Uumaja Ryhmä 1 (2) Temmesjoki Ryhmä 3 (1) Paltamo Ryhmä 3 (2) Ryhmä 1 (6) Ryhmä 2 (1) Tervo Ryhmä 1 (3) Rautalampi Ryhmä 1 (1) Ryhmä 4 (1)Laukaa Ryhmä 1 (13) Helsinki Ryhmä 1 (1) 0 100 200 km Pohjoinen Kuva 1. Genotyypitettyjen vesihomesienten alkuperä ja eri esiintymispaikoil- ta eristetyt kannat ryhmiteltynä neljään ryhmään. Suluissa esiintymispaikan eristysten lukumäärä kussakin ryhmässä. 11 Kirjallisuus Bangyeekhun, E., Quiniou, S.M.A., Bly, J.E. & Cerenius L. 2001. Characterisation of Saprolegnia sp. isolates from channel catfish. Dis. Aquat. Org. 45: 53-59. Bangyeekhun, E., Pylkkö, P., Vennerström, P., Kuronen, H. & Cerenius, L. 2003. Prevalence of a single fish-pathogenic Saprolegnia sp. clone in Finland and Sweden. Dis. Aquat. Org. 53(1): 47-53. Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L. & Söderhäll, K. 1996. Physiological characterisa- tion of Saprolegnia parasitica isolates from brown trout. Aquaculture 140: 247-257. Grandes, J.M.F., Díez, M.F. & Gancedo, J.M.A. 2001. Experimental pathogenicity in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), of two distinct morphotypes of long- spined Saprolegnia isolates obtained from wild brown trout, Salmo trutta L., and river water. J. Fish Dis. 24: 351-359. Hussein, M., Hatai, K. & Nomura, T. 2001. Saprolegniosis in salmonids and their eggs in Japan. J. Wildl. Dis. 37: 204-207. Khoo, L. 2000. Fungal diseases in fish. Semin. Avian Exot. Pet. 9: 102-111. Lee, S.B. & Taylor, J.W. 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Snisky, J.J. & White, T.J. (ed.): PCR protocols: A quide to methods and applications. Academic Press, San Diego CA, USA, p. 282- 287. Neish, G.A. & Hughes, G.C. 1980. Fungal diseases of fish. Snieszko S.F. & Axelrod H.R (ed.) Diseases of Fish. Book 6. T.F.H. Publication, Neptune, NJ, 159 p. Willoughby, L.G. 1978. Saprolegnias of salmonid fish in Windermere: a critical analysis. J. Fish Dis. 1: 51-67. Malakiittivihreän vaihtoehdot haudonnassa Päivi Eskelinen1, Päivi Pylkkö2 ja Erja Konttinen3 1) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos, Laukaan kalantutkimus ja vesiviljely, Vilp- pulantie 415, 41360 Valkola 2) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos, Laukaan kalantutkimus ja vesiviljely, Vilp- pulantie 415, 41360 Valkola, nykyinen osoite: Maa- ja elintarviketalouden tutkimus- keskus, Turkistutkimus, Turkistie 8, 69100 Kannus 3) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos, Kainuun kalantutkimus ja vesiviljely, Ma- namansalontie 90, 88300 Paltamo 15 1. Johdanto 1.1. Kuolleet mätimunat homehtuvat Kuolleet mätimunat ovat vesihomesienten itiöille sopiva kasvualusta (Kitancharoen ja Hatai 1996, Smith et al. 1985). Parveiluitiöitä pidetään vesihomesienten pääasiallisena leviämistapana. Ne voivat elää vapaina useita päiviä tai asettua lepoitiöksi, ja alkaa kasvattaa sienirihmaa sopivissa olosuhteissa. Kitanchroenin ja Hatain (1996) tartutus- kokeissa homesienirihmaa ei kasvanut ollenkaan elävissä mätimunissa, kuolleista sen sijaan huomattava osa infektoitui. Smith et al. (1985) havaitsivat, että homesienen zoosporit infektoivat vain kuolleita kirjolohen mätimunia, erityisesti alavirtaan home- kasvustosta. Sienirihma sen sijaan kasvoi myös elävien munien päällä. Sienirihman on havaittu vahingoittavan munan kuoren hienorakennetta ja heikentävän sitä (Gajduesek ja Rubcov 1985), jotkut sienirihmat pystyivät jopa tunkeutumaan karpin mätimunan kuoren läpi. Elävän mätimunan pinnalla kasvava homesienirihmasto estää hapen kul- keutumista munan kuoren läpi ja johtaa sitä kautta munien kuolemiseen. Kylvettämällä haudottavaa mätiä homeenestokemikaaleilla voidaan estää sekä parvei- luitiöiden kiinnittyminen että sienirihman kasvu kiinnittyneistä itiöistä. Willoughbyn ja Robertsin (1992) mukaan jatkuva malakiittivihreäkylvetys tehosi parveiluitiöihin ja sekundäärisiin kystiin, kun taas kylvetys kerran päivässä tehosi pieniin sienirihmoihin ja vedessä oleviin parveiluitiöihin ja lepomuotoihin. Haudontatuloksen kannalta olisi parasta tuhota veden itiöt ennen niiden kiinnittymistä. Kuolleiden munien poistolla voidaan myös vähentää tehokkaasti itiöiden kiinnittymiseen sopivia alustoja ja sieni- rihman kasvulle sopivaa ravintoa ja sitä kautta uusien itiöiden muodostumista ja va- pautumista veteen. 1.2. Vaihtoehtoja malakiitille Homeenestoaineet voivat olla toimintamekanismiltaan systeemisiä, protektanttisia tai parantavia. Systeemiset osallistuvat eliöiden metaboliaan ja tekevät niistä vastustus- kykyisiä. Protektanttiset homeenestoaineet estävät infektointikykyisten homesieni- muotojen lisääntymisen tai tuhoavat niitä vedestä tai kalan tai mädin pinnalta. Paran- tavat aineet rajoittavat jo kasvavan sienirihman kasvua tai poistavat sen kalan tai mä- din pinnalta. Mädin hometorjuntaan käytettävät kemikaalit ovat etupäässä protektant- tisia ja vähäisemmässä määrin parantavia. Koska malakiittivihreän terveyshaitat ovat olleet esillä jo pitkään, on varsinkin lohen- viljelymaissa yritetty etsiä vaihtoehtoja, jotka eivät olisi terveydelle haitallisia, mutta olisivat tehokkaita homeentorjujina. Malakiittivihreän käyttö on nykyisin kiellettyä. Sen korvaajaksi on tutkittu satoja aineita. Hometorjuntakemikaalin olisi oltava paitsi tehokas homeitiöiden ja sienirihman tuhoamisessa, myös myrkytön kaloille ja turvalli- nen ihmisille, veteen liukeneva ja edullinen käyttää. Se pitää voida rekisteröidä lääk- keeksi, joten pitää osoittaa, että elintarvikkeeksi päätyvissä, aineella käsitellyissä ka- loissa ei ole haitallisten aineiden jäämiä. Tätä tarkoitusta varten vaikuttavan aineen täytyy olla luokiteltu sellaiseksi, että siitä ei jää jäämiä, tai sille pitää valmistajan mää- rittää jäämien enimmäismäärä –arvo (JEM, engl. MRL). JEM-arvon määrittäminen on valmistajalle varsin kallista puuhaa. Uusia hometorjuntakemikaaleja etsittäessä on tutkittu sekä niiden tehoa homesienen parveiluitiöihin ja kystiin että niiden tehoa ja käyttökelpoisuutta haudontakokeissa. Vain harvat aineet ovat olleet kummaltakin kannalta tyydyttäviä. Lupaavimmiksi ovat osoittautuneet vetyperoksidi, formaldehydi, suola, bronopoli ja glutaraldehydi (tauluk- ko 1). 16 Taulukko 1. Kemikaaleja, joilla on mädin vesihometta estäviä vaikutuksia. aine kalalaji viite amorolfine kirjolohi Marking et al. 1994 formaldehydi kirjolohi Marking et al. 1994 kirjolohi Howe et al. 1995 kirjolohi Schreier et al. 1996 kirjolohi Barnes et al. 2000 kuningaslohi Waterstrat & Marking 1995 glutaraldehydi kirjolohi Marking et al. 1994 neilikkaöljy (eugenol) kirjolohi Bouchard et al. 2001 Pyceze (bronopoli) kirjolohi Pottinger & Day 1999 lohi ja kirjolohi Grant et al. 2002 suola (NaCl) kirjolohi Marking et al. 1994 kirjolohi Schreier et al. 1996 kirjolohi Kitancharoen et al. 1997 kuningaslohi Waterstrat & Marking 1995 suola (NaCl + CaCl2) kuningaslohi Edgell et al. 1993 merivesi kyttyrälohi Taylor & Bailey 1979 pilkkupiikkimonni Phelps & Walser 1993 vetyperoksidi kirjolohi Marking et al. 1994 kirjolohi Schreier et al. 1996 kirjolohi Barnes et al. 1998 kirjolohi Gaikowski et al. 1998 kirjolohi Arndt et al. 2001 kuningaslohi Waterstrat & Marking 1995 hauki, valkosilmäkuha, kelta- ahven, valkoimukarppi, järvi- sampi, lapasampi, karppi, pilkku- piikkimonni Rach et al. 1998 pilkkupiikkimonni Howe et al. 1999 Vesihomeen torjumiseksi on tutkittu myös tuloveden sterilointikäsittelyä esimerkiksi otsonilla ja UV-valolla (Francis-Floyd 2000, Sako ja Sorimachi 1985, Forneris et al. 2003). Menetelmän tarkoituksena on poistaa haudontalaitteisiin tulevasta vedestä ho- meitiöt ja kystat. Tässä työssä selvitettiin malakiittivihreää korvaaviksi mädin haudonnan hoitokemi- kaaleiksi tarkoitettujen vetyperoksidin ja bronopolia vaikuttavana aineena sisältävän Pycezen käyttökelpoisuutta malakiittivihreään verrattuna sekä koehaudonnassa että oikeassa hautomomittakaavassa. Kokeessa tutkittiin myös näiden kemikaalien tehoa homeen leviämisen estämisessä. Pyceze sisältää bronopolia (= 2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol) 500 mg/ml. Se on hy- väksytty lohikalojen mädin hoitoon. Pyceze on tällä hetkellä lääkelaitoksen erityislu- van vaativa reseptivalmiste. 17 2. Aineisto ja menetelmät 2.1. Asettikokeet Asettikokeissa selvitettiin eri Pyceze-pitoisuuksilla tehtyjen kylvetysten vaikutusta haudontatulokseen sekä verrattiin aiemman vallitsevan käytännön mukaisilla ennalta- ehkäisevillä malakiittivihreäkylvetyksillä saatua haudontatulosta Pycezellä ja vetyper- oksidilla saatuun tulokseen lohen ja taimenen haudonnassa. 2.1.1. Pitoisuuskokeet Pitoisuuskokeet tehtiin kirjolohen mädillä. Jokaista kylvetyspitoisuutta varten oli hau- dontakaukalo, jossa oli lokeroasetteja eri emojen mätien erillään pitämistä varten. Kaukalot olivat rinnakkain hautomossa, ja haudonnassa käytettiin käsittelemätöntä järvivettä. Kuuden kirjolohiemon mäti hedelmöitettiin pareittain kuudella koiraalla. Joka naaraan hedelmöitettyä mätiä jaettiin kaikkiin kylvetyspitoisuuksiin viisi n. 110 mätimunan erää. Erät sijoitettiin satunnaisesti haudontakaukalossa olevien asettien numeroituihin lokeroihin. Pyceze-kylvetyksien pitoisuudet olivat 20, 50, 100 ja 150 mg/l bronopolia sekä kylvettämätön vertailu. Kylvetykset aloitettiin kahden viikon haudonnan jälkeen, kun mätierissä oli näkyvissä homeisia mätimunia. Mädit kylvetettiin kolme kertaa vii- kossa. Silmäpistevaiheessa ja poikasten kuoriutumisen jälkeen laskettiin elävien ja kuolleitten määrät. Haudontatulos laskettiin elävien osuutena kaikista mätimunista kylvetyspitoisuuksit- tain ja emoittain. Eri kylvetyspitoisuuksien haudontatuloksen eroja tutkittiin varianssi- analyysillä. 2.1.2. Ainekokeet Aiemmalla rutiinimenetelmällä, malakiittivihreäkylvetyksillä, saatua haudontatulosta verrattiin Pyceze- ja vetyperoksidikylvetyksillä saatuun tulokseen lohen ja taimenen mädin haudonnassa. Kokeet tehtiin asettihaudonnassa, jossa myös eri emojen mädit pidettiin erillään yksilöiden välisen vaihtelun selville saamiseksi. Taimenkokeessa hedelmöitettiin 11 järvitaimennaaraan (Rautalammin reitin kanta) mätiä yhtä monella koiraalla. Lohikokeessa käytettiin Nevan kannan kymmenen erilli- sen lohiparin mätiä. Kummankin lajin parien hedelmöitetty mäti jaettiin kolmeen kylvetyskäsittelyryh- mään, viisi rinnakkaista erää joka parin mätiä kaikkiin kylvetysryhmiin. Haudonta- kaukalo muodosti kylvetyskäsittelyryhmän. Yhteen mätierään laitettiin n. 110 mäti- munaa. Jako tehtiin punnitsemalla. Erät sijoitettiin satunnaisesti haudontakaukalossa oleville numeroiduille lokeroaseteille. Kaukalon vesitilavuus oli 150 l ja tulovirtaama 7,5 – 8,0 l/min. Kylvetykset aloitettiin noin kaksi viikkoa hedelmöityksestä, kun kuolleissa mädeissä oli näkyvää hometta. Pycezeä käytettiin kylvetyksessä bronopolipitoisuutena 100 mg/l, malakiittivihreää 4 mg/l ja vetyperoksidia 500 mg/l aktiivista ainetta. Kylvetyk- set tehtiin kolmesti viikossa. Kylvetyksen alussa tulovesihana suljettiin, kylve- tysainelaimennos levitettiin tasaisesti kaukaloon ja annettiin vaikuttaa puoli tuntia. Sen jälkeen tulovesihana avattiin, jolloin kylvetysaine huuhtoutui pois kaukalosta noin kahdenkymmenen minuutin kuluessa. 18 Silmäpistevaiheessa laskettiin kaikkien lokeroiden kuolleitten ja elävien mätimunien määrät. Kuoriutumisen jälkeen laskettiin kuoriutumattomat ja kuoriutumisvaiheessa kuolleet. Haudontatulos laskettiin silmäpistevaiheen elävien munien osuutena kaikista lokeron mätimunista ja kuoriutuneiden poikasten osuutena lokeron mätimunista sekä kylvetysaineittain että mätierittäin eri kylvetysaineilla. Eri kylvetysaineiden haudonta- tulosta verrattiin varianssianalyysillä. 2.2. Homeen leviämisen estyminen Tutkimuksessa mukana olevien eri kylvetyskemikaalien, malakiittivihreän, Pycezen ja vetyperoksidin, kykyä estää homeen leviämistä kuolleista mätimunista viereisiin elä- viin muniin tutkittiin lohen ja järvitaimenen mädin asettihaudonnoissa. Mittaukset teh- tiin ainekokeiden yhteydessä. Haudontajärjestely, koekalat, kylvetykset ja muut mitta- ukset on kuvattu kohdassa 2.1.2. Jokainen haudontalokero kuvattiin erikseen digitaalikameralla, lohen mädit kaksi ja järvitaimenen mädit kolme kertaa ennen silmäpistevaihetta. Digitaalikuvista laskettiin tietokoneen näytöltä kuolleen näköisten munien määrä ja homeen infektoimien kuol- leitten munien määrä. Kuolleitten lukumäärä ei tällä menetelmällä ole täsmälleen sa- ma kuin varsinaisessa kuolleitten munien laskennassa, koska vasta silmäpistevaiheessa tehtävän mädin puhdistuksen yhteydessä valkoiseksi muuttuvat kuolleet eivät tässä laskennassa näytä kuolleilta. Järvitaimenen mädit kuvattiin, kun haudonnan läm- pösumma oli 93, 192 ja 276 °C, lohen kuvauksissa lämpösummat olivat 86 ja 250 °C. Viimeisessä kuvauksessa mädit olivat saavuttaneet silmäpistevaiheen. Kuvista saadusta aineistosta laskettiin homeisten kuolleitten munien osuus kaikista lo- keron mätimunista ja homeisten mätimunien osuus kuolleista mätimunista eri kylve- tysaineilla. Eri kylvetysaineiden tehoa homeen leviämisen estämisessä tutkittiin va- rianssianalyysillä. Homehtumisen estymistä kokeen kylvetysaineilla tarkasteltiin myös eri emojen jälkeläisten välillä. 2.3. Haudonta tuotantomittakaavassa Tavanomaisessa mädintuotannossa kirjolohen, lohen ja taimenten mädit haudotaan jo- ko saaveissa tai aseteilla haudontakaukaloissa. Saavihaudonta on yleisesti käytössä oleva menetelmä suurille tuotantomäärille. Malakiittia korvaavien hometorjuntakemi- kaalien tuotantomittakaavan saavihaudontakoe tehtiin kirjolohen mädillä keväällä 2001 RKTL:n Kainuun yksikössä. Mädin saavihaudontakokeessa verrattiin Pycezen, peretikkahappoa ja vetyperoksidia sisältävän valmisteen (P3 Oxonia Aktiv, Henkel-Ecolab) ja vetyperoksidin homeentor- juntatehoa malakiittiin. Vertailuna oli myös kylvettämätön kontrollisaavi. P3 Oxonia Aktiv sisältää valmistajan ilmoituksen mukaan 15-30 % vetyperoksidia ja enintään 5 % peretikkahappoa. Pycezellä, vetyperoksidilla ja P3 Oxonia Aktivilla kylvetettiin kahta saavia kullakin, vertailuryhmissä oli yksi saavi. Kylvetysaineet eri mätisaaveille arvottiin. Kirjolohen mäti lypsettiin RKTL:n Tervon yksikön jalo-kannan (KL-JAL98) emoista 9.5.2001 ja hedelmöitettiin Tervossa. Eri hedelmöityserät yhdistettiin. Yhdistetty mäti jaettiin paisutuksen jälkeen desinfioituna kahdeksaan erään (7*12 l ja 1*11 l), jotka kuljetettiin styrox-mädinkuljetuslaatikoissa Kainuun laitokselle. Välittömästi kuljetuk- sen jälkeen mätierät laitettiin haudontasaaveihin. Haudontasaavien tilavuus oli 30 l. Vesi saaveihin johdettiin tulovesikaukalosta letkulla saavin alareunasta läpiviennillä, josta vesi kulki pohjaa kiertävän rei’itetyn letkun kautta tasaisesti koko saaviin. Mäti oli loivasti kartiomaisen sihdin päällä. Sihdin kes- 19 kellä oli putki, joka ulottui veden pinnan yläpuolelle. Vesi poistui saavin yläreunasta. Kylvetysainelaimennosta sisältävä astia oli tulovesikaukalon päällä, ja sieltä johti pie- nempi letku tulovesiletkuun. Kylvetysaine sekoitettiin 22 litraan vettä ja laimennos va- lui omalla paineellaan saaveihin tulevaan veteen. Saavien tulovirtaama oli 10 l/min. Sitä ei kylvetyksen ajaksi katkaistu. Kylvetyksessä saaveista poistuvan veden virtaama oli 8 l/min ja haudontasaavin viipymä 3,75 s. Kylvetysainelaimennosastian tyhjenemi- seen kului 37 minuuttia. Kylvetysaineiden tavoitepitoisuudet saatiin aiempien kokeiden ja sietotestien perus- teella ja ne olivat Pyceze: 0,2 ml/l, jolloin bronopolia 100 mg/l P3 Oxonia Aktiv: vetyperoksidin suhteen enintään 40 mg/l Vetyperoksidi: vetyperoksidia 500 mg/l Malakiittivihreä: laitoksen tavanomainen käytäntö, 4 mg/l. Kylvetysaineen haluttu pitoisuus haudontasaavissa säilyi n. 33 minuutin ajan. Kylvetykset aloitettiin toisena päivänä hedelmöityksen jälkeen, ja niitä tehtiin kolmes- ti viikossa. Kylvetysten yhteydessä seurattiin mädin homehtuneisuuden kehittymistä. Lisäksi kolme kertaa haudonnan aikana (97, 145 ja 207 päiväastetta) arvioitiin silmä- määräisesti homeisten mätimunien määrä. Silmäpistevaiheen mäti saavutti 2.6.2001 (186 päiväastetta). Silmäpistevaiheessa kaikki saavit valokuvattiin, huuhdeltiin kiinto- aineesta ja kuolleet mätimunat poistettiin tavalliseen tapaan. Kuoriutumisen ja kuol- leitten poistamisen välisenä aikana mätejä ei enää kylvetetty. Kuolleisuus laskettiin 300 ml:n otoksesta kaikista saaveista mittaamalla kuolleitten ja elävien munien tilavuus ja laskemalla kuolleitten %-osuus koko mätimäärästä. Koe lopetettiin 2 vrk kuoriutumisen alkamisen jälkeen. 2.4. Vetyperoksidin käyttö Pycezen lisänä Haudontakokeissa havaittiin, että vetyperoksidilla kylvetetyt asetit olivat puhtaampia kuin muilla aineilla kylvetetyt. Mahdollisuutta käyttää vetyperoksidikylvetystä Pyce- zellä kylvetettävän haudontakaukalon puhdistamiseen selvitettiin kokeessa, jossa me- ritaimenen (Ingarskilajoen kanta) mätiä oli haudottavana kahdessa Ewos-kaukalossa (vesitilavuus 94 l), kahdella asetilla kummassakin kaukalossa haudontakaudella 2001- 2002. Joka asetilla oli litra mätiä. Vesitys ja mädin hoito tehtiin laitoksen tuotantoru- tiinin mukaan. Pyceze-asetteja kylvetettiin kolmesti viikossa, yhdistelmäkäsittelyssä olevia asetteja kaksi kertaa viikossa Pycezellä ja kerran viikossa vetyperoksidilla. Pycezen pitoisuus kylvetyksessä oli 50 mg/l bronopolia ja vetyperoksidin 500 mg/l aktiivista ainetta. Kylvetys tehtiin siten, että veden tulo kaukaloon katkaistiin kylvetyksen ajaksi ja kyl- vetysaine jaettiin laimennoksena varovasti mätimunien päälle. Puolen tunnin kuluttua vesitys kytkettiin, ja kylvetysaineen annettiin huuhtoutua pois. Haudontatulos mitattiin laskemalla kummankin kaukalon mädistä elävät ja kuolleet silmäpistevaiheessa sekä kuoriutumisen alettua. Asettien homepaakut laskettiin, ja kiintoaineen kerääntymistä dokumentoitiin kuvaamalla haudonta-asetit kahteen ker- taan haudonnan aikana. 20 3. Tulokset 3.1. Pitoisuuskokeet Kuoriutumistulos (kuva 1) oli yhtä hyvä kaikilla bronopolipitoisuuksilla ja myös kau- kalossa, jota ei ollut kylvetetty (F3,115=1,840, p=0,144). Kaukalo, jota kylvetettiin lai- meimmalla Pyceze-liuoksella (bronopolia 20 mg/l), kärsi vesitysongelmista eikä ole mukana tulosten käsittelyssä. 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 bronopoli mg/l S % silmäpisteaste kuoriutuminen Kuva 1. Silmäpistevaiheessa elossa olevat ja kuoriutuneet (%) kaikista hau- dontaan laitetuista mätimunista eri bronopolipitoisuuksilla kylvetetyissä haudontakaukaloissa. Kaikilla Pyceze-pitoisuuksilla kylvetetyissä kaukaloissa eri emojen mätien kuoriutu- mistulokset poikkesivat erittäin merkitsevästi toisistaan (kuva 2). Homeenestokylve- tykset paransivat haudontatulosta ainoastaan sellaisissa mätierissä, jotka olivat elin- kelpoisuudeltaan heikkoja. Niissä oli alusta alkaen runsaasti kuolleita, jotka haudon- nan aikana homehtuivat, mutta kylvetykset estivät hometta leviämästä koko mätierään, jolloin osa mädistä pysyi hengissä ja kuoriutui. 21 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 bronopolipitoisuus mg/l S % emo 1 emo 2 emo 3 emo 4 emo 5 emo 6 Kuva 2. Eri emojen mädin kuoriutumistulos kun mätiä oli haudonnan aikana kylvetetty Pyceze-liuoksilla, joiden bronopolipitoisuus oli 0-150 mg/l. 3.2. Asettihaudonnassa Pyceze on malakiitin veroinen Asettihaudontakokeissa Pycezellä kylvetettyjen taimenen ja lohen mätien kuoriutu- mistulos oli yhtä hyvä kuin malakiittivihreällä kylvetettyjen (kuva 3). Vetyperoksidilla kuoriutumistulos oli vähän huonompi, mutta tilastollisesti merkitsevää eroa eri hoito- menetelmien välillä ei asettihaudonnan tuloksessa ollut (lohi F2,147=0,169, p=0,845, taimen F2,163=0,233, p=0,792). 22 Taimen 0 20 40 60 80 100 bronopoli vetyperoksidi malakiitti kylvetysaine S% Lohi 0 20 40 60 80 100 bronopoli vetyperoksidi malakiitti kylvetysaine S% Kuva 3. Taimenen ja lohen mädin haudontatulos (kuoriutumis-%) Pycezellä (bronopoli), vetyperoksidilla ja malakiittivihreällä käsitellyissä ryhmissä. Kuten eri Pyceze-pitoisuuksilla, myös eri kylvetysaineilla kuoriutumistulos eri emojen välillä vaihteli suuresti (kuva 4). Homeenestoaineesta riippumatta joidenkin mätierien kuoriutumistulos oli hyvin huono, toisten erittäin hyvä. 23 Taimen 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 emo S% bronopoli vetyperoksidi malakiitti Lohi 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 emo S% bronopoli vetyperoksidi malakiitti Kuva 4. Eri lohi- ja taimenemojen mädin haudontatulos (kuoriutumis-%) Py- cezellä (bronopoli), vetyperoksidilla ja malakiittivihreällä käsitellyissä ryh- missä. Veden mukana tuleva kiintoaine ja muut epäpuhtaudet laskeutuvat haudottavan mädin ja haudontalaitteiden pinnoille. Eri kemikaaleilla kylvetetyt asetit olivat kokeen lopus- sa hyvin erinäköisiä (kuva 5). Pycezellä käsitellyillä aseteilla oli paljon kiintoainetta ja epäpuhtauksia sekä asetin pohjalla että elävien ja kuolleitten mätimunien päällä. Ma- lakiittivihreällä kylvetyissä aseteissa oli epäpuhtauksia ja kiintoainetta vähemmän kuin Pyceze-aseteilla. Vetyperoksidilla kylvetettyjen asettien mätimunat olivat lähes puh- taita, koska vetyperoksidikäsittely näytti puhdistavan mädin pinnalta epäpuhtauksia. Tämä johtuu vetyperoksidin kemiallisista ominaisuuksista, se on voimakas hapetin. 24 Vety- peroksidi Malakiitti Pyceze Kuva 5. Pycezellä, vetyperoksidilla ja malakiitilla kylvetettyjä lohen mätieriä haudontakaukaloiden aseteilla. 25 3.2. Homeen leviämisen ehkäisy Järvitaimenen mätiä alettiin kylvettää 93 päiväastetta (12 vrk) ja lohen mätiä kaksi viikkoa (86 päiväastetta) hedelmöityksen jälkeen. Kuolleissa mätimunissa oli tässä vaiheessa nähtävissä hometta. Samalla tehtiin ensimmäiset homeisuusmittaukset hau- dontalokeroista. Kaikissa taimenkaukaloissa kymmenesosa munista oli homeessa, lo- hikaukaloissa 1,1 – 1,6 % (kuva 6). Silmäpistevaiheessa taimenen mädistä homeisia oli 25,3 – 36,4 % ja lohen mädistä 6,7 – 12,1 %. Vähiten homeisia mätimunia oli kummallakin lajilla malakiittivihreällä kylvetetyissä ja eniten vetyperoksidilla kylvete- tyissä ryhmissä. Järvitaimen 0 20 40 60 80 100 93 192 276 lämpösumma, päiväastetta ho m eh tu ne is uu s % malakiitti vetyperoksidi bronopoli Lohi 0 10 20 30 40 50 86 250 lämpösumma, päiväastetta ho m eh tu ne is uu s % malakiitti vetyperoksidi bronopoli Kuva 6. Järvitaimenen ja lohen mädin homehtuneisuuden kehitys mitattuna homeisten mätimunien osuutena kaikista haudottavana olevista munista eri homeenestokemikaaleilla kylvetetyissä ryhmissä. 26 Kylvetysten alkaessa homeisten mätimunien osuus kuolleen näköisistä munista oli taimenella noin 70 % ja lohella 20 – 30 %. Haudonnan edetessä homeisten osuus kuol- leista luonnollisesti kasvoi. Malakiittivihreä- ja bronopolikylvetykset (kuva 7) estivät homeiden kasvua kuolleiden munien pinnalla paremmin kuin vetyperoksidikylvetyk- set. Järvitaimen 0 20 40 60 80 100 120 93 192 276 lämpösumma, päiväastetta homeisten osuus kuolleista % malakiitti vetyperoksidi bronopoli Lohi 0 20 40 60 80 100 120 86 250 lämpösumma, päiväastetta homeisten osuus kuolleista % malakiitti vetyperoksidi bronopoli Kuva 7. Homeisten kuolleitten mätimunien osuus kaikista kuolleen näköisis- tä munista haudonnan aikana eri kylvetysaineilla. Asettihaudonnassa, jossa mätimunia ei ole monta kerrosta päällekkäin, haudontatulos ei välttämättä heikkene, vaikka kuolleet munat homehtuisivatkin. Haudontatulos vety- peroksidilla kylvetetyillä mädeillä oli samaa tasoa kuin muillakin kylvetysaineilla, vaikka vetyperoksidi esti homeiden leviämistä heikommin. Saavihaudonnassa ja ase- teilla, joissa on paljon mätiä, tilanne on toisenlainen (ks. kohta 3.3.). Koska käytännössä vain kuolleet mätimunat homehtuvat, samojen emojen mädeissä oli sekä runsaasti kuolleita että runsaasti homehtuneita. Muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta oli kaikkien emojen mädeissä malakiittivihreällä kylvetetyissä ryhmissä vä- hemmän homeisia munia kuin muilla kylvetysaineilla (kuva 8). Vetyperoksidin muita 27 kylvetysaineita heikompi teho homehtumisen estäjänä näkyi myös, kun tarkasteltiin eri emojen mätejä erikseen. Järvitaimen 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 emo % h om ei si a bronopoli vetyperoksidi malakiitti Lohi 0 20 40 60 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 emo % h om ei si a bronopoli vetyperoksidi malakiitti Kuva 8. Eri emojen homeisten mätimunien osuus (%) kaikista haudottavina olevista mätimunista Pycezellä (bronopoli), vetyperoksidilla ja malakiittivih- reällä kylvetetyissä kaukaloissa. 3.3. Saavihaudonnassa malakiitin korvaaminen on vaikeaa Saavihaudontakokeeseen otettua kirjolohen mätiä jouduttiin käsittelemään ja kuljetta- maan enemmän kuin yleensä. Tästä syystä koeryhmissä oli tavallista enemmän kuol- leita mätimunia jo kun mätierät laitettiin haudontasaaveihin. Kuolleita ei poistettu. Lämpötila oli haudonnan alkaessa 7,2 °C ja päättyessä 13,1 °C . 28 Lähes kaikki vetyperoksidilla ja P3 Oxonia Aktivilla kylvetettyjen haudontasaavien mäti kuoli ennen silmäpistevaihetta (kuva 9). Myös kontrollisaavissa, jota ei kylvetetty mitenkään, kaikki mäti kuoli. Malakiittivihreällä kylvetetyn mätierän kuolleisuus oli 41,7 %. Pycezellä kylvetetyissä saaveissa kuolleisuus (66,5 %) oli suurempi kuin ma- lakiittivihreällä, mutta kuitenkin selvästi pienempi kuin vetyperoksidilla ja P3 Oxonia Aktivilla. Pycezellä, vetyperoksidilla ja P3 Oxonia Aktivilla kylvetettyjen mätisaavien haudon- tatuloksen hajonta rinnakkaisten saavien välillä oli hyvin pieni. 0 20 40 60 80 100 P3 Oxonia Aktiv Pyceze Vetyperoksidi Malakiitti Vertailu k u o ll e is u u s % Kuva 9. Kuolleisuus silmäpistevaiheessa eri kylvetysaineilla saavihaudon- nassa. Ensimmäiset homeiset mätimunat havaittiin vertailuryhmässä 8 vrk (66 päiväastetta) haudonnan aloituksesta. Ensimmäisessä homeisuustarkastuksessa (97 päiväastetta) P3 Oxonia Aktiv- ja vetyperoksidiryhmissä oli hometta (taulukko 2). Toisessa homehtu- neisuustarkastuksessa (145 päiväastetta) vain malakiittiryhmä oli homeeton. Kolman- nessa tarkastuksessa ( 207 päiväastetta) myös malakiittiryhmässä oli muutamia homei- sia mätimunia. Vetyperoksidilla käsiteltyjen saavien mädissä oli jo kahden viikon haudonnan jälkeen paakkuuntuneita homeisia mätimunia. Lopussa koko saavin mäti oli samaa home- paakkua. Vetyperoksidikylvetys nosti paakkuuntuneet homeiset mätimunat pintaan kellumaan joka kylvetyskerralla. Kellumaan nousseet homepaakut ajautuivat myös helposti poistoletkuihin. Vertailusaavissa ei ollut homeisten munien paakkuuntumista. 29 Taulukko 2. Homehtuneisuuden kehittyminen haudonnan aikana eri kylvetysryhmissä. Merkkien selitys: - (+) + ++ ei hometta yksittäisissä mätimunissa hometta hometta runsaasti hometta (p) p pp homeiset mätimunat hieman paakkuina paakkuuntuneita runsaasti paakkuuntuneita Kylvetysaine 66 97 145 207 P3 Oxonia Aktiv - (+) ++ ++p Pyceze - - (+) +(p) vetyperoksidi - ++p ++pp ++pp malakiittivihreä - - - (+) vertailu (+) ++ ++ ++ Haudonnan päiväasteet Silmäpistevaiheessa tapahtuvaa kuolleiden laskentaa varten mädit piti puhdistaa. Kos- ka osa mätieristä oli hyvin likaisia, kaikki mätierät huuhdeltiin useaan kertaan. Mä- tierien likaantumisessa samoissa haudontaolosuhteissa havaittiin eri aineilla eroja: P3 OXONIA AKTIV: Pohjasihdin putken ympärillä oli kehä hyvälaatuista mätiä. Muu osa mädistä oli homeisena paakkuna, mutta mäti irtautui kuitenkin helposti huuhtelus- sa. Vesi oli pahan hajuista ja likaista, mutta siinä ei ollut kiintoainepartikkeleita. PYCEZE: Vain yksittäisiä muutaman mätijyvän hometakertumia. Vesi oli likaista, mustaa ja sisälsi erittäin paljon kiintoainetta. VETYPEROKSIDI: Koko mätierä lähes yhtenä paakkuna, joka ei irronnut edes huuh- telussa. Pumpulista homekerrosta yksittäisten mätimunien ympärillä. Vesi oli lähes puhdasta. MALAKIITTIVIHREÄ: Mäti lähes irrallista. Vesi mustaa ja hyvin likaista. KYLVETTÄMÄTÖN: Mäti irrallista. Hometta laattoina. Vesi oli likaista ja siinä oli kiintoainetta. Pinnalla kellui runsaasti rasvaa ja jonkun verran kirkkaanpunaista ”hilet- tä”. 3.4. Pyceze ja vetyperoksidi yhdessä? Kun meritaimenen mäti haudonnan aikana kylvetettiin kolmesti viikossa Pycezellä, oli kuoriutumistulos vähän heikompi kuin kaksi kertaa viikossa Pycezellä ja lisäksi kerran viikossa vetyperoksidilla kylvetetyssä kaukalossa (taulukko 3). Ero ei ole tilastollisesti merkitsevä. 30 Taulukko 3. Kuoriutumisvaiheessa mitattu kuolleisuus (%) Pycezellä ja Pyceze- vetyperoksidi yhdistelmällä kylvetetyissä kaukaloissa. kylvetysaine kuolleisuus % Pyceze 7,1 Pyceze + vetyperoksidi 6,1 Pycezen lisäksi myös vetyperoksidikylvetyksiä saaneiden mätien pinnalla oli kiinto- ainetta ja muita epäpuhtauksia selvästi vähemmän kuin vain Pycezellä kylvetettyjen mätien pinnalla. 3.5. Uusien homehtumisen torjunta-aineiden käyttö voi lisätä tuotannon kustannuksia Malakiittivihreän suosio on hyvän ja kaikissa olosuhteissa samanlaisen homeenestote- hon lisäksi perustunut myös sen halpaan hintaan, vaikka se käytössä onkin ollut varsin hankala tiedossa olleiden terveysriskien, värjäävyyden ja pölyämisen vuoksi. Malakiit- tivihreän korvaajat, sekä vetyperoksidi että Pyceze, ovat kalliimpia. Yhden neljä aset- tia sisältävän haudontakaukalon kylvettäminen läpivirtausmenetelmällä suosituspitoi- suuksilla ja –ajoilla maksaa vetyperoksidia käytettäessä (500 mg/l, 15 minuutin kylve- tys) noin kaksi kertaa ja Pycezeä käytettäessä (0,1 ml/l, 30 minuutin kylvetys) noin 20 kertaa malakiittivihreäkylvetyksen (3 mg/l, 30 minuutin kylvetys) verran. Malakiittivihreää käytettäessä on periaatteessa pitänyt järjestää kylvetys- ja huuhtelu- vesien johtaminen muualle kuin vesistöön, mutta vain harvassa hautomossa näin on menetelty, mikä on vielä pienentänyt kustannuksia. Vetyperoksidi hajoaa vesistössä hapeksi ja vedeksi, joten se voidaan johtaa suoraan vesistöön poistoveden mukana. Pycezen kalleuden vuoksi hautomoihin olisi rakennettava veden kierrätysmahdollisuus ainakin homeenestokylvetysten yhteydessä käytettäväksi. Malakiittivihreää voidaan korvata myös lisäämällä kuolleitten mätimunien nyppimistä pois. Nyppiminen on kallista käsityötä ja sopii vain asettihaudontaan ja jossain määrin suppiloihin. Haudonnan alkuvaiheessa nyppimisestä voi olla mädille haittaa, jos sitä tehdään taitamattomasti tai mätiä on aseteilla paljon. Hometorjunnan pettäminen tavallisesti lisää mädin kuolleisuutta. Suorat tappiot voivat olla merkittäviä, jos malakiittivihreän tilalla käytettävät hoitokemikaalit eivät ole yhtä tehokkaita kuin malakiittivihreä. Jos ne lisäksi ovat kalliita ja vielä työläitäkin, vaiku- tukset tuotantokustannuksiin ovat helposti liian suuret. Malakiittivihreän korvaaminen muilla hoitokemikaaleilla vähentää myrkyllisten kemi- kaalien päästöjä hautomoitten poistovesiin. Karsinogeenisen hoitokemikaalin poistu- minen on periaatteessa hyvä sekä kalanviljelyn työntekijöiden terveyden että kalatuot- teiden terveellisyyden, turvallisuuden ja julkisuuskuvan kannalta, edellyttäen, että aine voidaan korvata muilla hoitokemikaaleilla tai muilla vaihtoehtoisilla menetelmillä. 4. Tulosten tarkastelu Pottingerin ja Dayn (1999) mukaan Pycezellä kylvetettyjen mätierien homehtuneisuus oli merkitsevästi pienempi kuin kylvettämättömien. Tutkimuksessa ei mitattu haudon- tatulosta. Koska Pyceze on varsin uusi kalanviljelykemikaali, siitä ei ole toistaiseksi julkaistu vertailuja malakiittivihreään tai muihin hometorjuntakemikaaleihin. 31 Pycezen valmistaja suosittelee kylvetyspitoisuudeksi 50 mg/l bronopolia. Pottingerin ja Dayn (1999) kokeessa suuremmat bronopolipitoisuudet estivät homehtumista pa- remmin. Meidän kokeissamme asettihaudonnassa haudontatulos ei poikennut kylvet- tämättömissä kaukaloissa eri Pyceze-pitoisuuksilla kylvetettyjen kaukaloiden haudon- tatuloksesta. Osasyynä samanlaiseen tulokseen on pienehkö haudontatiheys, jolloin eri kylvetysainepitoisuuksien mahdolliset tehoerot eivät tulleet esille. Valmistajan edusta- jan mukaan (Grant et al. 2002) sopiva Pyceze-pitoisuus mädin kylvetyksiin tulee so- vittaa paikallisiin olosuhteisiin ja haudontajärjestelmään. Vetyperoksidi on monissa tutkimuksissa todettu hyväksi homeenestäjäksi haudonnas- sa (Marking et al. 1994, Rach et al. 1998, Schreier et al. 1996). Useimmilla lajeilla pi- toisuudet 500 - 1000 mg/l ovat olleet tehokkaimpia. Tässä työssä vetyperoksidi ei ollut malakiitin eikä myöskään bronopolin veroinen homeenestäjä. Saavihaudontakokeessa tuli erittäin selvästi esille, että malakiittivihreää ei voi kaiken- laisissa haudontajärjestelyissä korvata yhdellä kylvetyskemikaalilla ja yhdellä kylve- tystavalla. Tavallista vaikeammassa haudontatilanteessa, kun mädissä oli alunperinkin paljon kuolleisuutta, Pyceze-kylvetyksillä haudontatulos oli kuitenkin kohtuullinen, vaikkakin huonompi kuin malakiittivihreällä. Käytännön syistä on tulokset laskettu yhdestä otoksesta joka saavista, mutta koska rinnakkaisten saavien tulokset ovat hyvin samanlaisia, otosta voidaan pitää riittävänä. Asettihaudonnassa, jossa mätiä on suh- teellisen vähän, vetyperoksidi toimi kuitenkin paremmin kuin saavihaudonnassa, jo- hon se tämän kokeen perusteella oli sopimaton. Pycezellä kylvetetyt asetit ja saavit ovat haudonnan loppuvaiheessa huomattavan li- kaisia, ikään kuin Pyceze ”saostaisi” veden kiintoainetta. Tällä ilmiöllä saattaa olla haudontatulosta huonontava vaikutus lohen ja taimenen mädin haudonnassa, joka kes- tää pitkään. Pyceze-kylvetysten yleistyessä olisi selvitettävä, lisääkö lämpötilan nousu kiintoaineen kerääntymistä. Vetyperoksidikylvetykset hajottavat mätimunien pinnalle laskeutuvaa kiintoainetta. Vetyperoksidikylvetyksillä on siten haudontalaitteita ja hau- dottavaa mätiä puhdistava vaikutus. Kun Pyceze-kylvetysten lisänä käytettiin vetyper- oksidikylvetyksiä, haudonta-asetit olivat puhtaampia kuin pelkällä Pycezellä kylvetet- täessä. Vetyperoksidi nostaa homepaakkuja pintaan, mistä ne on helppo kerätä pois, mutta ilman huolellista kylvetysten valvontaa pintaan nousevat paakut voivat myös tukkia poistoletkut. Malakiittivihreän korvaaminen muilla kylvetysaineilla tulee joka tapauksessa lisää- mään haudonnan kustannuksia kalliimpien kylvetyskemikaalien, heikomman homeen- torjuntatehon, investointitarpeiden, lisääntyneen työn ja haudontatappioiden kautta. 5. Suositukset 1. Haudottavaksi otettavan mädin laadun parantamiseksi kannattaa tehdä kaikki mahdollinen. Kun kuolleisuus haudonnan aikana on pientä, myös homehtuminen on vähäistä ja tarvitaan vähemmän homeenestokylvetyksiä. 2. Pyceze on parempi homeenestossa kuin vetyperoksidi. 3. Vetyperoksidikylvetyksillä voidaan puhdistaa haudontalaitteita kiintoaineesta. 4. Malakiittivihreän korvaamiseksi on menettelytapoja kehitettävä hautomokohtai- sesti. Homehtumisesta johtuvaa kuolleisuutta voidaan hallita myös kehittämällä haudontajärjestelyitä ja –menetelmiä, esimerkiksi pienentämällä mätitiheyksiä haudontalaitteissa. 32 Kirjallisuus Arndt, R.E., Wagner, E.J. & Routledge, M.D. 2001. Reducing or withholding hydro- gen peroxide treatment during a critical stage of rainbow trout development: effects on eyed eggs, hatch, delformities and fungal control. North American Journal of Aqua- culture 63: 161-166. Barnes, M.E., Ewing, D.E., Cordes, R.J. & Young, G.L. 1998. Observations on hy- drogen peroxide control of Saprolegnia spp. during rainbow trout egg incubation. Progr. Fish-Culturist 60: 67-70. Barnes, M.E., Wintersteen, K., Sayler, W.A. & Cordes, R.J. 2000. Use of formalin during incubation of rainbow trout eyed eggs. North American Journal of Aquaculture 62: 54-59. Bouchard, L., Patel, J. & Lahey, L. 2001. The effect of clove oil on fungal infections of salmonid eggs. Bull. Aquacult. Assoc. Can. 2001 no.4, p. 110-112. Edgell, P., Lawseth, D., McLean, W.E. & Britton, E.W. 1993. The use of salt solu- tions to control fungus (Saprolegnia) infestations on salmon eggs. Progr. Fish- Culturist 55: 48-52. Forneris, G., Bellardi, S., Palmegiano, G.B., Saroglia, M., Sicuro, B., Gasco, L. & Zoccarato, I. 2003. The use of ozone in trout hatchery to reduce saprolegniasis inci- dence. Aquaculture 221: 157-166. Francis-Floyd, R. 2000. Disease history of cultured sturgeon in Florida 1990-1999. Proceedings of the Florida sturgeon culture risk assessment workshop. p. 33-38. Gaikowski, M.P., Rach, J.J., Olson, J.J., Ramsay, R.T. & Wolgamood, M. 1998. Tox- icity of hydrogen peroxide treatments to rainbow trout eggs. J. Aquat. Anim. Health 10: 241-251. Gajduesek, J. & Rubcov, V. 1985. Microstructure of moulted carp eggs infested with Saprolegnia. Folia Zool. 34: 349-355. Grant, A., Marshall, J. & Hunter, R. 2002. Pyceze, efficacy and use. In: Rahkonen, R. ja Koski, P.: Post malachite green: Alternative strategies for fungal infections and white spot disease. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 22: 152-157. Howe, G.E., Marking, L.L., Bills, T.D. & Schreier, T.M. 1995. Efficacy and toxicity of formalin solutions containing paraformaldehyde for fish and egg treatments. Progr. Fish-Culturist 57: 147-152. Howe, G.E., Gingerich, W.H., Dawson, V.K. & Olson, J.J. 1999. Efficacy of hydro- gen peroxide for treating saprolegniasis in channel catfish. J. Aquat. Anim. Health 11: 222-230. Kitancharoen, N. & Hatai, K. 1996. Experimental infection of Saprolegnia spp. in rainbow trout eggs. Fish Pathol. 31: 49-50. Kitancharoen, N., Ono, A., Yamamoto, A. & Hatai, K. 1997. The fungistatic effect of NaCl on rainbow trout egg saprolegniasis. Fish Pathology 32: 159-162. Marking, L.L., Rach, J.J. & Schreier, T.M. 1994. Evaluation of antifungal agents for fish culture. Progr. Fish-Culturist 56: 225-231. Phelps, R.P. & Walser, C.A. 1993. Effect of sea salt on the hatching of channel catfish eggs. J. Aquat. Anim. Health 5: 205-207. Pottinger, T.G. & Day, J.G. 1999. A Saprolegnia parasitica challenge system for rainbow trout: assessment fo Pyceze as an anti-fungal agent for both fish and ova. Dis. Aquat. Org. 36: 120-141. 33 Rach, J.J., Gaikowski, M.P., Howe, G.E. & Schreier, T.M. 1998. Evaluation of the toxicity and efficacy of hydrogen peroxide treatments on eggs of warm- and coolwater fishes. Aquaculture 165: 11-25. Sako, H. & Sorimachi, M. 1985. Susceptibility of fish pathogenic viruses, bacteria and fungus to ultraviolet irradiation and the disinfectant effect of U.V.-ozone water steri- lizer on the pathogens in water. Bill. Natl. Res. Inst, Aquacult. Japan 1985 no. 8: 51- 58. Schreier, T.M., Rach, J.J. & Howe, G.E. 1996. Efficacy of formalin, hydrogen perox- ide and sodium chloride on fungal-infected rainbow trout eggs. Aquaculture 140: 323- 331. Smith, S.N., Armstrong, R.A., Springate, J. & Barker, G. 1985. Infection and coloni- zation of trout eggs by Saprolegniaceae. Trans. Br. Mycol. Soc. 5: 719-723. Taylor, S.G. & Bailey, J.E. 1979. Saprolegnia: control of fungus on incubating eggs of pink salmon by treatment with seawater. Progr. Fish-Culturist 41: 181-183. Waterstrat, P.R. & Marking, L.L. 1995. Clinical evaluation of formalin, hydrogen per- oxide and sodium chloride for the treatment of Saprolegnia parasitica on fall chinook salmon eggs. Progr. Fish-Culturist 57: 287-291. Willoughby, L.G. & Roberts, R.J. 1992. Towards strategic use of fungicides against Saprolegnia parasitica in salmonid fish hatcheries. J. Fish Dis. 15: 1-13. Malakiittivihreän vaihtoehdot kalojen vesihomeen torjunta- kylvetyksissä Yrjö Lankinen ja Anu Halttunen Savon Taimen Oy, Äijäniementie 7, 77700 Rautalampi 37 1. Johdanto Vesihome on 1990-luvun puolivälistä lähtien aiheuttanut vakavia ongelmia taimenen, lohen ja siian viljelyssä (Leinonen et al. 1998, Leinonen 1999, Pylkkö ja Vennerström 2000). Vesihomeen aiheuttamia sairastumisia on tavattu kaksikesäisillä ja sitä van- hemmilla kaloilla. Sen torjuntaan on perinteisesti käytetty malakiittivihreäkylvetyksiä. Niiden avulla onkin voitu pitää kurissa kalojen hometartuntoja. Malakiittivihreän pois- tuminen käytöstä on siten aiheuttanut suuria ongelmia viljelytuotannolle, koska muita yhtä hyviä kylvetyskemikaaleja homeen torjuntaan ei ole ollut. Tutkimuksissa eri puo- lilla maailmaa on ollut useita hometorjuntaan mahdollisesti sopivia kemikaaleja. Näis- tä vain bronopoliyhdiste Pyceze on hyväksytty kalanviljelyssä käytettäväksi hometor- juntakemikaaliksi. Suomessa suuri osa istukkaista ja emokaloista tuotetaan maa-altaissa. Maa-altaat ovat suuria ja yleensä kattamattomia, niissä on pitkä veden viipymä ja pohjalla ja vedessä orgaanista ainesta, koska pohjamateriaali on vaikeasti puhdistettavaa. Kalojen terveys- tilanteeseen vaikuttavien ympäristötekijöiden hallinta maa-altaissa on siten paljon hankalampaa kuin keinoaltaissa. Maa-altaissa käytettävän kylvetysaineen tulee kemi- allisesti olla sellainen, että se tehoaa, vaikka vedessä olisi orgaanista ainetta. Maa- altaissa myrkyllisen ja tehokkaan pitoisuuden eron pitää olla selvä. Erityisesti kylve- tysaineen tulee olla taloudellinen käyttää. Savon Taimen Oy:n Tyyrinvirran laitoksella tehtiin vuonna 2000 vesihomeprojektin osana kylvetyskokeita malakiittivihreää korvaavan kylvetyskemikaalin löytämiseksi ison kalan tuotannossa. Kokeisiin käytettiin tavanomaisessa tuotannossa kasvatettuja, homeinfektioon sairastuneita kaloja. Näiden kokeiden tarkoituksena oli testata sekä malakiitin tilalle suositellun bronopoliyhdisteen (Pyceze) että muiden mahdollisten hometorjuntakemikaalien käyttökelpoisuutta tuotantomittakaavaan helposti sovelletta- vissa olevilla koejärjestelyillä. 2. Aineisto ja menetelmät Kokeet järjestettiin Savon Taimen Oy:n Tyyrinvirran laitoksella olevassa hallissa, jota käytetään pääasiassa emokalojen lypsyissä talviaikana. Hallissa on erillisvesitys, joten lypsykauden ulkopuolella sitä voidaan käyttää myös koetoimintaan. Kokeet järjestettiin kahdessa osassa. Pilottikokeessa (kylvetyskoe 1) haettiin kullekin testattavalle aineelle laitoksen veden laatuun sopivat pitoisuudet. Varsinaisessa ko- keessa (kylvetyskoe 2) testattiin kylvetyskemikaalien tehoa hometartunnan rajoittami- sessa. Koekaloina käytettiin 4-kesäisiä Rautalammin reitin järvitaimenia, joiden keskipaino oli 1,25 kg. Kalat oli kasvatettu laitoksella normaalituotannossa. Niitä oli ruokittu kas- vatuskaudella Aqualife 23-, Royal Plus-, Vital- ja Emovital-rehuilla. Koekaloille pyrittiin saamaan samanasteinen hometartunta mukaillulla kohabitaatio- menetelmällä, jossa koekalojen joukkoon otettiin myös homeisia kaloja. Homeinfekti- on oletettiin leviävän homeisista kaloista kaikkiin muihinkin saman ryhmän kaloihin. Tuotantoaltaassa oli todettu vesihomeisia kaloja 7.9.2000. Kaloja kylvetettiin mala- kiittivihreällä 8.9.2000 alkaen. Kylvetyskokeen 1 kalat olivat saaneet 3 ja kylvetysko- keen 2 kalat 8 hoitokertaa ennen kokeeseen siirtoa. Pilottikoetta varten lievästi homehtuneet taimenet siirrettiin tuotantoaltaasta kolmeen altaaseen 18.9.2000 (n. 34 kpl/allas, n. 5,8 kg/m3). Näkyvän homehtumisen vahvistut- tua kalat jaettiin koealtaisiin 25.9.2000 siten, että viljelytiheydeksi muodostui laitok- sella normaalisti käytetty 4-vuotiaan taimenen viljelytiheys. Altaan tilavuus oli 5,8 m3 38 ja virtaama 0,3 l/s. Viipymä vastasi kokeessa taimenten kasvatuksessa käytettyjen al- taiden viipymää eli 5-5,5 h. Koe lopetettiin 2.10.2000. Varsinaisessa kokeessa (kylvetyskoe 2; 6.10.-20.10.2000) kalat siirrettiin suoraan tuo- tantoaltaasta koealtaisiin. Tuotantoaltaassa oli näkyvissä jonkin verran homeisia kalo- ja. Infektiopaine oli altaassa kasvanut, ja tämän katsottiin yhdessä siirtokäsittelyn ai- heuttamien iholiman vaurioiden ja stressin kanssa olevan riittävä altistus vesihomeen tartuttamiseksi kaloihin. Kasvatustiheys varsinaisen kylvetyskokeen alussa oli 6,7 kg/m3, viipymä 5-5,5 h ja virtaama 0,3 l/s. Kokeissa käytetyt kylvetysaineet ja niiden pitoisuudet ovat taulukossa 1. Vetyperoksi- dia on pidetty yhtenä lupaavimmista malakiittivihreää korvaavista aineista (Fitzpatrick et al. 1995). Natriumperkarbonaatti on yhdiste, joka hajoaa luonnossa vetyperoksidik- si, soodaksi ja vedeksi. PerAqua on etikkahapon, peretikkahapon ja vetyperoksidin ta- sapainoliuos, jota käytetään yleisesti desinfiointiaineena. Etikkahappoa ja peretikka- happoa sisältävillä yhdisteillä on mainittu olevan tehoa mm. sienten ja homeiden itiöi- tä vastaan. Natriumperkarbonaattia ja PerAquaa on tutkittu erityisesti Tanskassa kalo- jen loisten torjunnassa (Slierendrecht, suullinen tiedonanto). Taulukko 1. Kokeessa käytetyt kylvetysaineet ja pitoisuudet. KYLVETYSKOE 1 KYLVETYSKOE 2 Aine altaita pitoisuus altaita pitoisuus Kontrolli 1 - 1 - Malakiittivihreä 2 0,6 g/m3 1 0,6 g/m3 Natriumperkarbonaatti 2 100 g/m3 1 150 g/m3 PerAqua 2 10 ml/m3 2 10 ml/m3 Vetyperoksidi (37%) 2 1. krt. 167 ml/m3 2 330 ml/m3 2. krt. 240 ml/m3 3. krt. 330 ml/m3 Pyceze - - 2 40 ml/m3 Veden lämpötilaa seurattiin päivittäisin mittauksin. Lämpötilatiedot koejaksojen aika- na on kuvattu kuolleisuuksia koskevissa kuvissa. Kalojen kylvetykset tapahtuivat normaalirutiinia noudattaen huuhtelukylpynä kolme kertaa viikossa (kylvetyskoe 1: 27.9., 29.9. ja 1.10.; kylvetyskoe 2: 6.10., 9.10., 11.10., 13.10. ja 16.10.). Kylvetyskokeessa 1 vetyperoksidin pitoisuutta nostettiin kolmella peräkkäisellä kylvetyskerralla (167, 240, 330 ml/m3), jotta löydettäisiin oikea pitoi- suustaso, jossa kalat selviäisivät hengissä, mutta aineella olisi mahdollisesti myös hy- vä hoitoteho laitoksen vedessä. Tavoitteena oli 100-125 ppm aktiivista ainetta. Kuolleet kalat poistettiin altaista kerran vuorokaudessa. Niiden sukupuoli määritettiin avaamalla vatsaontelo. PerAqualla kylvetetyistä kaloista tutkittiin EELAssa histologi- sesti kidusnäytteet mahdollisen akuutin kidusärsytyksen tai kidusvaurioiden selvittä- miseksi. 3. Tulokset 3.1. Kylvetyskoe 1 Pilottikokeen allaskohtaiset kumulatiiviset kuolleisuudet ovat taulukossa 2 ja kuvassa 1. Rinnakkaisten altaiden tuloksissa on hajontaa. Kuolleisuus kehittyi kaikissa ryhmis- 39 sä samalla tavalla: kaloja alkoi kuolla päivän kuluttua siirrosta varsinaisiin koealtai- siin, ja kuolleisuus lisääntyi nopeasti. Koe päätettiin keskeyttää 1.10., koska jo 40-50 % kaikkien ryhmien kaloista oli kuol- lut ja näytti siltä, että loputkin kalat tulevat menehtymään homeeseen muutamassa päivässä. Taulukko 2. Kumulatiivinen kuolleisuus pilottikokeessa eri altaissa. Aine Allas nro Kaloja kpl Kuolleita kaloja kpl Kuolleisuus % Ryhmän kuollei- suuden keskiar- vo (%) Kontrolli 1 30 13 43,3 43,3 Malakiittivihreä 6 30 16 53,3 Malakiittivihreä 9 30 10 33,3 43,3 Natriumperkarbonaatti 5 30 11 36,7 Natriumperkarbonaatti 7 30 17 56,7 46,7 PerAqua 2 30 21 70,0 PerAqua 3 30 11 36,7 53,3 Vetyperoksidi 4 30 15 50,0 Vetyperoksidi 8 30 9 30,0 40,0 Kokeen perusteella päätettiin varsinaiseen kylvetyskokeeseen otettavat aineet ja pitoi- suudet. Kaikissa ryhmissä minimikuolleisuus oli samalla tasolla, jolloin mikään aine ei erottunut toisiaan parempana, mutta toisaalta maksimikuolleisuuden perusteella ei voinut sulkeakaan mitään ainetta pois jatkokokeesta. Käytössä olleiden altaiden lukumäärä rajoitti testattavien aineiden toistojen lukumää- rää. Natriumperkarbonaatin pitoisuutta päätettiin lisätä kolmanneksella, jotta aktiivi- sen vetyperoksidin määrää saataisiin lisätyksi. Peroksidin määrää ei kuitenkaan mitat- tu. 0 10 20 30 40 50 60 25.9. 26.9. 27.9. 28.9. 29.9. 30.9. 1.10. 2.10. K uo lle is uu s % 0 2 4 6 8 10 12 °C Kontrolli Malakiitti Peroksidi NPK PerAqua lämpötila Kuva 1. Kylvetyskokeen 1 kumulatiivinen kuolleisuus (%) eri kylvetysaineilla käsitellyissä altaissa ja veden lämpötila. NPK = natriumperkarbonaatti, pe- roksidi = vetyperoksidi. 40 3.2. Kylvetyskoe 2 Kokeen tulokset on koottu taulukkoon 3 ja kuviin 2-5. Kontrolliryhmän kuolleisuus oli n. 20 % ja malakiittivihreäryhmän n. 6 %. Tässä kokeessa vain malakiitilla voitiin home pitää kurissa ja kuolleisuudet pieninä. Toiseksi parhaina erottuvat Pycezellä ja PerAqualla kylvetetyt ryhmät, joissa kuollei- suudet olivat 13-16 %:n välillä. Vetyperoksidilla käsitellyissä altaissa kuolleisuus oli n. 23 % ja natriumperkarbonaattia saaneessa altaassa suurin, n. 30 %. PerAqualla käsi- tellyssä ryhmässä toisen altaan kuolleisuus oli samaa tasoa kuin malakiittiryhmässä. Taulukko 3. Kuolleisuus (kpl ja %) varsinaisessa kylvetyskokeessa, ja homeisten kalo- jen lukumäärä kokeen lopussa. Aine Allas nro Kaloja kpl Kuolleita kpl Kuolleisuus % Keskiarvo % Homeisia jäljellä Kontrolli 6 34 7 20,6 20,6 3 Malakiittivihreä 9 35 2 5,7 5,7 2 Natriumperkarbonaatti 3 34 9 26,5 26,5 3 PerAqua 4 35 2 5,7 8 PerAqua 2 34 9 26,5 15,9 4 Pyceze 7 35 4 11,4 5 Pyceze 8 31 5 16,1 13,6 6 Vetyperoksidi 1 34 8 23,5 3 Vetyperoksidi 5 35 8 22,9 23,2 2 0 10 20 30 40 50 3.10. 7.10. 11.10. 15.10. 19.10. 23.10. K uo lle is uu s % 0 2 4 6 8 10 12 °C Kontrolli Malakiitti NPK lämpötila Kuva 2. Kumulatiivinen kuolleisuus (%) malakiitti-, natriumperkarbonaatti- (NPK) ja kontrolliryhmissä ja veden lämpötila. 41 0 10 20 30 40 50 3.10. 7.10. 11.10. 15.10. 19.10. 23.10. K uo lle is uu s % 0 2 4 6 8 10 12 °C Kontrolli PerAqua1 PerAqua2 lämpötila Kuva 3. Kumulatiivinen kuolleisuus (%) PerAqua- ja kontrolliryhmissä ja ve- den lämpötila. 0 5 10 15 20 25 3.10. 7.10. 11.10. 15.10. 19.10. 23.10. K uo lle is uu s % 0 2 4 6 8 10 12 °C kontrolli peroksidi1 peroksidi2 lämpötila Kuva 4. Kumulatiivinen kuolleisuus (%) vetyperoksidi- ja kontrolliryhmissä ja veden lämpötila. 42 0 5 10 15 20 25 3.10. 7.10. 11.10. 15.10. 19.10. 23.10. K uo lle is uu s % 0 2 4 6 8 10 12 °C kontrolli Pyceze1 Pyceze2 lämpötila Kuva 5. Kumulatiivinen kuolleisuus (%) Pyceze– ja kontrolliryhmissä sekä veden lämpötila. Keskimääräiset kumulatiiviset kuolleisuudet eri kylvetysaineilla on esitetty kuvassa 6. 0 5 10 15 20 25 30 3.10. 5.10. 7.10. 9.10. 11.10. 13.10. 15.10. 17.10. 19.10. 21.10. 23.10. K uo lle is uu s % 0 2 4 6 8 10 12 °C kontrolli PerAqua malakiitti peroksidi NPK Pyceze lämpötila Kuva 6. Yhteenveto eri kylvetysaineiden kumulatiivisista keskimääräisistä kuolleisuuksista (%). Kylvetyspäivät on merkitty tähdellä. Mikäli tarkastelussa otetaan huomioon myös koetta lopetettaessa altaissa havaitut ho- meiset kalat ja oletetaan, että myös ne kuolevat, muuttuu tilanne jonkin verran eri ai- neiden välillä (kuva 7). Testattavina olleiden kylvetysaineiden estimoiduissa kuollei- suuksissa ei tällöin ollut suuria eroja kontrolliryhmän kuolleisuuteen verrattuna. Tes- tattavilla aineilla ei ollut toisiinsa verrattuna eroja hoitotehossa. 43 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 kontrolli malakiitti NPK PerAqua peroksidi Pyceze ku ol le is uu s % Kuva 7. Kylvetyskokeen 2 estimoitu kokonaiskuolleisuus (%), kun ko- keen aikana havaitut homeiset yksilöt lisättiin kokeen aikana kuolleiden määriin. Kuvassa on esitetty testattavien aineiden minimi, keskiarvo ja maksimikuolleisuudet. Kuolleista kaloista sukukypsiä koiraita oli n. 53 %, sukukypsiä naaraita 34 % ja mar- toja vain 4 % (taulukko 4). Yleensä marrot eivät homehdu, ellei infektiopaine ole eri- tyisen suuri. Kaikista kuolleista ei sukupuolta saatu tietokatkoksen takia määritettyä. Taulukko 4. Kokonaiskuolleisuus ja kuolleiden kalojen sukupuolijakauma (%) eri altaissa. Aine Kokonais- kuolleisuus Kuolleiden kalojen sukupuolijakauma (%) kpl % Naaras Koiras Marto Ei määritetty Kontrolli 7 20,6 0 100 0 0 Malakiittivihreä 2 5,7 100 0 0 0 Natriumperkarbonaatti 10 29,4 30 40 0 30 Vetyperoksidi (37%) 8 23,5 50 50 0 0 Vetyperoksidi (37%) 8 22,9 25 50 25 0 PerAqua 2 5,7 0 100 0 0 PerAqua 9 26,5 56 22 0 22 Pyceze 4 11,4 25 75 0 0 Pyceze 5 16,1 40 60 0 0 Kuolleet yhteensä 55 17,9 35 53 4 9 Kylvetyksissä käytetyllä PerAqua-pitoisuudella ei havaittu olevan vaikutusta kidusten rakenteeseen. 44 4. Tulosten tarkastelu 4.1. Kylvetyskoe 1 Kokeessa yritettiin jäljitellä olosuhteita, jotka esiintyvät maa-allastuotannossa (tuotan- totiheys, pitkähkö viipymä, kylvetystapa). Tavoitteena oli löytää ne kylvetysainepitoi- suudet, joilla kaloja voitaisiin turvallisesti kylvettää. Homeinfektio ehti koekaloissa kuitenkin päästä viikonlopun aikana liian voimakkaaksi ennen hoitokylvetysten aloittamista, josta syystä kuolleisuudet kohosivat kaikissa al- taissa. Koe päätettiin keskeyttää kolmen hoitokerran jälkeen, koska tavoitteet pitoi- suuksien löytymisen suhteen saavutettiin ja toisaalta nähtiin, että uusi koe pitää aloit- taa mahdollisimman nopeasti. Käytettyjen pitoisuuksien ei tulkittu aiheuttaneen on- gelmia kaloille. Koe kuitenkin osoitti, että kun vesihome pääsee ”liian pitkälle”, siihen ei tehoa mala- kiittikaan. Hajonta altaiden välillä oli suurta kaikilla aineilla. Todennäköisesti kumula- tiiviset kuolleisuudet olisivat olleet kaikissa ryhmissä vielä suuremmat, mikäli koetta olisi jatkettu. 4.2. Kylvetyskoe 2 Malakiittivihreällä kylvetetystä altaasta kaloja kuoli selvästi vähemmän kuin muista. Kontrolliryhmän kuolleisuus oli huomattavan suuri, noin 21 %. Vetyperoksidilla kylvetetyissä altaissa kuolleisuus kohosi aikaisemmin kuin muissa ryhmissä ja kuolleita havaittiin aina kylvetyksen jälkeisenä päivänä. Todennäköisesti pitoisuus (aktiivista ainetta 122 ml/m3) oli liian suuri, ja tästä syystä kokonaiskuollei- suus nousi korkeaksi molemmissa altaissa. Rinnakkaisaltaiden välillä ei ollut merkit- tävää hajontaa. Myös natriumperkarbonaattiryhmässä kuolleisuus oli huomattava. Käytetyn natrium- perkarbonaattivalmisteen vetyperoksidipitoisuus on n. 27 % (Hjelme 2001). Aktiivisen vetyperoksidin määrä koealtaissa oli siis n. 1/3 vetyperoksidikylvetykseen verrattuna, joten sen ei pitäisi olla kaloille myrkyllinen. Natriumperkarbonaatti ei tehonnut ho- meeseen. Pycezellä oli kohtuullinen teho hometta vastaan. Ero PerAquaan ei ollut kuitenkaan suuri (kuva 6). Molemmissa kokeissa toisessa PerAqualla kylvetetyssä rinnakkaisal- taassa kuolleisuus oli pienempi kuin toisessa. Tähän hajontaan voi olla syynä se, että koekalojen infektioaste ei ollut tasainen kaikissa ryhmissä ja altaissa, tai se, että PerA- qua tehoaa jossain määrin vesihomeitiöihin. Infektioasteen tasaisuuteen voi puolestaan vaikuttaa käytetty infektointimenetelmä tai kalojen mahdollinen sukukypsyys. Kokeen loppuvaiheessa laitoksessa alkoivat emotaimenten lypsyt, joten koekaloissakin oli jo kutuvalmiita yksilöitä. Satunnaisotannasta johtuen koekalojen sukupuolijakaumaa ei tiedetä, mutta on toden- näköistä, että suurin osa koekaloista oli sukukypsiä, ja erittäin todennäköisesti kaikki koiraat olivat sukukypsiä. Kokeen kannalta olisi ollut hyvä, että homeinfektio olisi kaikissa ryhmissä ja altaissa ollut yhtä voimakas, mutta toisaalta tuotanto- olosuhteissakaan infektio ei ole koskaan tasainen. Homeen torjunta on käytännössä aloitettava silloin, kun ensimmäiset merkit homeesta havaitaan ja ajankohta ja lämpö- tila on homeen kannalta optimaalinen (n. 4-12 oC). Altistusmenetelmän ja koejärjeste- lyjen kehittäminen varmistaisi tuloksia tältä osin. 45 Koesarja tehtiin hyvissä olosuhteissa keinoaltaissa, joissa orgaanisen aineen määrä ei haitannut kylvetyksiä. Jos voimakkaasti hapettavilla aineilla lähdetään kylvettämään maa-altaita, joissa orgaanisen aineen määrä on huomattavasti suurempi, edellä maini- tut ainemäärät voivat osoittautua riittämättömiksi, sillä vain osa annostellusta aineesta kuluu tällöin ”kalojen hoitoon”. Kokeista maa-altaissa tapahtuviin todellisiin hoito- kylvetyksiin on vielä matkaa. 5. Kylvetyskustannukset eri aineilla Kalojen erilaiset hoitotoimet ja niihin tarvittavat aineet muodostavat osan viljelykus- tannuksista. Nykyisessä kustannus- ja markkinahintatilanteessa hoitokemikaalien tulee olla tehokkaita ja halpoja. Taulukossa 5 ja kuvassa 8 on havainnollistettu eri aineiden tehokkaiden pitoisuuksien mahdollisia kertakylvetyskustannuksia. Tarvittavien kylve- tyskertojen määrä vaihtelee ongelman laajuudesta ja laitoksesta riippuen. Niiden mää- rä voi kohota useisiin kymmeniin, jos homeinfektio on voimakas. Homeinfektion ris- kiä lisäävät mm. kalojen ikä, smolttiuminen, sukukypsyminen, veden laatu ja lämpöti- la sekä homekanta. Taulukko 5. Vesihomeen kylvetyksissä käytettyjen aineiden pitoisuudet ja yksikköhinnat vuoden 2000 hintatasossa. Aine Pitoisuus/m3 Hinta-arvio Malakiittivihreä 0,3 g 152,00 mk/kg Natriumperkarbonaatti 100 g 10,00 mk/kg PerAqua 10 ml 36,00 mk/l Pyceze 40 ml 270,00 mk/l Vetyperoksidi (50%) 200 ml 5,00 mk/l Formaliini 100 ml 6,50 mk/l Kylvetyskustannukset tässä työssä tarkastelluilla kemikaaleilla vaihtelevat erittäin pal- jon. Seuraavissa kertakylvetysten hintalaskelmissa on käytetty vuoden 2001 hintoja, joilla Pycezen käyttö tulee maksamaan yli 150 kertaa malakiittivihreän käyttökustan- nuksen (kuva 8). Vuonna 2002 toteutunut Pycezen hinnan nousu noin kaksinkertaisek- si nostaa kylvetyskustannuksen yli 300-kertaiseksi malakiittiin verrattuna. Hinta tekee aineesta taloudellisesti mahdottoman käyttää elävän kalan hoitokylvetyksissä. Myös natriumperkarbonaatin kertakylvetyskustannukset muodostuvat liian suuriksi taloudel- lista käyttöä ajatellen. Vetyperoksidikylvetys maksaa 500 m3:n altaassa n. 750 mk/kerta. 46 60 150 500 2500 5000 allastyyppi m3 0 100 200 300 400 500 mk/kerta Malakiittivihreä 60 150 500 2500 5000 allastyyppi m3 0 10000 20000 30000 40000 50000 mk/kerta Pyceze 40 ml/m3 60 150 500 2500 5000 allastyyppi m3 0 1000 2000 3000 4000 5000 mk/kerta Natriumperkarbonaatti 100g/m3 60 150 500 2500 5000 allastyyppi m3 0 500 1000 1500 2000 mk/kerta PerAqua 10 ml/m3 Kuva 8. Kertakylvetyskustannus erikokoisissa maalammikoissa. Kylvetyskustannusten nousu malakiitille vaihtoehtoisilla kemikaaleilla on merkittävän suuri. Suurten kustannusten ja huonomman hoitotehon vaikutukset ovat erittäin mer- kittäviä sekä viljelyelinkeinon tuotantorakenteeseen että kalavesien hoitoon tarkoitet- tujen kalojen istutuksiin. Kirjallisuus Fitzpatrick, M.S., Schreck, C.B. & Chitwood, R.B. 1995. Evaluation of three candi- date fungicides for treatment of adult spring chinook salmon. The Progressive Fish- Culturist 57:153-155. Hjelme, U. 2001. HCI-Nordic. Kirjallinen tiedonanto. Leinonen, T. 1999. Hoitotoimien ja allashydrauliikan vaikutuksista vesihomeen esiin- tymiseen Laukaan ja Kainuun kalanviljelylaitoksissa. Toimittanut Leinonen, T. Kala- ja riistaraportteja nro 144. Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos. 19 s. 47 Leinonen, T., Korhonen, P. & Säkki, S. 1998. Altaiden kattamisen ja vedenlaadun vaikutus vesihomeen esiintymiseen ja kalojen kuolleisuuteen. Kalatutkimuksia – Fis- kundersökningar 142. Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos. 26 s. Pylkkö, P. & Vennerström, P. 2000. Vesihomeitiöiden lukumäärät ja vesihometartun- nat Laukaan, Kainuun ja Taivalkosken kalanviljelylaitoksissa. Kala- ja riistaraportteja 194. Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos. 50 s. Vesihomeen torjunta ravun mädin haudonnassa Anna Alaranta1, Jaakko Haverinen1 ja Päivi Eskelinen2 1) Kuopion yliopisto, Soveltavan biotekniikan instituutti, PL 1627, 70211 Kuopio 2) Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos, Laukaan kalantutkimus ja vesiviljely, Vilp- pulantie 415, 41360 Valkola 51 1. Johdanto Vesihomesienen ohuita vaaleita sienirihmoja esiintyy ravuissa yleensä kuoren vau- riokohdissa. Ravunviljelyssä vesihome voi tuhota myös munia ja pikkupoikasia. Se in- fektoi ensisijaisesti kuolleita munia, ja ellei niitä poisteta, home leviää myös eläviin muniin. Voimakas tartunta voi levitessään tappaa emoravunkin. Ravun tuotantokierron tehostamiseksi voidaan käyttää aikaistettua haudontaa, jossa veden lämpötilaa on nostettu luonnonmukaisesta lämpötilasta. Aikaistetulla haudon- nalla voidaan munien kehitystä lyhentää 9 kuukaudesta jopa 4 kuukauteen, mikä mah- dollistaa ravun tuotannon ympäri vuoden (Cukerzis et al. 1979). Munat voidaan hau- toa joko emon pyrstön alla tai erillään emoista irrotettuina erillisellä alustalla. Tavalli- sesti aikaistetussa haudonnassa munat haudotaan erillään tätä varten kehitetyssä hau- dontalaitteessa. Haudontalaite pitää munat jatkuvasti liikkeessä. Koska vedessä on ai- na vesihomeitiöitä, kuolleet munat haudontalaitteessa voivat homehtua. Homeinfekti- oita voidaan estää poistamalla haudonnasta huonot mätierät, jossain määrin tehostetul- la hygienialla ja kylvettämällä munia homeentorjuntaan sopivilla kemikaaleilla (Jär- venpää et al. 1996). Ravun, kuten kalojenkin, mädin haudonnan vesihometorjuntaan on perinteisesti käy- tetty malakiittivihreää. Kun malakiittia ei enää ole käytettävissä, on löydettävä muita kylvetysaineita ravun munille. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Pycezen, Eugenolin ja P3-Oxonia Akti- vin tehoa vesihomeen torjunnassa haudottaessa täpläravun (Pacifastacus leniusculus) munia ja verrata torjuntatehoa malakiittivihreällä saatavaan haudontatulokseen. 2. Aineisto ja menetelmät 2.1. Tutkitut uudet kylvetysaineet Pyceze on bronopolia (2-bromo-2-nitropropane-1,3-diol) vaikuttavana aineena sisältä- vä yhdiste, joka on hyväksytty malakiittivihreää korvaavaksi aineeksi kalojen mädin haudonnassa. Pyceze on todettu sopivaksi lohikalojen mädin hometorjuntaan (Pottin- ger ja Day 1999). Pycezestä oli tehty esikoe (Alaranta ja Haverinen 2001), jossa todet- tiin kirjolohen mädille käytettyjen kylvetyspitoisuuksien olevan sopivia myös ravun (Astacus astacus) mädille. Pyceze tehosi vesihomeeseen, mutta malakiittivihreän käyt- töön verrattuna ravun munat kuolivat herkemmin bakteeri-infektioihin. Pycezeä käy- tettiin pitoisuuksina 100-200 mg/l bronopolia. Eugenolin eli neilikkaöljyn (4-allyl-2-methoxyphenol) on todettu ehkäisevän ja tu- hoavan vesihomesieniä. Se on lohikaloille myrkyllistä mutta mahdollista käytettäväksi särkikaloilla (Hussein et al. 2000). Eugenol liukenee huonosti veteen, liuottimena käy- tettiin 10 %:sta dimetyylisulfoksidia (DMSO). Neilikkaöljyn liuottimena voi käyttää myös alkoholia ja sitä on käytetty myös kalojen nukuttamiseen. P3-Oxonia Aktiv on peretikkahappoa sisältävä vetyperoksidivalmiste, jota käytetään kalanviljelyssä pintojen ja välineiden desinfiointiaineena. Sitä on kokeiltu kirjolohen mädin hometorjuntaan (Eskelinen et al. 2003) ja vastaavaa toista valmistetta kalojen vesihometartunnan hoitoon (Lankinen ja Halttunen 2003). Vetyperoksidin soveltu- vuudesta kalojen mädin homeen estoon on lukuisia tutkimuksia. 52 2.2. Kylvetyskokeet Kylvetyskokeeseen otettiin 18 täplärapunaaraan mäti. Jokaisella emoravuista oli run- saasti hyvälaatuista, silmämääräisesti tervettä mätiä, joka irrotettiin emoista pinseteil- lä, yhdistettiin ja jaettiin 55 kuppiin haudontalaitteessa siten, että jokaiseen kuppiin tu- li 50 munaa. Kylvetyskokeet aloitettiin 20.4.2001 ja lopetettiin 28.5.2001, kun mädistä kuoriutuneet ravunpoikaset olivat kehittyneet toisen asteen poikasiksi. Haudontakupit jaettiin kylvetysryhmiin arpomalla. Kupit sijoitettiin numerojärjestyk- sessä haudontalaitteen tuloveden puoleiseen päähän. Haudontavetenä käytettiin syvän- teestä johdettua vähähumuksisista järvivettä. Veden lämpötila oli kokeen alussa noin 6 °C. Lämpötila nostettiin kokeen alettua niin, että se oli 10 vuorokauden kuluessa noin 14 °C, jossa se pidettiin kokeen loppuun eli poikasten kuoriutumiseen saakka. Kylvetyskokeessa oli 11 koeryhmää. Pycezeä, Eugenolia ja P3 Oxonia Aktivia käytet- tiin kolmena eri pitoisuutena, malakiittivihreää yhtenä pitoisuutena ja kontrollina oli kylvettämätön ryhmä. Jokaisessa ryhmässä oli viisi rinnakkaista haudontakuppia. Pi- toisuudet ja kylvetysajat on esitetty taulukossa 1. Kaikkien koeryhmien mätierät huuhdottiin kylvetyksen jälkeen puolen minuutin ajan puhtaalla vedellä. Taulukko 1. Kylvetysaineet, pitoisuudet ja kylvetysten kesto. Kylvetysaine Kesto Pitoisuus 1 Pitoisuus 2 Pitoisuus 3 Pyceze 30 min 100 mg/l 150 mg/l 200 mg/l Eugenol 10 min 500 µg/l 2000 µg/l 3000 µg/l P3 Oxonia Aktiv 30 min 20 mg/l 75 mg/l 150 mg/l Malakiitti 20 s 5 ppm Kontrolli 30 min Kylvetykset suoritettiin nostamalla haudontakupit haudontalaitteesta erilliseen hau- dontaveden lämpöistä kylvetysliuosta sisältävään astiaan. Kuppeja heiluteltiin koko kylvetyksen ajan. Käsittelyn jälkeen munat huuhdeltiin haudonnassa käytetyllä vedel- lä. Koska haudontalaitteessa oli meneillään myös malakiitilla tehtävä rutiinikylvetys, koeryhmien kupit nostettiin rutiinikylvetyksen ajaksi muovilaatikkoon, johon niille oli tehty pidikkeet. Laatikon läpi ohjattiin virtaamaan haudontalaitteen tulovettä. Kylve- tykset suoritettiin kokeen alussa kaksi kertaa viikossa. Kahden viikon kuluttua kokeen aloituksesta munat kylvetettiin kerran viikossa. Kylvetyksiä jatkettiin, kunnes munat olivat kuoriutuneet. Munat tarkastettiin kylvetyksien yhteydessä ja homehtuneet munat laskettiin ja otet- tiin talteen. Homehtuneet munat säilöttiin eppendorf–putkiin 75 %:seen alkoholiin. Mikroskopoimalla varmistettiin, että munien pinnalla kasvoi vesihometta. Näiden tu- losten perusteella määritettiin homehtumisprosentti. Kokeen lopetuksessa myös kuol- leet munat laskettiin. Kuolleiksi muniksi määritettiin munat, jotka olivat muuttuneet vaaleiksi, mutta eivät olleet homerihmaston peitossa. Kuoriutumisprosentti laskettiin elävistä toisen asteen poikasista (100 x (kuoriutuneet 2. asteen poikaset/kaikki kokee- seen otetut munat). Koska haudontakupissa oli munia monesta emosta, poikasten ke- hittyminen yhden kupin sisällä tapahtui eri aikaan, joten oli mahdotonta laskea kuoriu- tumisprosentti 1. asteen poikasista. Lisäksi laskettiin kuolleitten poikasten määrä, kuo- riutumattomien munien määrä kokeen lopussa ja munien hävikki kokeen aikana. Hä- vikillä tarkoitetaan kokeen aikana haudontaveteen hajonneita munia. 53 Kylvetysaineiden eri pitoisuuksien, malakiittivihreäkäsittelyn ja kontrolliryhmän hau- dontatulosten eroja testattiin kuoriutumistuloksen, kuoriutumattomien munien osuu- den, munien ja poikasten kuolleisuuden, homehtuneiden munien ja hävikin arcsin- muunnettujen prosenttiarvojen varianssianalyysillä. Kylvetysaineita verrattiin toisiinsa käyttämällä kaikkien pitoisuuksien tuloksia. Varianssianalyysin tulosta tarkasteltiin parittaisella Bonferroni-testillä. 3. Tulokset 3.1. Eri kylvetysaineiden pitoisuudet Pyceze-kylvetyksissä eri pitoisuuksien, malakiitilla kylvetettyjen ja kontrolliryhmän välillä ei ollut tilastollista eroa kuoriutumisprosentissa, kuolleiden munien tai poikas- ten määrässä, homehtumisprosentissa, kuoriutumattomien munien määrässä tai muni- en hävikissä (taulukko 2). Taulukko 2. Haudontatulos Pycezellä kylvetetyissä ryhmissä, suluissa keskihajonta. Pyceze-pitoisuus mg/l 100 150 200 Kuoriutuminen % 82,0 (3,16) 78,0 (5,48) 81,0 (6,22) Kuolleet munat % 3,2 (1,79) 5,6 (2,61) 3,5 (3,00) Kuolleet poikaset % 2,8 (4,38) 1,6 (1,67) 1,5 (3,00) Homehtuneet munat % 1,2 (1,10) 1,6 (0,89) 1,5 (1,94) Kuoriutumattomat munat % 7,6 (2,61) 7,6 (3,25) 8,0 (2,83) Hävikki % 3,2 (4,15) 5,6 (1,79) 4,5 (5,26) Eugenolin eri pitoisuuksilla kylvetetyistä munista ei kuoriutunut yhtään poikasta. Kai- kissa pitoisuuksissa yli 80 % munista kuoli ja hyvin suuri osa hajosi haudontaveteen (taulukko 3). Malakiittikylvetyksiin ja kontrolliin verrattuna erot kuoriutumistulokses- sa, kuolleitten munien määrässä ja hävikissä ovat luonnollisesti merkitseviä. Taulukko 3. Haudontatulos Eugenolilla kylvetetyissä ryhmissä, suluissa keskihajonta. Eugenol-pitoisuus µg/l 500 2000 3000 Kuoriutuminen % 0 0 0 Kuolleet munat % 34,0 (9,70) 28,0 (17,38) 26,8 (5,93) Kuolleet poikaset % - - - Homehtuneet munat % 1,6 (0,89) 1,2 (1,79) 2,0 (3,46) Kuoriutumattomat munat % 10,0 (3,16) 12,0 (5,10) 13,6 (6,84) Hävikki % 54,4 (9,94) 58,8 (19,98) 57,6 (11,08) 54 P3 Oxonia Aktivilla kylvetyksissä eri pitoisuuksien, malakiittivihreällä kylvetettyjen ja kontrolliryhmien välillä ei ollut tilastollista eroa kuoriutumisprosentissa, kuolleiden munien tai poikasten määrässä, homehtumisprosentissa, kuoriutumattomien munien määrässä tai munien hävikissä (taulukko 4). Taulukko 4. Haudontatulos P3 Oxonia aktivilla kylvetetyissä ryhmissä, suluissa keskiha- jonta. P3 Oxonia Aktiv-pitoisuus mg/l 20 75 150 Kuoriutuminen % 80,4 (5,37) 78,0 (3,16) 79,4 (4,77) Kuolleet munat % 3,6 (4,10) 3,6 (2,16) 2,4 (1,67) Kuolleet poikaset % 2,0 (4,47) 4,8 (1,10) 4,4 (4,56) Homehtuneet munat % 0,8 (1,79) 1,2 (1,10) 1,6 (0,89) Kuoriutumattomat munat % 8,4 (4,43) 8,0 (3,74) 8,0 (4,00) Hävikki % 4,8 (1,79) 4,4 (3,58) 4,0 (3,16) 3.2. Kylvetysaineiden välinen vertailu Kylvetysaineiden eri pitoisuudet käsiteltiin yhdessä, koska pitoisuuksien välillä ei ol- lut eroa millään kylvetysaineella. Taulukossa 5 on koottuna eri kylvetysaineiden ja vertailun haudontatulokset. Homehtuneiden munien määrä vertailuryhmässä oli suu- rempi kuin kylvetetyissä, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Erot kuoriutu- misprosentissa Pyceze-, P3 Oxonia Aktiv-, malakiitti- ja vertailuryhmien välillä eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. Taulukko 5. Haudontatulos tutkituilla kylvetysaineilla kaikkien pitoisuuksien keskiar- vona ja malakiittivihreä- ja kontrolliryhmissä. Vertailu Malakiitti Pyceze Eugenol P3 Oxonia Aktiv Kuoriutuneet % 79,6 81,6 80,3 0 79,3 Kuolleet munat % 0,4 2,8 4,1 29,6 3,2 Kuolleet poikaset % 5,6 4,0 2,0 - 3,7 Homehtuneet % 2,0 0,8 1,4 1,6 1,2 Kuoriutumattomat % 7,6 7,2 7,7 11,9 8,1 Hävikki % 4,8 3,6 4,4 56,9 4,4 55 4. Tulosten tarkastelu Pyceze-kylvetysainetta käytettiin kokeessa kolmena eri pitoisuutena, jotka kaikki oli- vat kalojen haudonnassa saatujen kokemusten perusteella (Pottinger ja Day 1999, Es- kelinen et al. 2003) periaatteessa soveltuvia haudonnan aikaiseen hometorjuntaan. Näiden kolmen pitoisuuden välillä ei ollut merkitseviä eroja missään haudontatulok- seen vaikuttavassa tekijässä: kuoriutumistuloksessa, kuolleitten munien ja poikasten määrissä, homehtuneiden ja kuoriutumattomien munien määrässä tai munien hävikis- sä. P3 Oxonia Aktiv–kylvetyksissä ei myöskään syntynyt eroja pitoisuuksien välille. Toksisia tai kokonaan vaikuttamattomia pitoisuuksia ei kokeessa ollut tarkoituskaan etsiä, ja saadun tuloksen perusteella kaikki näiden kylvetysaineiden tutkitut pitoisuu- det ovat sopivia ravun mädin käsittelyyn. Vertailuryhmän haudontatulos ei eronnut tilastollisesti merkitsevästi malakiittivihreäl- lä, Pycezellä ja P3 Oxonia Aktivilla kylvetettyjen ryhmien tuloksesta. Koska kokee- seen valittiin normaalin ravunviljelykäytännön mukaan laadultaan sellaista mätiä, jos- ta on edellytykset saada hyvälaatuisia poikasia ja koeaika oli varsin lyhyt, 39 vrk, ho- mehtuminen haudontakupeissa oli vähäistä. Silmämääräisesti hyvälaatuisten munien kuoriutumistulos on havaittu hyväksi (Grönberg 1997). Kokeessa ei saatu varmuutta Pycezen ja P3 Oxonia Aktivin hometorjuntatehosta malakiittiin verrattuna, koska Eu- genolia lukuun ottamatta kaikkien koeryhmien haudontatulos oli hyvä eikä tilastollisia eroja aineiden välillä ollut. Eugenol liuotettuna dimetyylisulfoksidiin osoittautui sopimattomaksi ravun munien hometorjuntaan, koska yhtään poikasta ei kuoriutunut. Syynä voi olla paitsi Eugenolin myrkyllisyys ravun munille, myös liuottimena käytetyn DMSO:n ominaisuus tuottaa voimakkaasti lämpöä veden kanssa reagoidessa. Muihin liuottimiin liuotetun neilikka- öljyn soveltuvuus ravun munien hometorjuntaan kannattaisi selvittää. 5. Kirjallisuus Alaranta, A. & Haverinen, J. 2001. Pycezestä malakiitin korvaava kylvetysaine vesi- hometorjuntaan ravun (Astacus astacus) munien haudonnassa haudontalaitteella? Pro- jektityö, Kuopion yliopisto, Soveltavan biotekniikan instituutti. Cukerzis, J.M., Shestokas, J. & Terentyev, A.L. 1979. Method for artificial breeding of crayfish juveniles. Freshwater Crayfish 4: 452-458. Eskelinen, P., Pylkkö, P. & Konttinen, E. 2003. Malakiitin vaihtoehdot haudonnassa. Tämä nide. Grönberg, M. 1997. Bakteerien ja sienten torjunta täpläravun keinohaudonnassa. Pro gradu-tutkielma. Helsingin yliopisto, Hydrobiologian osasto. 63 s. Hussein, M.M.A., Wada, S., Hatai, K. & Yamamoto, A. 2000. Antimycotic activity of Eugenol against selected water molds. J. Aquat. Anim. Health 12: 224-229. Järvenpää, T., Tulonen, J., Erkamo, E., Savolainen, R. & Setälä, J. 1996. Ravunviljely – menetelmät ja kannattavuus. RKTL, Helsinki. 111 s. Lankinen, Y. & Halttunen, A. 2003. Malakiitin vaihtoehdot kalojen vesihomeen tor- juntakylvetyksissä. Tämä nide. Pottinger, T.G. & Day, J.G. 1999. A Saprolegnia parasitica challenge system for rainbow trout: asssessment of Pyceze as an anti-fungal agent for both fish and ova. Dis. Aquat. Org. 36: 129-141. KUVAILULEHTI Julkaisija Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos Julkaisuaika Marraskuu 2003 Tekijä(t) Päivi Eskelinen (toim.) Julkaisun nimi Vesihome kalanviljelyn vaivana Onko taudin torjuntaan menetelmiä? Julkaisun laji Tutkimusraportti Toimeksiantaja Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos Toimeksiantopäivämäärä Projektin nimi ja numero Viljeltyjen lohikalojen vesihometartunnan ennaltaehkäisy ja hoito, 313131 Tiivistelmä Vesihometartuntoja ovat meillä tavallisimmin aiheuttaneet Saprolegnia –suvun sienet. Kalojen vesihome- tartunnan haitat kalanviljelylle ovat viime vuosina olleet suuria. Mädin haudonnassa vesihome kasvaa kuolleitten mätimunien pinnalla ja levittäytyy ilman torjuntaa helposti myös elävään mätiin. Vesihometta on varsinkin haudonnassa perinteisesti torjuttu malakiittivihreäkylvetyksillä. Malakiittivihreän käyttö kalan- viljelyssä kuitenkin kiellettiin vuonna 2001 sen karsinogeenisten vaikutusten takia, mistä syystä korvaavia hoitomenetelmiä ja –kemikaaleja on pyritty löytämään. Tämän raportin artikkelit tarkastelevat vesihometartuntaa monelta kannalta. Raportissa kuvataan, millai- nen tautitila vesihometartunta nykytietämyksen valossa on. Vesihomesienten genotyypityksen avulla on löydetty Suomessa yleinen hyvin taudinaiheutuskykyinen vesihomeklooni. Malakiittivihreää korvaavaksi hometorjuntakemikaaliksi haudonnassa on hyväksytty bronopoliyhdiste Pyceze. Sen ja eräiden muiden kemikaalien tehoa sekä kalojen että ravun mädin homehtumisen estäjänä selvitettiin haudontakokein. Raportissa on myös selvitetty kylvetysaineiden käyttökelpoisuutta kalojen vesihometartunnan hoidossa sekä hometartunnan hoitotehon että hoidosta aiheutuvien kustannusten kannalta. Asiasanat Vesihome, Saprolegnia sp., Pyceze, malakiittivihreä, vetyperoksidi, haudonta, kylvetykset Sarjan nimi ja numero Kalatutkimuksia – Fiskundersökningar 188 ISBN 951-776-408-1 ISSN 0787-8478 Sivumäärä 56 s. Kieli Suomi Hinta 13 € Luottamuksellisuus Julkinen Myynti Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos Asiakaspalvelu ja myynti Pukinmäenaukio 4, PL 6 00720 Helsinki Puh. 0205 751 399 Faksi 0205 751 201 julkaisumyynti@rktl.fi Kustantaja Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos PL 6 00721 Helsinki Puh. 0205 7511 Fax 0205 751201 PRESENTATIONSBLAD Utgivare Vilt- och fiskeriforskningsinstitutet Utgivningsdatum November 2003 Författare Päivi Eskelinen (red.) Publikationens namn Vattenmögel som problem i fiskodling. Finns metoder för bekämpning? Typ av publikation Rapport Uppdragsgivare Vilt- och fiskeriforskningsinstitutet Datum för uppdragsgivandet Projektnamn och -nummer Förebyggande åtgärder för och vård av svampangrepp på odlade laxfiskar, 313131 Referat Hos oss är svampar som hör till släktet Saprolegnia den vanligaste orsaken till vattensvampangrepp. Svampangreppen har under de senaste åren förosakat stora skador för fiskodlingarna. Svampen växer också på döda romkorn under den tid rommen inkuberas och sprider sig utan bekämpning lätt också till levande romkorn. Vattensvampen har traditionellt bekämpats med bad i malakitgrönt, speciellt under rommens inkubationstid. På grund av dess karcinogena effekt förbjöds malakitgrönt år 2001, varför man har försökt finna ersättande metoder och kemikalier. Artiklarna i den här rapporten behandlar svampangrepp ur många olika synvinklar. I rapporten beskriver man med den kunskap man har nu hurudant sjukdomstillstånd vattensvampen orsakar. Med hjälp av en bestämning av vattensvampens genotyp har man hittat en allmän sjukdomsalstrande vattensvampklon i Finland. Bronopolföreningen Pyceze har godkänts som en ersättande kemikalie för malakitgrönt i bekämpningen. Dess effekt, samt några andra kemikaliers effekt, som sjukdomsförhindrare på fisk- och kräftrom undersöktes med försök. I rapporten har man också utrett ändamålsenligheten av de ämnen man använder i bad vid behandlingen av svampangrepp på fisk, både med tanke på effekten av behandlingen och med tanke på kostnaderna. Nyckelord Vattensvamp, Saprolegnia sp., Pyceze, malakitgrönt, väteperoxid, badning, inkubering Seriens namn och nummer Kalatutkimuksia – Fiskundersökningar 188 ISBN 951-776-408-1 ISSN 0787-8478 Sidoantal 56 s. Språk Finska Pris 13 € Sekretessgrad Offentlig Försäljning Vilt- och fiskeriforskningsinsttitutet Kundbetjäning och försäljnung Bocksbackaplanen 4, PB 6 00721 Helsingfors Tel. 0205 751 399 Fax 0205 751 201 julkaisumyynti@rktl.fi Förlag Vilt- och fiskeriforskningsinstitutet PB 6 00721 Helsingfors Tel. 0205 7511 Fax 0205 751201 DOCUMENTATION PAGE Published by Finnish Game and Fisheries Research Institute Date of Publication November 2003 Author(s) Päivi Eskelinen (ed.) Title of Publication Saprolegniosis in aquaculture Type of Publication Research report Commissioned by Finnish Game and Fisheries Research Institute Date of Research Contract Title and Number of Project Prevention and control of saprolegniosis in cultured salmonids, 313131 Abstract Mycotic infections of farmed fish caused by Saprolegnia sp. aquatic fungi had represented significant economic and welfare problem during last years. In hatcheries dead eggs are also suspectible to fungal infections and without fungicide treatment, also live eggs may be infected. Malachite green has long been employed as an effective fungicide, but the carcinogenicity of malachite green has led to restrictions on its use in 2001. Therefore there has been large efforts to find a new therapeutant and better culture methods. The articles in this publication approach saprolegniosis on many sides. The characteristics of saprolegniosis is considered. In genetical characterisation a prevalence of a single highly pathogenic Saprolegnia sp. clone in Finland was found. Pyceze, a compound containg bronopol is accepted to alternative treatment to malachite green for salmonid eggs. The antimycotical activity of Pyceze and several other chemicals in incubation of salmonid and crayfish eggs are compared to malachite green. The efficiency of therapeutic chemicals against fish saprolegniosis and the cost estimates of treatments are described. Key words Aquatic fungi, Saprolegnia sp., Pyceze, malachite green, hydrogen peroxide, incubation, bath Series (key title and no.) Kalatutkimuksia – Fiskundersökningar 188 ISBN 951-776-408-1 ISSN 0787-8478 Pages 56 p. Language Finnish Price € 13 Confidentiality Public Distributed by Oy Edita Ab Book-shop Annankatu 44 FIN-00100 Helsinki, Finland Phone +358 0 566 0566 Fax +358 0 566 0570 Publisher Finnish Game and Fisheries Research Institute P.O.Box 6 FIN-00721 Helsinki, Finland Phone +358 205 7511 Fax +358 205 7511 56 Kiitokset Parhaimmat kiitokset Marja Pasternackille, Satu Viljamaa-Dirksille ja Paula Hentto- selle tämän niteen käsikirjoitusten kommentoinnista, Riitta Savolaiselle ja Risto Kan- teleelle avusta rapu- ja saavihaudontakokeiden suunnittelussa sekä Maija Pelliselle, Jukka Bombergille ja Ari Leinoselle osallistumisesta haudontakokeiden hoitoon. KALATUTKIMUKSIA – FISKUNDERSÖKNINGAR Aiemmin ilmestyneitä julkaisuja 187. TOIVONEN, A.-L., MIKKOLA, J., SALMI, P., SALMI, J. Vapaa-ajankalastuksen monet merkitykset. (Det mångfacetterade fritidsfisket) (Multiple dimensions of recreational fisheries). 30 s. Helsinki 2003. 186. ERKINARO, J., MÄKI-PETÄYS, A., JUNTUNEN, K., ROMAKKANIEMI, A., JOKIKOKKO, E., IKONEN, E., HUHMARNIEMI, A. Itämeren lohikantojen elvytysohjelma SAP vuosina 1997 – 2002. (Vitaliseringsprogrammet för laxstammarna i Östersjön SAP åren 1997-2002) (The Baltic Salmon Action Plan in Finland, 1997-2002). 31 s. Helsunki 20003. 185. KREIVI, P., SIIRA, A., IKONEN, E., SUURONEN, P., HELLE, E., RIIKONEN, R., LEHTONEN, E. Hylkeen aiheuttamat saalistappiot ja pyydysvahingot lohirysäkalastuksessa vuonna 2001. (Fångstförluster och redskapsskador förorsakade av säl i fisket med laxryssjor år 2001) (Seal-induced damage to salmon trap net fishery in the year 2001). 20 s. Helsinki 2002. 184. SIIRA, A., IKONEN, E., SUURONEN, P., RIIKONEN, R., LEHTONEN, E. Lohen eloonjäänti rysästä vapauttamisen jälkeen. (Laxarnas överlevnad sedan de släppts ur ryssjan) ( Survival of trap net-caught and live-released salmon in the Gulf of Bothnia in Baltic Sea). 24 s. Helsinki 2002. 183. Vesialueiden omistus ja alueellinen hallinnointi. Muje, K., Tonder, M. (toim.). (Vattenägande och regional förvaltning) ( Ownership of water and regional management). 119 s. Helsinki 2002. 182. Meritaimenen tila ja kalastus Pohjanlahden alueella. Kallio-Nyberg, I., Jutila, E. & Saura, A. (toim.). (Havsöringens tillstånd och havsöringsfisket i Bottniska viken) (The status and fishing of sea trout in the Gulf of Bothnia area). 69 s. Helsinki 2002. 181. ESKELINEN, P., PIIRONEN, J., PRIMMER, C. Selviävätkö kaikki lohiperheet yhtä hyvin alkukasvatuksen aikana? (Klarar sig alla laxfamiljer lika bra i början av uppfödningen?) (Do all salmon families manage equally during the early culture stages?). 32 s. Helsinki 2002. 180. HUHMARNIEMI, A., ARONSUU, K. Kalajoen vaellussiika – lisääntymisongelmia ja istukkaiden liikapyyntiä. (Vandringssiken i Kalajoki – reproduktionsproblem och en alltför intensivt fångst av utplanterad fisk) (Whitefish of the River Kalajoki – Problems with natural production and with overfishing of stocked fish). 32 s. Helsinki 2001. 179. NIVA T. Perämeren ja sen jokien lohi-istutusten tuloksellisuus vuosina 1959-1999. (Utbytet av laxutsättningarna i Bottenviken och dess älvar åren 1959-1999) (Results of salmon smolt releases in the Bothnian Bay from 1959-1999). 67 s. Helsinki 2001. 178. PENNANEN, J. T. Toutaimen istutukset ja niiden tulokset. (Utsättningar av asp och deras resultat) (Releases of asp and their results). 55 s. Helsinki 2001. 177. Paikallinen tieto, asiantuntijuus ja vuorovaikutus kalavesien hallinnassa. Salmi. P. (toim.) (Lokal kunskap, sakkunskap och samverkan vid administration av fiskevatten) (Local knowledge, expert knowledge and communication in fisheries governance). 115 s. Helsinki 2001. 176. NIEMELÄ, E., ERKINARO, J., KYLMÄAHO, M., JULKUNEN, M., MOEN, K. Näätämöjoen lohen poikastiheys ja kasvu. (Yngeltäthet och tillväxt hos laxen i Näätämöjoki) ( The density and growth of juvenile salmon in the River Näätämöjoki). 27.s. Helsinki 2001. 175. SAURA, A. Taimenkantojen tila Suomenlahden pohjoisrannikon joissa. (Öringsbeståndens tillstånd i åar och älvar längs Finska vikens norra kust) (Sea trout stocks in the rivers flowing from the northern coast into the Gulf of Finland). 48 s. Helsinki 2001. 174. KOIVURINTA, M., VÄHÄNÄKKI, P., SAURA, A. Meritaimen ja sen kalastus itäisellä Suomenlahdella 1990-luvulla. (Havsöring och havsöringsfiske i östra Finska viken på 1990-talet) (Stocking results of sea trout in the eastern Gulf of Finland). 24 s. Helsinki 2001. 173. KALLIO-NYBERG, I., KOLJONEN, M.-L., JUTILA, E. Taimenatlas. (Öringsatlas) (Atlas of brown trout stocks). 57 s. Helsinki 2001. 172. LÖNNSTRÖM, L.-G., RAHKONEN, R.., GRÖNDAHL, A., PASTERNACK, M., LUNDÉN, T., KOSKELA, J., BYLUND, G. Siian rokotus paisetautia ja vibrioosia vastaan. (Vaccinering av sik mot furunkulos och vibrios) (Vaccination against vibriosis and furunculosis in whitefish, Coregonus lavaretus (L.)). 15 s. Helsinki 2001 171. KOSKELA, J., RAHKONEN, R., FORSMAN, L., NORRDAHL, O., LÖNNSTRÖM, L.-G. Siika ruokakalanviljelyssä – kahden siikakannan ja kantaristeytymän vertailu. (Sik i matfiskodling – en jämförelse mellan två sikstammar och deras hybrider) (Whitefish in aquaculture: comparison of two stocks and their hybrids). 24 s. Helsinki 2001. 170. PARMANNE, R. Silakan poikasten runsaus Suomen rannikolla vuosina 1974-1996. (Tätheten av strömmingsyngel vid Finlands kuster åren 1974- 1996) (Abundance of Baltic herring larvae off the coast of Finland in 1974 – 1996). 44 s. Helsinki 2001. 169. MIKKOLA, J., LAAMANEN, M., JUTILA, E. Kymijoen vaelluskalat ja kalastus 1990-luvulla. (Kymmene älvs vandringsfiskar och fisket under 1990-talet) (Migratory fish of the Kymijoki river and their fishing in the 1990s). 44 s. Helsinki 2000. 168. LAPPAINEN, A. Sisävesikalastus muuttuvassa yhteiskunnassa. (Insjöfisket i ett föränderligt samhälle) (Inland Fishing in a Changing Society). 38 s. Helsinki 2000. 167. KOLARI, I., AUVINEN, H., HIRVONEN, E. Kalastus Puruvedellä vuosina 1979-1995. (Fisket i Puruvesi åren 1979-1995) (Fishing in Lake Puruvesi in 1979-1995). 25 s. Helsinki 2000. 166. MÄKI-PETÄYS, A., HUUSKO, A., KREIVI, P. Järvilohen poikasten elinympäristövaatimukset kesällä ja syksyllä. (Insjölaxynglens krav på sin livsmiljö under sommar och höst) (Summer and autumn habitat requirements and the habitat use of young landlocked salmon (Salmo salar m. lacustris)). 15 s. Helsinki 2000. 165. KEINÄNEN, M., TOLONEN, T., IKONEN, E., PARMANNE, R., TIGERSTEDT, C., RYTILAHTI, J., SOIVIO, A., VUORINEN P.J. Itämeren lohen lisääntymishäiriö − M74. (Östersjölaxens reproduktionsstörning − M74) (Reproduction disorder of Baltic salmon − M74). 38 s. Helsinki 2000. 164. KOIVURINTA, M., SYDÄNOJA, A., MARJOMÄKI, T., HELMINEN, H., VALKEAJÄRVI, P. Taimenen ja järvilohen ravinto ja kasvu Puulassa, Päijänteessä, Konnevedessä ja Säkylän Pyhäjärvessä vuosina 1995- 1996. (Öringens och insjölaxens föda och tillväxt i Puula, Päijänne, Konnevesi och Säkylä Pyhäjärvi åren 1995-1996) (Diet and growth of brown trout and landlocked salmon in lakes Puula, Päijänne, Konnevesi (central Finland) and Pyhäjärvi (SW Finland) from 1995-1996). 32 s. Helsinki 2000. 163. KOLARI, I., HIRVONEN, E., FRIMAN, T. Nieriäistutusten tuloksellisuus Puruvedessä. (Utbytet av rödingsutsättningarna i Puruvesi) (The stocking results of Arctic charr in Lake Puruvesi). 42 s. Helsinki 1999. 162. Ahvenen ravinto Puruvedessä. Vuorimies, O. (toim.). (Abborrens föda i Puruvesi) (The food of perch in Lake Puruvesi). 44s. Helsinki 1999. 161. VALKEAJÄRVI, P. Päijänteen säännöstelyn vaikutus siikakantaan. (Inverkan av Päijännes reglering på sikbeståndet) (Effect of water level regulation on the whitefish stock in Lake Päijänne). 34 s. Helsniki 1999. 160. SIIRA, A., HUUSKO, A., KORHONEN, P. Taimenistutusten vaikutus vaikutus Kitkajärvien muikkukantaan ja kalansaaliiseen. (Inverkan av öringsutsättningarna på beståndet av siklöja och på fiskfångsterna i Kitkajärvi-sjöarna) (Affects of stocking of Brown Trout on Vendace population and total catch of fish in Lake Kitkajärvi). 27 s. Helsinki 1999. 159. PARMANNE, R. Silakan kudun ajoittuminen ja kutuparvien koostumus rysäkalastuksen perusteella. (Strömmingens lektider och de lekande stimmens sammansättning enligt ryssjefångster) (The spawning time and composition of spawning shoals according to trapnet fishing of Baltic herring). 41 s. Helsinki 1999. 158. MUTENIA, A., SALONEN, E., KOTAJÄRVI, M. Lokan ja Porttipahdan vaellussiika – tekojärvien paikallinen arvokala. (Älvsiken i Lokka och Porttipahta - vattenmagasinens lokala värdefisk) (Whitefish: a Local Fish of Value in the Lokka and Porttipahta Reservoirs) 29. s. Helsinki 1999. 157. SAURA, A. Taimenen säilyttäminen Gumbölenjoessa. (Åtgärder för att bevara öringen i Gumböleån) (Maintenance of the trout in the Gumbölenjoki River in Espoo). 19. s. Helsinki 1999. 156. NYKÄNEN, M., HUUSKO, A. Harjuksen elinympäristövaatimukset virtavesissä - kirjallisuusselvitys. (Harrens miljökrav i rinnande vatten - litteraturundersökning) (Habitat requirements and habitat use of riverine European grayling (Thymallus thymallus (L.)) ⎯ a review). 23 s. Helsinki 1999. 155. Saimaan järvilohen elinolosuhteiden parantaminen. Makkonen, J. (toim.). (Hur kan förhållandena för insjölaxen i Saimen förbättras?) (Improving the living conditions for Saimaa landlocked salmon). 97 s. Helsinki 1999. 154. JUTILA, E., JOKIKOKKO, E., SALO, P. Viehekalastuksen kehitys Simojoella - kalastus Simossa ja Ranualla 1994 -1997 (Utvecklingen av spöfisket i Simojoki - fisket i Simo och Ranua åren 1994 - 97) (Development of rod fishing in the Simojoki River: fishing in the municipalities of Simo and Ranua, 1994-1997). Helsinki 1999. 153. HEIKINHEIMO, O. Siian kalastuksen säätely sisävesissä. (Reglering av sikfisket i insjöområdet) (Management of the whitefish (Coregonus lavaretus (L.)) fishery in inland waters). 26 s. Helsinki 1999.