Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 Kaiken takana on laadukas raaka-aine – Silakan laadun mittausmenetelmät Anna-Liisa Välimaa, Heikki Aisala, Ella Aitta, Hanna-Leena Alakomi, Jaakko Hiidenhovi, Kaisu Honkapää, Anu Hopia, Jaana Huotari, Tanja Kakko, Nora Logrén, Pirjo Mattila, Sari Mäkinen, Jari Setälä, Baoru Yang ja Guy Svanbäck Luonnonvarakeskus, Helsinki 2021 Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 Kaiken takana on laadukas raaka-aine – Silakan laadun mittausmenetelmät Anna-Liisa Välimaa, Heikki Aisala, Ella Aitta, Hanna-Leena Alakomi, Jaakko Hiidenhovi, Kaisu Honkapää, Anu Hopia, Jaana Huotari, Tanja Kakko, Nora Logrén, Pirjo Mattila, Sari Mäkinen, Jari Setälä, Baoru Yang ja Guy Svanbäck Viittausohje: Välimaa, A-L., Aisala, H., Aitta, E., Alakomi, H-L., Hiidenhovi, J., Honkapää, K., Hopia, A., Huo- tari, J., Kakko, T., Logrén, N., Mattila, P., Mäkinen, S., Setälä, J., Yang, B. & Svanbäck, G. 2021. Kaiken takana on laadukas raaka-aine – Silakan laadun mittausmenetelmät. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021. Luonnonvarakeskus. Helsinki. 91 s. Anna-Liisa Välimaa, ORCID ID, https://orcid.org/0000-0002-4953-6100 ISBN 978-952-380-258-2 (Painettu) ISBN 978-952-380-259-9 (Verkkojulkaisu) ISSN 2342-7647 (Painettu) ISSN 2342-7639 (Verkkojulkaisu) URN http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-380-259-9 Copyright: Luonnonvarakeskus (Luke) Kirjoittajat: Anna-Liisa Välimaa, Heikki Aisala, Ella Aitta, Hanna-Leena Alakomi, Jaakko Hiiden- hovi, Kaisu Honkapää, Anu Hopia, Jaana Huotari, Tanja Kakko, Nora Logrén, Pirjo Mattila, Sari Mäkinen, Jari Setälä, Baoru Yang ja Guy Svanbäck Julkaisija ja kustantaja: Luonnonvarakeskus (Luke), Helsinki 2021 Julkaisuvuosi: 2021 Kannen kuva: Jari Setälä, Luonnonvarakeskus (Luke) Painopaikka ja julkaisumyynti: PunaMusta Oy, http://luke.juvenesprint.fi Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 3 Tiivistelmä Anna-Liisa Välimaa1, Heikki Aisala2, Ella Aitta3, Hanna-Leena Alakomi2, Jaakko Hiidenhovi4, Kaisu Honkapää2, Anu Hopia5, Jaana Huotari2, Tanja Kakko3, Nora Logrén5, Pirjo Mattila6, Sari Mäkinen4, Jari Setälä6, Baoru Yang3 ja Guy Svanbäck7 1 Luonnonvarakeskus (Luke), Paavo Havaksen tie 3, 90570 Oulu 2 Teknologian tutkimuskeskus VTT Oy, Tietotie 2, Otaniemi, 02150 Espoo 3 Elintarvikekemia ja elintarvikekehitys, Bioteknologian laitos, Turun yliopisto, PharmaCity, Itäi- nen Pitkäkatu 4C, 7. krs, 20520 Turku 4 Luonnonvarakeskus (Luke), Myllytie 1, 31600 Jokioinen 5 Turun yliopiston funktionaalisten elintarvikkeiden kehittämiskeskus, PharmaCity, Itäinen Pit- käkatu 4 A, 5. krs, 20520 Turku 6 Luonnonvarakeskus (Luke), Itäinen Pitkäkatu 4 A, 20520 Turku 7 Österbottens Fiskarförbund, Kalastuksen talo/Kalaranta, 65100 Vaasa Kalatalouden innovaatio-ohjelma Blue Products keskittyy kotimaisen kalan arvon lisäämiseen kehittämällä alihyödynnettyjen kalojen, kuten silakan ja särkikalojen käyttöä elintarvikkeissa ja uusissa, innovatiivisissa korkean lisäarvon erikoistuotteissa. Kuluttajien kiinnostus silakkaa ja särkikaloja kohtaan ympäristöystävällisenä ja terveellisenä ruokana on viime aikoina kasvanut, mutta toisaalta samaan aikaan yrityskentältä ja kuluttajilta on tullut viestiä silakan laadun vaih- telusta ja liian heikosta säilyvyydestä. Sekä perinteistä ruokakäyttöä että innovatiivisempia tuotteita varten kalan laadun onkin oltava erinomainen. Jotta silakan laatua pystytään paran- tamaan, pitää laatu pystyä mittaamaan numeerisesti kalastusalukselta kauppaan. Tässä rapor- tissa arvioidaan erilaisten mittausmenetelmien soveltuvuutta silakan laadun määrittämiseksi kalaketjun eri vaiheissa ja tarvetta uusille pikamenetelmille laadun mittaamiseksi. Kuluttajalle laatu näyttäytyy aistittavana laatuna. Kalojen aistinvaraisen laadun tutkimuksessa voidaan käyttää monenlaisia menetelmiä, mutta kalaketjun käyttöön tarvitaan helposti omak- suttava ja mielellään älylaitteessa toimiva yksinkertainen numeerinen mittari. Tällaiseksi voisi soveltua silakalle kehitetty laatuindeksiin perustuva älypuhelinsovellus, joka mukailee ”How fresh is your fish”-sovellusta. Tämän tuomiseksi käytäntöön tarvitaan yhteistyökumppaniksi oh- jelmistoyritys. Aistittavan laadun taustatekijät ovat joukko kemiallisia, biokemiallisia, fysikaalisia ja mikrobiologisia ilmiöitä, joiden mittaamiseen löytyy lukuisia menetelmiä. Lupaavilta kalan laadunvalvontaan ja tuoreuden arviointiin prosessoinnissa ja kaupassa vaikuttavat kaupalliset pikamenetelmät kuten ”Freshness checker” ja ”PRECICE® Freshness Assay Kit”, sekä pakattujen tuotteiden kohdalla erilaiset värimuutokseen perustuvat kemosensitiiviset sensorit, jotka vies- tivät kalan laadusta sekä kuljetuksen että säilytyksen aikana. Kalan sähköisten ominaisuuksien muutoksiin perustuvat Torrymeter sekä Fischtester VI ovat edelleen käyttökelpoisia, kaupalli- sesti saatavia, koko ketjun seurantaan soveltuvia kalan tuoreusmittareita, mutta ne ovat epä- herkkiä ja alttiita erilaisille virhemittauksille. Sähkökemiallinen impedanssispektrosopia (EIS) an- taa kalan koostumuksesta tarkempaa informaatiota. Tämän menetelmän mahdollisuuksia sila- kan laadun mittaamiseen tullaan testaamaan Blue Products -ohjelman jatkotutkimuksissa. Eri- laiset kuvantamistekniikat, kuten hyperspektrikuvantaminen, tarjoavat mielenkiintoisia uusia mahdollisuuksia kalan laadun määrittämiseksi ja esimerkiksi kalansaaliin lajitteluun laadun pe- rusteella. Kuvantamistekniikka on vielä nykyisellään melko kallista, mutta toisaalta kuvantamis- menetelmät ovat jo vakiinnuttaneet asemansa laajasti teollisuuden eri aloilla ja elintarviketeol- lisuudessa laaduntarkkailussa. Asiasanat: silakka, kalan laatu, alihyödynnetty kala Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 4 Abstract Blue Products is an innovation program, which aims to increase the use of underutilized fish species, such as Baltic herring and roach, by developing added-value products. The consumers’ interest in these fish species has increased due to health and environmental reasons, but at the same time the concern of the rapid decrease in freshness and sensory quality of Baltic herring is noticeable in low demand. Thus, excellent quality of the fish is a key element when develop- ing new products. Numeric, easy-to-use methods are needed to measure the quality of Baltic herring all the way from fishing vessels to shops. In this report, different methods to determine the quality of fish are reviewed, focusing on the suitability and availability of quick methods for Baltic herring in different parts of the food chain. Sensory quality is the most important quality parameter for the consumers. There are already many different methods to determine the sensory quality of fish, but there is a need for a numeric and easy-to-use mobile application for Baltic herring. An example of this could be an application which mimics the “How fresh is your fish” –mobile application but would be based on the quality index developed especially for Baltic herring. Collaboration with a software com- pany is needed to enable the development of this kind of an application. The sensory quality is dependent on a combination of biochemical, chemical, physical and mi- crobial changes, many of which can be analysed and determined with specific methods. For example, there are commercial applications to measure biochemical changes in fish, namely “Freshness checker” and “PRECICE® Freshness Assay Kit”. Further, chemosensitive compounds, which change colour upon biochemical changes, could be applied to primary packaging. This would enable easy, visible method to ensure freshness during shipping and resale. The changes in electrochemical properties of the fish flesh can be measured with Torrymeter and Fischtester VI, which are common and suitable tools for every part of the fish processing chain. Although being easy to use, these meters have challenges in precision and reliability. Electrical Imped- ance Spectroscopy (EIS), however, is a more precise method which will be studied further by the Blue Products partners, focusing on its suitability to determine the quality of Baltic herring. Lastly, different imaging techniques have also been studied. For example, hyperspectral imag- ing can be used for sorting fish and some fish industries have already adopted this method in their facilities. Although being expensive, automated imaging techniques are already vastly used in food and other industries. Key words: Baltic herring, fish quality, underutilized fish Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 5 Abstrakt Fiskerinäringens innovationsprogram Blue Products är inriktat på att öka värdet av den in- hemska fisken genom att utveckla användningen av underutnyttjad fisk, såsom strömming och mörtfiskar, i livsmedel och nya, innovativa specialprodukter med högt mervärde. Konsumen- ternas intresse för strömming och mörtfiskar som miljövänlig och hälsosam mat har ökat den senaste tiden, men å andra sidan har det samtidigt från företagssektorn och konsumenterna kommit antydningar om variationer i strömmingens kvalitet och för dålig hållbarhet. För såväl traditionella livsmedelsprodukter som mera innovativa produkter bör fiskens kvalitet vara ut- märkt. För att kunna förbättra strömmingens kvalitet, måste det vara möjligt att numeriskt mäta kvaliteten från fiskefartyget till handeln. I denna rapport bedöms olika mätmetoders lämplighet för att bestämma strömmingens kvalitet i fiskkedjans olika skeden och behovet av nya snabb- metoder att mäta kvaliteten. För konsumenten framstår kvaliteten som sensorisk kvalitet. Vid undersökningen av fiskars sen- soriska kvalitet kan man använda ett brett spektrum av metoder, men för användning i fisk- kedjan behöver man en enkel numerisk mätare som är lätt att ta i bruk och som helst fungerar på en smartenhet. Som en dylik kunde den för strömming utvecklade smartphone -appen, som baserar sig på kvalitetsindex, lämpa sig, och som är anpassad efter ”How fresh is your fish” - appen. För att få denna i praktiskt bruk behövs något mjukvaruföretag som samarbetspart. Bakgrundsfaktorerna för sensorisk kvalitet är en uppsättning kemiska, biokemiska, fysikaliska och mikrobiologiska fenomen, vilka det finns en mängd olika metoder för att mäta. Kommer- siella snabbmetoder som "Freshness checker" och "PRECICE® Freshness Assay Kit" verkar lo- vande för kvalitetsövervakning av fisk och för bedömning av färskhet, och för förpackade pro- dukter olika kemosensoriska metoder som baserar sig på färgförändringar, och som anger fis- kens kvalitet såväl under transport som under lagring. Torrymeter och Fischtester VI, som ba- serar sig på förändringar i fiskens elektriska egenskaper, är fortfarande användbara, kommer- siellt tillgängliga, lämpliga färskhetsmätare för uppföljning av fisk i hela fiskkedjan, men de är okänsliga och mottagliga för olika felmätningar. Elektrokemisk impedansspektroskopi (EIS) ger mer exakt information om fiskens sammansättning. Möjligheterna med denna metod för att mäta strömmingens kvalitet kommer att testas i de fortsatta undersökningarna i Blue Products -programmet. Olika bildtekniker, som exempelvis hyperspektral fotografering, erbjuder intressanta nya möj- ligheter att bestämma fiskens kvalitet och att exempelvis sortera fisken enligt kvalitet. Bildtek- nik är ännu idag ganska dyr, men å andra sidan har bildframställningsmetoderna redan etable- rat sig inom olika industrisektorer och inom livsmedelsindustrins kvalitetskontroll. Ämnesord: strömming, fisk kvalitet, underutnyttjad fisk Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 6 Sisällys 1. Tausta ja tavoitteet ................................................................................................. 8 2. Aistinvaraiset menetelmät ..................................................................................... 9 2.1. Johdanto ............................................................................................................................................................. 9 2.2. Laatuasteikolliset menetelmät ................................................................................................................... 9 2.2.1. Torry Sensory Scheme .......................................................................................................................... 9 2.2.2. Quality Index Method (QIM) ........................................................................................................... 10 2.2.3. Muut laatuluokitusmenetelmät: European Union (EU) Grading Scheme, Evira 8001 .................................................................................................................................................................... 11 2.3. Kuvailevat menetelmät .............................................................................................................................. 11 2.3.1. Pääasialliset kuvailevat menetelmät ............................................................................................. 12 2.3.2. Kuvailevat pikamenetelmät ............................................................................................................. 12 2.4. Instrumentaali- ja aistimenetelmien rajapinta .................................................................................. 12 2.4.1. Artificial Quality Index (AQI) ............................................................................................................ 12 2.5. Yhteenveto ja arvio aistinvaraisten menetelmien soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille ............................................................................................................................................. 13 3. Kemialliset ja biokemialliset menetelmät .......................................................... 15 3.1. Johdanto .......................................................................................................................................................... 15 3.2. Maitohapon ja pH:n mittaus .................................................................................................................... 16 3.3. Entsyymiaktiivisuuksien mittaus ............................................................................................................. 17 3.4. Rasvojen ja proteiinien hapettuminen ................................................................................................. 17 3.5. K-arvoon perustuvat menetelmät ......................................................................................................... 18 3.5.1. Kaupalliset laitteet ............................................................................................................................... 19 3.6. Trikloorietikkahappoon liukenevat peptidit ...................................................................................... 19 3.7. Kemosensitiiviset yhdisteet ...................................................................................................................... 20 3.8. Haihtuvien amiinien mittaus P3HT-sensorilla ................................................................................... 21 3.9. Arvio soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille ..................................................................... 21 4. Fysikaalis-kemialliset menetelmät ...................................................................... 24 4.1. Sähköisten ominaisuuksien muutoksiin perustuvat menetelmät .............................................. 24 4.1.1. Fischtester ............................................................................................................................................... 24 4.1.2. Torrymeter .............................................................................................................................................. 25 4.1.3. Fischtesterin ja Torrymeterin vertailua ........................................................................................ 25 4.2. Värin mittaus .................................................................................................................................................. 26 4.3. Sähkökemiallinen impedanssispektroskopia (EIS) ........................................................................... 27 4.4. Konenäkö ........................................................................................................................................................ 28 Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 7 4.5. Raman-spektroskopia ................................................................................................................................ 30 4.6. VIS/NIR-spektroskopia ............................................................................................................................... 32 4.7. Hyperspektrikuvantaminen ...................................................................................................................... 34 4.8. Elektroninen nenä ........................................................................................................................................ 37 4.9. Elektroninen kieli .......................................................................................................................................... 39 4.10. Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia - NMR ...................................................................... 40 4.11. Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetri – DSC ................................................................................... 41 4.12. Kaksiulotteinen elektroforeesi (2DE) .................................................................................................... 42 4.13. Terahertsispektroskopia ja -kuvannus ................................................................................................. 43 4.14. Rakenteen mittaus ....................................................................................................................................... 45 4.15. Arvio soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille ..................................................................... 49 5. Mikrobiologiset menetelmät ............................................................................... 53 5.1. Johdanto .......................................................................................................................................................... 53 5.2. Viljelymenetelmät ........................................................................................................................................ 54 5.2.1. Elintarvikepatogeenien määrittäminen ....................................................................................... 54 5.2.2. Mikrobiologisen laadun määrittäminen ..................................................................................... 55 5.2.3. Valikoivat kasvatusalustat (kromogeeniset kasvualustat) ................................................... 56 5.3. Immunomääritysmenetelmät .................................................................................................................. 57 5.3.1. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) .......................................................................... 57 5.3.2. ELFA (enzyme linked fluorescent assays) ................................................................................... 57 5.3.3. Lateraalivirtaustestit............................................................................................................................ 58 5.4. Nukleiinihappoihin perustuvat menetelmät ...................................................................................... 59 5.4.1. Polymeraasiketjureaktio .................................................................................................................... 59 5.4.2. Reaaliaikainen PCR .............................................................................................................................. 60 5.4.3. Isoterminen monistus ........................................................................................................................ 61 5.4.4. Seuraavan sukupolven sekvensointi ............................................................................................ 61 5.5. Proteiinirakenteiden tunnistukseen perustuvat menetelmät ...................................................... 62 5.5.1. MALDI-TOF MS ..................................................................................................................................... 62 5.6. Kaupalliset pikatestit ympäristönäytteiden ottoon ......................................................................... 64 5.7. Ennustava mikrobiologia........................................................................................................................... 65 5.8. Arvio mikrobiologisten menetelmien soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille ...... 65 6. Yhteenveto ............................................................................................................. 68 Lähteet .......................................................................................................................... 74 Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 8 1. Tausta ja tavoitteet Kalatalouden innovaatio-ohjelma Blue Productsin tavoitteena on auttaa Suomen kalasektoria nostamaan vajaahyödynnetyistä kalalajeista, joihin myös silakan ajatellaan kuuluvan, ja kalate- ollisuuden sivuvirroista saatavaa arvoa mm. kehittämällä uusia, innovatiivisia tuotekonsepteja. Suomen suurin ja taloudellisesti merkittävin kalansaalis muodostuu silakasta ja kilohailista, mutta valtaosa saaliista käytetään turkiseläinten rehuksi tai kalajauhoksi, ja vain pieni osa käy- tetään suoraan (kotimaisena) elintarvikkeena. Koska silakkasaaliista iso osa päätyy rehukäyt- töön, kyseisen osan laatua ei ole tarvinnut pitää elintarvikesilakan tasolla, vaan rehulaatu on riittänyt. Kun turkistarhaus on Suomessa vähenemässä, vapautuisi sen käytöstä iso resurssi elin- tarvikekäyttöön, mutta tällöin raaka-ainekalan laatu pitää nostaa erinomaiselle tasolle. Tähän tarvitaan luultavasti kalastuskäytäntöjen muutoksia ja laatutyötä koko tuotantoketjussa. Ilmeisin tapa nostaa kotimaisen silakkakiintiön arvoa olisi käyttää siitä aiempaa suurempi osa perinteisiin elintarvikkeisiin, kuten kuluttajille myytäviin silakkafileisiin tai silakkapihvien raaka- aineena. Myös vaihtoehtoisia uusia tapoja hyödyntää esimerkiksi pienikokoista silakkaa elin- tarvikkeena on kehitetty (nyhtösilakkakonsepti). Sekä perinteisiä että innovatiivisempiä käyttöjä varten silakan laadun pitää olla erinomainen. Kala-alan yritykset ovat tuoneet markkinoille uusia kiinnostavia tuotteita, joissa raaka-aineena on käytetty vajaahyödynnettyjä kalalajeja. Mediassa on viime aikoina ollut paljon kirjoituksia ja ohjelmia, joissa on korostettu kotimaisen luonnonkalan roolia tärkeänä ympäristöystävällisenä ja herkullisena proteiinin lähteenä. Myös kuluttajien kiinnostus silakkaa, särkeä, lahnaa, yms. kohtaan vaikuttaa lisääntyvän. Aika vaikuttaakin kypsältä todelliseen kulutusmurrokseen; va- jaahyödynnettyjen kalojen nousuun varteenotettavaksi raaka-aineeksi elintarvikesektorille. Sa- maan aikaan kuitenkin sekä yrityskentästä että kuluttajilta on tullut viestiä muun muassa sila- koiden ja silakkatuotteiden liian heikosta laadusta ja säilyvyydestä. Jotta hyvää hetkeä silakoi- den ja särkikalojen menekin lisäämiseen ei menetetä, pitää varmistaa, että teollisuudelle on tarjolla hyvälaatuista raaka-ainetta ja kuluttajien ostamat tuotteet ovat viimeisenä käyttöpäi- vinäkin vielä riittävän laadukkaita. Blue Products haluaa osaltaan olla edistämässä silakan käy- tön edistämistä olemalla tukemassa yrityskenttää koko ketjun kattavassa laadun kehitystyössä. Jotta laatua voi parantaa, se pitää ensin muuttaa numeroiksi. Tässä raportissa benchmarkataan olemassa olevia kalan laadun määritysmenetelmiä kirjallisuudesta ja markkinoilta sekä arvioi- daan niiden soveltuvuutta kotimaisen kalasektorin käyttöön. Erityisesti tavoitteena on arvioida analyysimenetelmien soveltuvuutta silakan laadun mittaamiseen joko kalaketjun toimijoiden käytössä tai tutkimuksen apuvälineinä. Tietoa hyödynnetään suunniteltaessa silakoiden laadun parantamiseen tähtääviä koesarjoja. Raportissa myös arvioidaan, onko tarpeellista kehittää uu- sia (pika)menetelmiä tai muokata muihin sovelluksiin jo käytössä olevia menetelmiä soveltu- maan erityisesti silakan laadun tarkkailuun arvoketjun eri vaiheissa. Tämän raportin sisältöä esiteltiin Kalatalouden innovaatiopäivillä marraskuussa 2020. Ennen sitä muutama kalasektorin asiantuntija oli tutustunut aineistoon ja antanut asiantuntevaa pa- lautetta raportin sisällöstä. Raportin kirjoittajat kiittävät arvokkaasta palautteesta. Raportti on tuotettu osana Euroopan meri- ja kalatalousrahaston osarahoittamaa Blue Welfare Network – Blue Products -ohjelmaa, hankenumero 33338. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 9 2. Aistinvaraiset menetelmät 2.1. Johdanto Aistinvarainen arviointi on tärkeä työkalu kalan tuoreuden määrittämisessä, sillä kaikista laa- duntarkkailumenetelmistä se vastaa eniten tavallisen kuluttajan kokemusta tuotteen laadusta. Aistinvarainen arviointi voi myös olla nopeampaa ja joustavampaa kuin tuoreuden määritys laitteilla, eikä se välttämättä vaadi kalan "rikkomista". Arvioijien ”kalibrointi” on kuitenkin useimmissa menetelmissä välttämätöntä tarkkojen tuloksien saavuttamiseksi. Aistinvaraisen ar- vioinnin menetelmiä ovat erotustestit, laatuasteikolliset menetelmät, kuvailevat menetelmät ja miellyttävyyteen perustuvat testit. Tässä luvussa käsiteltyjen menetelmien pohjarajauksena on käytetty Alasalvarin ja muiden (2011) kirjan ”Handbook of seafood quality, safety and health applications” aistinvaraisten menetelmien listaa kirjan luvusta 2.2. Täydentävänä päälähteenä on käytetty Rehbeinin ja Ohenlenschlägerin kirjan ”Fishery Products - Quality, safety and aut- henticity” (2009) lukuja 19 ja 20. Erotustesteissä vertaillaan poikkeavaa (esimerkiksi toisella tavalla säilytettyä) ja vertailunäytettä (esimerkiksi vakio-olosuhteissa säilytettyä) näytettä. Erotustesteillä saadaan varsin vähän tietoa näytteistä työmäärään nähden, joten erotustestejä ei käsitellä tässä luvussa. Miellyttävyystes- teissä kuluttajat arvioivat näytteiden miellyttävyyttä yleensä 9-portaisella miellyttävyysas- teikolla. Menetelmä vaatii kuitenkin suuren arvioijamäärän, minkä vuoksi se ei sovellu nopeaan testaamiseen. Tämän takia miellyttävyystestejäkään ei käsitellä tässä luvussa. Laatuasteikollisiin ja kuvaileviin menetelmiin syvennytään alla. 2.2. Laatuasteikolliset menetelmät Laatuasteikollisiksi menetelmiksi kutsutaan kaikkia menetelmiä, joissa erilaisia aistinvaraisia ominaisuuksia kuvaillaan kategorisin laatuasteikoin, esimerkiksi erinomaisesta huonoon tai tuoreesta pilaantuneeseen. Laatuasteikollisilla menetelmillä voidaan tehokkaasti erotella laa- dultaan poikkeavat näytteet. Asteikko ei ole tasavälinen: esimerkiksi Torry-arviointimenetel- mässä arvojen 9 ja 10 väli on erisuuri kuin arvojen 6 ja 7. Laatuasteikollisissa menetelmissä myös usein lasketaan summia eri aistiominaisuuksien, kuten ulkonäön ja hajun saamien laatu- pisteiden välillä. Nämä ominaisuudet johtavat siihen, ettei laatuasteikollisilla menetelmillä voi tehdä tehokasta tilastollista tulkintaa, eikä menetelmiä voi yhdistää instrumentaalisiin mittauk- siin. (Martinsdóttir ym. 2009) Laatuasteikollisia menetelmiä, kuten laajasti käytössä olevaa laatupisteytysmenetelmä QIM:ä (engl. Quality Index Method), on kehittänyt erityisesti Tasmanian elintarviketutkimusyksikkö TFRU (engl. Tasmanian Food Research Unit) Australiassa (Sant’Ana ym. 2011). 2.2.1. Torry Sensory Scheme Torry-arviointimenetelmä (Torry Sensory Scheme) on Iso-Britanniassa Torry-tutkimusasemalla kehitetty systemaattinen pisteytysmenetelmä kalan tuoreuden arviointiin. Menetelmässä arvi- oidaan kalan hajua, makua, rakennetta, suutuntumaa ja ulkonäköä, joiden perusteella kalan tuoreudelle annetaan arvo asteikolla 3–10. Asteikolla 10 vastaa juuri pyydetyn kalan tuoreutta, ja 3 on ihmisravinnoksi kelpaamaton. Arvoa 5,5 voidaan pitää rajana syömäkelpoisuudelle (Nol- let & Toldra 2009). Pistemäärän perusteella on myös mahdollista arvioida, kuinka monta päivää Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 10 kalaa on säilytetty (jäissä). Torry-menetelmän tulosten havaittiin korreloivan kalan ihon säh- könjohtavuuden kanssa, jonka perusteella kehitettiin sähkönjohtavuuteen perustuva Torryme- ter-laite (Nollet & Toldra 2009). Koska eri kalalajit pilaantuvat eri tavalla, ja pilaantumisesta kertova piirre yhdessä kalalajissa ei välttämättä kerro siitä toisessa, Torry-menetelmän pisteytyksessä käytettävät parametrit ovat lajikohtaisia. Lajikohtaisia "karttoja" löytyy muun muassa turskalle, koljalle, kampelalle, makril- lille, taimenelle, lohelle, katkaravulle, ja sillille (saatavilla osoitteesta https://www.seafish.org/media/Publications/sensory_assessment_scoresheets_14_5_10.pdf). Menetelmä olisi sovellettavissa silakalle, mutta silakalle ei ole raportoitu omaa Torry-menetel- mää. Menetelmän pohjalta kehitetty Torrymeter-laite voisi kuitenkin olla suoraviivaisempi tapa tuoreuden mittaamiseen. 2.2.2. Quality Index Method (QIM) Laatuindeksimenetelmä QIM on alun perin TRFU:n kehittämä laatuasteikollinen menetelmä. QIM:ssä oletetaan, että jokainen laatuparametri on riippumaton muista parametreistä. Mene- telmässä kalan ominaisuuksille (iho, lima, silmät, vatsa, haju, kidukset) annetaan pisteitä välillä 0–3, ja lopuksi kaikkien parametrien pisteet lasketaan yhteen laatuindeksiksi (Quality Index, QI) (Nollet & Toldra 2009). Laatuindeksi ”0” tarkoittaa että kala on hyvin tuore ja korkeampi piste- määrä kertoo etenevästä laadun heikkenemisestä (Martinsdóttir ym. 2001). QI nousee lineaari- sesti kalan vanhetessa (QIM Eurofish). QIM, kuten Torry-menetelmäkin, on lajikohtainen. Laji- kohtaiset pisteytysparametrit on julkaistu useimmille kaupallisesti merkittäville kalalajeille, ku- ten sillille, turskalle, makrillille, piikkimakrillille, sardiinille, punasimpulle, silokampelalle, hieta- kampelalle, piikkikampelalle, punakampelalle, koljalle, seitille, merianturalle, kultaotsa-ahve- nelle, lohelle ja katkaravulle (Martinsdóttir ym. 2001). QIM on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä kalan tuoreuden aistinvaraisessa arvioinnissa. Myös QIM:n avulla voidaan arvioida kuinka pitkään kalaa on säilytetty jäissä, ja kuinka pitkään sitä voidaan vielä säilyttää (Nielsen & Hyldig 2004). Sitä voidaan käyttää esimerkiksi, kun halu- taan selvittää, miten eri käsittelytavat, prosessointi tai varastointi vaikuttavat kalan laatuun tai säilyvyyteen. QIM:n etuina ovat myös sen nopeus (kokeneet arvioijat voivat arvioida 40 kalaa 20 minuutissa) ja tarkkuus säilytyksen alkuvaiheessa, jolloin useimmat instrumentaaliset mene- telmät eivät pysty arvioimaan laatua tarkasti (Nollet & Toldra 2009 2010). QIM-menetelmän toimivuus on kuitenkin riippuvainen mm. siihen valituista aistinvaraisista parametreistä, näyte- koosta (arvioitavien kalojen lukumäärä) ja arvioijien kokeneisuudesta, joten eri tahojen samalle kalalajille kehittämissä QIM-menetelmissä saattaa esiintyä variaatiota (Bernardo ym. 2020). Suomessa on kehitetty QIM kasvatetun siian arviointiin (Järvelä 2011). Silakalle ei löydy aina- kaan julkisesti raportoitua QIM-menetelmää, joten sen käyttöönotto silakan tuoreuden arvioi- miseksi vaatisi menetelmän kehittämisen. QIM:n kehittäminen uudelle kalalajille, koostuu alku- testauksesta, luonnoksen testauksesta ja menetelmän validoinnista. Menetelmää kehitettäessä kaloja on arvioitava useana ajankohtana pyynnistä pilaantumiseen asti, ja tuoreuden arvioimi- sen apuna tulee käyttää esimerkiksi mikrobiologisia mittauksia. Menetelmää voidaan myös so- veltaa vain niissä säilytysolosuhteissa joille menetelmä on kehitetty (Järvelä 2011; Nollet & Tol- dra 2010). QIM:n käytön edistämiseksi lanseerattu QIM Eurofish (www.qim-eurofish.com) on julkaissut menetelmään perustuvan älypuhelinsovelluksen ”How fresh is your fish?” (Nofima Marin AS, Kuva 1). Sovellus on saatavilla 11 kielellä (ei suomeksi) ja 13 eri kalalajille. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 11 QIM-menetelmään perustuva "How fresh is your fish?" (Nofima Marin AS) älypuhe- linsovellus. Kuva julkaistu kehittäjän luvalla. 2.2.3. Muut laatuluokitusmenetelmät: European Union (EU) Grading Scheme, Evira 8001 Euroopan unionin neuvosto on antanut vuonna 1996 oman asetuksensa kalojen laatukritee- reistä (Council Regulation (EC) No 2406/96: Laying down Common Marketing Standards for Certain Fishery Products, 1996). Asetus keskittyy ensimmäistä kertaa myytävänä oleviin kala- tuotteisiin. Asetuksen menetelmä on laatuasteikko, jossa on luokat erinomainen, A, B, ja kel- paamaton. Asetuksessa on määritetty eri laatuluokitusten kuvailut kalaryhmittäin, eli esimer- kiksi sini- ja valkokaloille erikseen. Menetelmää on kritisoitu esimerkiksi siitä, ettei se ota kantaa kalalajien välisiin eroihin, eikä arviointiin ole tarjolla koulutusta tai käytännön opastusta (Mar- tinsdóttir ym. 2009). Esimerkiksi sardiinien suhteen on raportoitu, että neuvoston asetuksen menetelmällä saatiin eroteltua huonommin näytteiden säilytyslaatua kuin QIM-menetelmällä (Triqui & Bouchriti 2003). Elintarviketurvallisuusvirasto Eviralla, nykyisin Ruokavirastolla, oli oma laatuluokitukseen perus- tuva menetelmänsä (Evira 8001: Kalan aistinvarainen arviointi). Menetelmässä käytetään laa- tuasteikkoa 5–0, jossa ääripäät ovat 5 = erittäin hyvä ja 0 = ei kelpaa ihmisravinnoksi (Järvelä 2011). Menetelmää on käytetty muun muassa siian laadunseurantaan (Järvelä 2011). Mene- telmä on kuitenkin ollut vain Ruokaviraston sisäiseen käyttöön, ja aistinvaraisia menetelmiä ollaan ajamassa alas Ruokavirastossa näytteiden puutteen vuoksi (Tiina Ritvanen, henkilökoh- tainen viesti 27.4.2020). Muilla laatuasteikollisilla menetelmillä ei voi nähdä käyttöpotentiaalia Suomessa, vaan laatuin- deksimenetelmä on näitä kehittyneempi ja elinvoimaisempi. 2.3. Kuvailevat menetelmät Kuvailevissa menetelmissä näytteille, esimerkiksi eri tavalla kasvatettujen kirjolohien näytteille luodaan yhteinen, niiden hajua, ulkonäköä, makua ja rakennetta kuvaava sanasto. Sanastossa on yleensä 10–15 termiä, joilla näytteet voidaan erotella termien voimakkuuserojen perusteella. Arvioijina on tyypillisesti 6–15 hengen aisteiltaan testattu ja pitkälle koulutettu raati (Mar- tinsdóttir ym. 2009). Sanasto tarkennetaan yleensä kullekin näytetyypille erikseen ja valikoidaan Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 12 niin, että se selittää parhaiten näytteiden välisiä eroja. Kerralla voidaan arvioida 3–6 erilaista näytettä. Tällaisia menetelmiä pidetään yleisesti tarkimpina ja objektiivisinta aineistoa tuottavina aistin- varaisina menetelminä. Niillä tuotettua aineistoa voidaan myös tarkastella tehokkain tilastollisin menetelmin kuten varianssianalyysilla. Havaitut aistinvaraisten ominaisuuksien voimakkuudet voidaan samoin liittää erilaisiin instrumentaalisiin ja kemiallisiin mittaustuloksiin. Kääntöpuo- lena näiden menetelmien vaatima arvioijien valikointi, koulutusjaksot ja toistoarvioinnit johta- vat siihen, etteivät menetelmät toimi niin hyvin rutiininomaisissa tai kalastusvaiheen laadun- seurannoissa. Menetelmä soveltuu kuitenkin Suomessa erityisesti tarkempiin tutkimuksiin, sillä Suomessa on paljon kokemusta kuvailevien menetelmien käytöstä ja useita tarjolla olevia raa- teja. 2.3.1. Pääasialliset kuvailevat menetelmät Vuosien saatossa on kehitetty lukuisia kuvailevia menetelmiä, joita kaikkia on käytetty myös kalanäytteiden arviointiin. Nykyisin käytössä on erityisesti yleinen kuvaileva menetelmä (engl. generic descriptive analysis, GDA) sekä käyttöoikeuksiltaan rajoitetumpi kvantitatiivinen kuvai- leva menetelmä (engl. quantitative descriptive analysis, QDA), joka on rekisteröity tavaramerkki. Käytännön ominaisuuksiltaan nämä menetelmät ovat kuitenkin hyvin lähellä toisiaan. Näillä menetelmillä on kuvailtu ja eroteltu esimerkiksi siikanäytteitä (Suomela ym. 2016), turskanäyt- teitä (Sveinsdóttir ym. 2009), hammasahvennäytteitä (Rincón ym. 2016) ja kerralla useita Suo- melle merkittäviä kalalajeja, kuten silakka, ahven, kuha ja lahna (Luoma & Latva-Kala 1998). 2.3.2. Kuvailevat pikamenetelmät Kuvailevien menetelmien vaatiman pitkän koulutuksen ja sanaston kehittämisen vuoksi on ke- hitetty myös pikamenetelmiä, jotka perustuvat esimerkiksi näytteiden ryhmittelyyn tai vertaile- vaan luokitteluun. Menetelmissä ei tarvita erillistä sanastonkehitystä, ja lyhytkin raadin koulutus riittää. Suosituimpia pikamenetelmiä ovat tällä hetkellä CATA-menetelmä (engl. Choose All That Apply), sekä Projective Mapping -menetelmä. CATA-menetelmässä annetaan lista mah- dollisista näytettä kuvailevista ominaisuuksista, joista kuluttaja valitsee mielestään näytettä ku- vaavat. Kun vastaukset yhdistetään tilastollisesti, nähdään kyseisen kuluttajaotoksen mielestä tärkeimmät ominaisuudet kullekin näytteelle. Menetelmien lisäetuna on, että kerralla voidaan arvioida suurempi määrä näytteitä, yleensä 8–15 erilaista näytettä. Esimerkiksi CATA:lla on tehty yleiskatsaus 23 espanjalaisesta kalalajista neljässä arviointisessiossa (Lazo ym. 2016). Toisaalta arvioijien välisen suuremman hajonnan vuoksi raadin koon on oltava suurempi, eivätkä tulokset ole samalla tavalla kvantitatiivisia kuin perinteisissä menetelmissä. Pikamenetelmät sopivat kui- tenkin hyvin yleiskatsauksen saamiseen näytteistä sekä näytteiden seulontavaiheessa. 2.4. Instrumentaali- ja aistimenetelmien rajapinta 2.4.1. Artificial Quality Index (AQI) Artificial Quality Index method perustuu QIM-menetelmään, mutta aistinvarainen arviointi on korvattu instrumentaalisilla menetelmillä. Usein käytettyjä instrumentaalimenetelmiä AQI:n määrittämiseen ovat tekstuurianalysaattori, elektroninen nenä ja kolorimetri (Macagnano ym. 2005). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 13 AQI on alun perin kehitetty turskakaloille ja sen jälkeen myös sardiineille. Menetelmää ei ole raportoitu monille muille kalalajeille, ja menetelmä ei vaikuta olevan kovin yleisesti käytössä. AQI:n käyttökelpoisuus Suomessa, verrattuna QIM:in lienee kyseenalainen, sillä se vaatii kol- men eri instrumentin saatavuutta. AQI:n on kuitenkin havaittu korreloivan hyvin QIM:n kanssa, joten se soveltuu tilanteisiin, joissa koulutettuja arvioijia aistinvaraiseen arviointiin ei ole saata- villa. 2.5. Yhteenveto ja arvio aistinvaraisten menetelmien soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille Kalojen aistinvaraisen laadun tutkimuksessa on käytössä monenlaisia menetelmiä (Taulukko 1). Suomessakin kalojen kuvailevia profilointeja on tehty viime vuosituhannelta saakka. Tois- taiseksi silakalle on saatavilla hyvin rajallisesti aistinvaraista tutkimusaineistoa. Tähän suosituk- seen olemme valinneet menetelmät, joissa on riittävä teoreettinen pohja ja riittävä tieteellinen dokumentaatio niiden toimivuudesta sekä hyvä sovellettavuus tämän innovaatio-ohjelman tar- peisiin. Aistinvaraisten arviointimenetelmien suhteen on tunnistettu kaksi erilaista käyttötarkoitusta: 1) silakan laadun seuranta kalaketjun eri vaiheissa troolista kuluttajalle, ja 2) yksityiskohtaisempi menetelmä tutkimuksen sekä kalan menekin edistämisen käyttöön. Kalaketjun käyttöön tarvi- taan helposti omaksuttava ja mielellään älylaitteessa toimiva yksinkertainen numeerinen mit- tari. Tällaiseksi voisi soveltua silakalle kehitetty QIM-menetelmään perustuva älypuhelinsovel- lus, joka mukailee ”How fresh is your fish”-sovellusta. Tähän tarvitaan yhteistyökumppaniksi ohjelmistoyritys. Tutkimuskäyttöön soveltuu yleinen kuvaileva menetelmä GDA, jolla olisi tarpeen tehdä profi- lointi yleisimmille suomalaisille kalalajeille. Työn pohjana voidaan käyttää aiempaa tutkimus- materiaalia suomalaisista kalalajeista. Näiden kahden menetelmän lisäksi tarvitaan menetelmiä, joissa voidaan lisätä yleisön kiinnos- tusta kotimaisiin kalalajeihin. CATA-menetelmällä tuotettu aineisto sopii nähdäksemme tähän tarkoitukseen. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 14 Aistinvaraiset määritysmenetelmät. Menetelmä Soveltuvuus Hyödyt Haasteet Muuta Laatuindeksi (Quality Index Method, QIM) – Systemaattinen pisteytysmene- telmä kalan tuo- reuden arvioi- miseksi Laadunvalvonta- menetelmä tuo- reelle kalalle kala- ketjun eri vai- heissa troolista kuluttajalle •Selkeä, pisteytys kalan omi- naisuuksille (iho, lima, silmät, vatsa, haju, kidukset) •Indeksistä voidaan arvioida jäljellä olevaa säilytysaikaa •Nopea ja tarkka •Instrumentaalisia menetelmiä herkempi säilytyksen alkuvai- heessa •Lajikohtainen •Vaatii kehitystä joka kalalajille •Vaatii arvioijan koulutuksen •Ei vielä tehty sila- kalle Mitä vanhempi kala, sitä suu- rempi indeksiluku Menetelmään perustuen on kehi- tetty How Fresh is Your Fish - älypuhelinsovellus, joka on saatavilla 11 kielellä (ei suo- meksi) ja 13 eri kalalajille https://www.qim-eurofish.com/ Yleinen kuvai- leva menetelmä kalan aistinva- raisen laadun ar- vioimiseksi (Ge- neric descriptive analysis, GDA) Tutkimus, eri ka- lalajien aistinva- raisen profiilin ob- jektiivinen kuvaus (ei mieltymysku- vaus) •Erittelee näytteen aistittavat ominaisuudet •Mahdollistaa erilaisten näyt- teiden (esim. kalalajien) tarkan kuvailun ja erottamisen toisis- taan •Tulokset yhdistettävissä esim. kemiallisiin mittauksiin •Työläs •Vaatii koulutetun aistinvaraisen raa- din, koulutuksen ja sanaston kehittämi- sen •Näytemäärä rajalli- nen Menetelmällä kuvailtu ja eroteltu esimerkiksi siikanäytteitä, turska- näytteitä, hammasahvennäytteitä ja useita Suomelle merkittäviä kalalajeja, kuten silakka, ahven, kuha ja lahna Pikamenetelmä kalan kokonais- valtaisen kulut- tajalaadun arvi- oimiseksi (Choose All That Apply –CATA) Tutkimus, kulutta- jalaadun arviointi •Tunnistaa, mitkä ominaisuu- det kuluttaja kokee tärkeiksi •Mahdollistaa suurehkon näy- temäärän •Ei vaadi raatilaisten koulutta- mista •Vaatii suurehkon raadin •Laadullinen ana- lyysi, ei mitta-asteik- koa ominaisuuksien voimakkuuden mit- taamiselle Sopii yleiskatsauksen saamiseen näytteistä sekä näytteiden seu- lontavaiheessa Torry - syste- maattinen pistey- tysmenetelmä ka- lan tuoreuden ar- vioimiseksi Laadunvalvonta •Selkeä pisteytys 3–10, jossa pisteet kalan hajulle, raken- teelle, maulle, suutuntumalle ja ulkonäölle •Lajikohtainen, vaa- tii kehitystä joka ka- lalajille •Ei tehty silakalle Torrymeter-laite kehitetty tämän pohjalta, minkä seurauksena ais- tinvarainen menetelmä jäänyt käytöstä European Union (EU) Grading Scheme Laadunval- vonta/viranomais- valvonta •Selkeä laatuasteikko kalaryh- mittäin, jossa on luokat erin- omainen, A, B ja ihmisravin- noksi kelpaamaton. Perustuu EU:n asetukseen •Ei ota kantaa kala- lajien välisiin eroihin •Arviointiin ei ole tarjolla koulutusta tai käytännön opas- tusta •Huono erottelu- kyky verrattuna esim. laatuindeksi- menetelmään Kalan laatuluoki- tusmenetelmä / Ruokavirasto Viranomaisval- vonta •Laatuasteikko 5–0, jossa ääri- päät ovat 5 = erittäin hyvä, ja 0 = ei kelpaa ihmisravinnoksi •Vain Ruokaviras- ton sisäisessä käy- tössä Ruokavirasto ajaa menetelmää alas (näytteiden puutteessa) Näytteiden ryh- mittely ja keski- näinen vertailu (Projective map- ping) Tutkimus, kulutta- jalaadun arviointi •Tunnistaa, mitkä ominaisuu- det kuluttaja kokee tärkeiksi •Mahdollistaa suurehkon näy- temäärän •Ei vaadi raatilaisten pitkää kouluttamista •Pystyy havainnollistamaan näytteiden samankaltaisuuksia tai eroja •Vaatii suurehkon raadin •Laadullinen ana- lyysi, ei mitta-asteik- koa ominaisuuksien voimakkuuden mit- taamiselle •Työläämpi kuin CATA sekä arvioi- jalle että tutkijalle •Vaatii enemmän koulutusta kuin CATA Sopii yleiskatsauksen saamiseen näytteistä sekä näytteiden seu- lontavaiheessa Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 15 3. Kemialliset ja biokemialliset menetelmät 3.1. Johdanto Muutokset eläinten biokemiallisessa koostumuksessa kuoleman jälkeen aiheuttavat muutoksia rakenteessa ja aistittavissa ominaisuuksissa, ja näitä muutoksia mittaamalla voidaan arvioida kalan tuoreutta (Kuva 2). Suurimmat muutokset liittyvät adenosiinitrifosfaatin (ATP) ja sen ha- joamistuotteiden, biogeenisten amiinien, myoglobiinin ja sen hapettumistuotteiden määriin, sekä rasvahappojen hapettumiseen. Kalan rakenteeseen vaikuttavat merkittävästi myös prote- iinien hajoaminen entsymaattisen toiminnan seurauksena ja sitä seuraavat muutokset kudos- ten vedensitomiskyvyssä. Biokemialliset muutokset kalan laadussa säilytyksen aikana. Muutokset voidaan jakaa biologisiin, entsymaattisiin ja kemiallisiin muutoksiin. Näihin luetaan muutokset adenosiinitri- fosfaatin (ATP) ja sen hajoamistuotteiden (näistä lasketaan K-arvo), haihtuvan kokonaistypen (TVB-N), trimetyyliaminin (TMA), vapaiden rasvahappojen (FFA), emäksisten typpiyhdisteiden (TBA), amiinien ja mikrobien määrissä. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 16 Yksi ensimmäisistä muutoksista eläimen kuoleman jälkeen on muutokset ATP:n määrissä. ATP on runsasenerginen yhdiste, joka osallistuu lihassolujen supistumisliikkeeseen. Kuoleman jäl- keen lihasten hermosolut eivät enää lähetä supistumiskäskyjä, mutta ATP:ta käytetään soluissa vielä moniin energiaa vaativiin tehtäviin. ATP:n määrää pidetään aluksi yllä glykolyysin avulla eli hajottamalla glukoosia. Glykolyysin ylläpitoon riittävä aika riippuu lihaskudoksen varastohii- lihydraatin glykogeenin määrästä: jos eläin on stressaantunut kuolemaa edeltävänä aikana sen lihasten glykogeenivarastot ovat ehtyneet ja glykolyysi pysähtyy aiemmin. Jos taas lihasten gly- kogeenivarastot ovat normaalit, ATP:n muodostuminen glykolyysin kautta kestää pidempään. Kun glykolyysissa muodostuva maitohappo laskee lihaksen pH:n 5–5,5:een, glykolyyttisten ent- syymien aktiivisuus lakkaa ja ATP:ta ei enää muodostu. Tällöin muodostuu lihassoluissa niin kutsuttu rigor-kompleksi. ATP:n puuttuessa proteiinit eivät palaudu supistuksesta vaan jäävät kangistuneeseen tilaan, jota kutsutaan kuolonkankeudeksi (rigor mortis). (Coultate 2015) Kuolemanjälkeiset värinmuutokset lihassa ja kalassa selittyvät osittain myoglobiinin hapettu- misella metmyoglobiiniksi ja oksimyoglobiiniksi. Myoglobiini antaa lihalle ja kalalle kirkkaan- punaisen värin, mutta sen pitoisuudet vaihtelevat kalalajin mukaan. Esimerkiksi silakassa on turskaa enemmän niin kutsuttua tummaa lihaskudosta, joka sisältää suuremman myoglobii- nipitoisuuden lisäksi myös enemmän rasvaa vaaleaan lihaskudokseen verrattuna. Tumma lihas- kudos on tärkeä fysiologinen piirre avomeren kaloissa, koska sen sisältämät rasvasolut ja myo- globiini mahdollistavat pitkäaikaisen liikkeellä pysymisen. Kun kudoksen happipitoisuus laskee kuoleman jälkeen, myoglobiini hapettuu metmyoglobiiniksi. Metmyoglobiinin väri on ruskean- punainen, ja sen muodostuminen kielii pilaantumisesta. Rautaionin hapettuessa muodostuu myös vapaa radikaali, joka voi aloittaa lipideissä hapettumisketjureaktioita, jotka puolestaan huonontavat kalan laatua nopeasti. (Coultate 2015) Rasvojen hapettuminen on yksi merkittävimmistä pilaantumisreaktioista kalassa ja suuri tyy- dyttymättömien rasvahappojen määrä edesauttaa hapettumisreaktioiden syntyä. Silakka on rasvainen kala, jossa on etenkin runsaasti tyydyttymättömiä omega-3-rasvahappoja. Rasvojen hapettumisessa muodostuvia ensisijaisia tuotteita ovat hydroperoksidit, joiden määrää voidaan mitata peroksidilukumäärityksellä. Hydroperoksidit eivät vaikuta aistittaviin ominaisuuksiin, mutta ne hajoavat toissijaisiksi hapettumistuotteiksi, jotka puolestaan aiheuttavat erilaisia epä- miellyttäviä hajuja sekä kellertävää väriä kalan kudoksessa. Useat muodostuvat aldehydit ovat niin kutsuttuja tiobarbituurihappo-reaktiivisia aineita (thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS), joita voidaan mitata tiobarbituurihapon avulla hapettumisasteen määrittämiseksi (Huss 1995). Sillin rasvojen hapettumistuotteissa nähdään merkittäviä nousuja jo 2–3 päivän jäässä säilytyksen jälkeen ja pilaantuminen voidaan havaita haistamalla jo 2,5 päivän jälkeen. Pilaantuneen hajun kanssa korreloivat tutkimuksen mukaan parhaiten (r = 0,97) peroksidiluvun mittaustulokset, jota käytetään standardimenetelmänä rasvojen hapettumisen analysoinnissa (Undeland ym. 1999). 3.2. Maitohapon ja pH:n mittaus Kuten edellisessä kappaleessa kerrottiin, glykolyysissä muodostuu maitohappoa, joka laskee lihaksen pH-arvoa. Esimerkiksi elävän turskan normaali pH on 6,8, mutta se putoaa kuoleman jälkeen 6,1–6,5:een. pH ja maitohappokonsentraatiot voivat kalalajin lisäksi vaihdella myös kuo- lemaa edeltävien olosuhteiden vuoksi. Stressaantuneella tai sairaalla eläimellä on alkujaan vä- hemmän glykogeeniä eli varastohiilihydraattia kudoksissaan, mikä johtaa kuoleman jälkeen suurempaan pH:n alenemaan verrattuna ei-stressaantuneeseen yksilöön. pH:n lasku muuttaa eläimen fysiologista rakennetta: proteiinien ionivaraukset muuttuvat johtaen osittaiseen dena- Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 17 turoimiseen, jolloin niiden vedensidontakyky laskee (Huss 1995). Usean päivän säilytyksen jäl- keen kudoksen pH alkaa taas nousta, kun hajottajamikrobien toiminnasta muodostuu emäksi- siä aineenvaihduntatuotteita. Kudoksen pH on helppo määrittää pH-elektrodilla veden kanssa (5:1) homogenoidusta kudosnäytteestä (Kyrana & Lougovois 2002). Kudoksen laktaatti eli maitohappopitoisuus voidaan määrittää esimerkiksi Boehringer-Mann- heimin Lactate UV-testillä. Kudosnäyte säilötään nestemäiseen typpeen, ja ennen testiä ho- mogenisoidaan huhmareen avulla nestemäisessä typessä. Lihasnäytettä punnitaan pieni määrä (40–80 mg), ja sekoitetaan 1 mL:aan 0,6 N perkloorihappoa ja sentrifugoidaan. Määritys suori- tetaan supernatantista Boehringer-Mannheimin testipakkauksen mukaan UV-spektrofotomet- rillä. (Ruoppa 1982) 3.3. Entsyymiaktiivisuuksien mittaus Kudosten entsyymiaktiivisuudet kokevat suuria muutoksia kuolemanjälkeisenä aikana ja näitä muutoksia seuraamalla voidaan myös arvioida kalan tuoreutta. Entsyymit voivat olla joko ku- doksessa itsessään löytyviä tai mikrobien tuottamia. Esimerkiksi 5’-nukleotidaasi on bakteerien tuottama entsyymi, jonka lisääntyminen kertoo bakteerien määrän kasvusta (Yoshioka ym. 2019). Tuoreuden mittaamiseen voidaan käyttää ainakin seuraavien kudoksessa itsessään esiin- tyvien entsyymien aktiivisuuksia: laktaattidehydrogenaasi (LDH), koliiniesteraasi, aspartaat- tiaminotransferaasi (ASAT), alaniiniaminotransferaasi (ALAT/GPT), delta-aminolevuliinihappo- dehydrataasi (ALA-D), beta-glukuronidaasi (BG) ja UDP-glukuronosyylitransferaasi (UDPGA) (Ruoppa, 1982). Laktaattidehydrogenaasin aktiivisuuden on osoitettu vähenevän kylmäsäily- tyksen aikana useissa kalalajeissa (Nambudiri & Gopakumar 1992) ja sen mittaamiseen löytyy nykyään kaupallisia kittejä (esim. Fish Lactate Dehydrogenase (LDH) ELISA Kit, MyBioSource, Inc., CA, USA). Kudosnäyte homogenoidaan fosfaattipitoisen puskuriliuoksen kanssa ja sentri- fugoidaan. Supernatanttia pipetoidaan pieni määrä näytekaivoon. Toiseen kaivoon pipetoidaan kitin mukana tulevaa standardiseosta ja kolmanteen näytteen homogenointiin käytettyä pus- kuria nollanäytteeksi. Kaivoihin lisätään HRP-konjugaattia ja inkuboidaan tunti 37 °C:ssa. Kaivot pestään kitin mukana tulevalla pesuliuoksella, jonka jälkeen kaivoihin lisätään kahta kromogee- nistä liuosta ja inkuboidaan 15 minuuttia 37 °C:ssa. Reaktiot pysäytetään pysäytysliuoksella ja näytteiden värin pitäisi vaihtua sinisestä keltaiseksi. Kaivot kuvataan kuoppalevylukijalle 450 nm aallonpituudella 15 minuuttia pysäytysliuoksen lisäämisen jälkeen. 3.4. Rasvojen ja proteiinien hapettuminen Yleisimpiä rasvojen hapettumisen mittaamiseen käytettäviä menetelmiä ovat hydroperoksidilu- vun (PV), tiobaribituurireaktiivisten yhdisteiden (TBARS) ja para-anisidiiniluvun (AV) määrittä- miset. Peroksidilukumääritys mittaa primääristen hapettumistuotteiden määrän ja korkea mit- taustulos kertoo korkeasta hapettumisasteesta. Hydroperoksidit hajoavat kuitenkin ajan mit- taan sekundäärisiksi hajoamistuotteiksi, joten säilytyksen edetessä PV-arvo alkaakin laskea. PV- arvon mittaamiseen on kaksi yleistä menetelmää: jodipitoisella reagenssilla titraaminen (AOCS Official Method Cd 8b-90) sekä spektrofotometrinen menetelmä, jossa käytetään rauta(III)tio- syanaattia (Wagner ym. 1947). Monet sekundääriset hapettumistuotteet reagoivat tiobarbituu- rihapon kanssa muodostaen punertavan värin, joka mitataan spektrofotometrillä. Näiden me- netelmien rinnalla voidaan käyttää vielä anisidiinilukumääritystä (AOCS Official Method Cd 18- 90), joka perustuu peroksidien hajoamistuotteiden määritykseen. Määrityksessä aldehydit ja Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 18 ketonit reagoivat anisidiinireagenssin kanssa ja värimuutos mitataan spektrofotometrillä. Teol- lisuudessa hapettumista kuvataan yleisesti TOTOX-arvolla, joka lasketaan peroksidi- ja anisidii- nilukujen avulla. Näin otetaan huomioon sekä primäärinen että sekundäärinen hapettuminen. Proteiinien hapettuminen on monimutkainen ilmiö, jota on tutkittu vähemmän kuin rasvojen hapettumista. Ajatellaan, että proteiinien hapettuminen tapahtuu rinnakkain rasvojen hapettu- misen kanssa. Voi myös olla, että primääriset lipidien hapettumistuotteet lisäävät proteiinien hapettumista, etenkin kylmäsäilytyksen aikana. Proteiinien hapettuminen huonontaa kalan laa- tua muuttamalla lihasten rakennetta ja vähentämällä niiden vedensidontakykyä ja siten me- hukkuutta. Proteiinien hapettumista voidaan mitata esimerkiksi karbonyyliryhmien avulla, joita muodostuu happiradikaalien toiminnan seurauksena. Eräässä menetelmässä proteiiniliuokseen lisätään 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia (DNPH) ja lyhyen inkuboinnin jälkeen natriumhydroksi- dia. Absorbanssi luetaan spektrofotometrillä ja tulokset voidaan laskea, kun tiedetään DNPH:n absorptiivisuus karbonyyliryhmille (Mesquita ym. 2014). 3.5. K-arvoon perustuvat menetelmät Kuolonkankeus laukeaa, kun elimistön soluihin varastoituneet entsyymit alkavat hajottaa pro- teiineja. Kaloilla rigor mortis on ohi muutamassa tunnissa kalalajista riippuen. Kuolonkankeus heikentää kalan leikattavuutta huomattavasti ja kala pyritään käsittelemään joko ennen kuo- lonkankeuden alkamista, tai sen loputtua. Entsyymit alkavat pilkkoa myös ATP:ia sen hajoamis- tuotteiksi (adenosiinidifosfaatti (ADP), adenosiinimonofosfaatti (AMP), inosiinimonofosfaatti (IMP), inosiini (Ino) ja hypoksantiini (Hx)), joilla on puolestaan merkittävä rooli kalan laadun huonontumisessa. Esimerkiksi hypoksantiinilla on todettu suora yhteys pilaantuneen kalan kar- vaan maun kanssa (Hughes & Jones 1966). ATP:n hajoaminen tapahtuu saman kaavan mukai- sesti kaikissa kalalajeissa, joskin hajoamisen nopeus vaihtelee lajeittain. Tästä syystä kalan tuo- reuden mittarina voidaan käyttää niin kutsuttua K-arvoa, joka lasketaan seuraavan kaavan mu- kaisesti: 𝐾𝐾% = [𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼] + [𝐻𝐻𝐻𝐻][𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴] + [𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴] + [𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴] + [𝐼𝐼𝐴𝐴𝐴𝐴] + [𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼] + [𝐻𝐻𝐻𝐻] 𝐻𝐻 100 K-arvo on todettu myös tutkimuksessa hyväksi tavaksi arvioida silakan laatua, sillä tuoreen ka- lan K-arvo eroaa 95 % varmuudella kolme päivää tai sitä pidempään säilytetystä kalasta. Arvot ovat myös hyvin verrattavissa aistinvaraisen arvioinnin tuloksiin (Ritvanen 2001). Kalastustavan vaikutusta silakan laadulle on tutkittu mittaamalla ATP:n hajoamistuotteita. Hat- tula ym. (1995) selvittivät troolauksella, avoverkolla ja avorysällä pyydystettyjen silakoiden laa- tueroja. Avoverkolla pyydystettyjen silakoiden rigor mortis alkoi aiemmin ja IMP-arvot olivat alhaisemmat kuin troolauksella tai rysällä kalastettujen silakoiden, mikä viittaa huonompaan laatuun. Yksi tunnetuimmista K-arvon määrittämiseen käytetyistä menetelmistä on korkean erotuskyvyn nestekromatografiaan (HPLC) perustuva erotusmenetelmä, jossa ATP ja sen johdannaiset uu- tetaan perkloori- tai trikloorietikkahapolla ja neutralisoidaan ennen ajoa (Ryder 1985). Mene- telmä on kuitenkin verrattain hidas ja vaatii kromatografialaitteiston, ja sen tuntevan henkilön. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 19 3.5.1. Kaupalliset laitteet Tao ja Sato (2013) ovat kehittäneet K-arvon mittaamiseen nopeamman elektroforeesipaperiin ja UV:n mittaamiseen perustuvan menetelmän, joka on myös kaupallisesti saatavilla tuoteni- mellä “Freshness Checker”, QS-Solution, Japani. ATP ja sen hajoamistuotteet uutetaan suola- hapolla ja homogenisoidaan, jonka jälkeen näyte sentrifugoidaan. Supernatanttia pipetoidaan pieni määrä elektroforeesipaperille, jonka jälkeen yhdisteet erotellaan sähkövirran avulla. Ero- tuksen jälkeen paperi kuivatetaan ja valaistaan ultraviolettisäteiden avulla, jolloin yhdisteiden muodostamat täplät näkyvät sinisinä. Paperi kuvataan digitaalisella kameralla ja kuvan tulokset ja analysoidaan tietokonesovelluksen avulla. K-arvo määritetään täplien tuottamien intensiteet- tien avulla. K-arvon mittaamiseen on kehitetty myös toinen kaupallinen kitti (PRECICE® Freshness Assay Kit, NovoCIP, Lyon, Ranska), jossa muodostetaan entsyymireaktiolla IMP:sta, inosiinista ja hy- poksantiinista nikotiinidiamiinidinukleotidia (NADH2), jonka muodostumista seurataan absor- banssimittauksen avulla (Kuva 3). Näyte käsitellään keittämällä, jonka jälkeen lisätään pieni määrä suodatettua uutetta kuoppalevylle. Kuoppiin lisätään kaupallista entsyymiseosta, jonka jälkeen absorbanssit luetaan spektrofotometrillä (340 nm). Näytteenkäsittelyn hinnaksi ilmoi- tetaan sivustolla <12 €/näyte. Lisäksi kuoppalevyllä voidaan analysoida 31 näytettä samanai- kaisesti. Menetelmä on yksinkertainen, mutta laitteen saatavuudesta ei ole tietoja, sillä valmis- tajan nettisivuja ei ole päivitetty vuoden 2014 jälkeen. Laitetta on kuitenkin käytetty vuonna 2019 julkaistussa tieteellisessä artikkelissa, jossa K-arvoa ei kuitenkaan pidetty yhtä luotetta- vana laadun mittarina kuin esimerkiksi laatuasteikollista menetelmää (QIM) tai kvantitatiivista kuvailevaa menetelmää (QDA). (Fogarty ym. 2019a) Kaavio kaupallisen K-arvon mittaukseen perustuvan testauskitin (PRECICE® Freshness Assay Kit, NovoCIP, Ranska) näytteenkäsittelystä. Kuva julkaistu NovoCIP:n luvalla. 3.6. Trikloorietikkahappoon liukenevat peptidit Proteiinien pilkkoutuminen post mortem -tilassa on myös yksi kalan rakennetta heikentävä te- kijä. Proteiinit pilkkoutuvat peptideiksi sekä kudoksessa itsessään esiintyvien että mikrobien Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 20 tuottamien proteaasien eli proteiineja pilkkovien entsyymien toiminnan seurauksena. Pilkkou- tumista voidaan seurata esimerkiksi tarkkailemalla trikloorietikkahappoon liukenevien pepti- dien muodostumista varastoinnin aikana (Rawdkuen ym. 2010). Peptidien määritys on nopeaa eikä vaadi kalliita investointeja. Pieni määrä kalaa homogenoidaan trikloorietikkahapon kanssa ja viilennetään, jonka jälkeen se sentrifugoidaan ja peptidien määrä mitataan spektrofotomet- rillä käyttäen Lowryn menetelmää (Lowry ym. 1951). Tulokset ilmoitetaan muodossa µmol ty- rosiinia /g lihaskudosta (Zhuang ym. 2020). Menetelmä ei vaadi kalliita investointeja ja se so- veltuu etenkin laboratoriotutkimuksiin. Silakan tutkimukseen peptidien mittausta ei ole vielä hyödynnetty, ja menetelmä pitäisikin ensiksi kalibroida juuri silakalle sopivaksi mittaamalla pi- laantumista myös muiden parametrien osalta. 3.7. Kemosensitiiviset yhdisteet Biogeeniset amiinit ovat emäksisiä typpipitoisia aineenvaihduntatuotteita, joita muodostuu esi- merkiksi aminohappojen hajotessa. Kalassa amiinit muodostuvat sekä endogeenisten entsyy- mien hajottaessa aminohappoja että mikrobien toiminnan seurauksena, joista jälkimmäisellä on huomattavasti suurempi rooli niiden muodostumisessa. Elintarvikkeissa esiintyviä amiineja ovat muun muassa histamiini, putreskiini, kadaveriini, tyramiini, tryptamiini, β-fenyylietyyli- amiini, spermiini sekä spermidiini. Näistä histamiini, kadaveriini ja putraskiini ovat etenkin me- renelävissä yleisiä diamiineja, jotka muodostuvat tiettyjen aminohappojen dekarboksylaatiosta post mortem -tilassa. Ammoniakki, trimetyyliamiini (TMA) ja dimetyyliamiini (DMA) ovat yleisiä pilaantumisesta kertovia yhdisteitä, joista käytetään yhdessä termiä haihtuva kokonaistyppi (total volatile base nitrogen, TVB-N). TVB-N on yleinen kalan pilaantumisen seurannassa mi- tattu yhdiste. (Rehbein & Oehlenschläger 2009) Kemosensitiiviset eli kemiallisen ympäristön vaihteluille herkät yhdisteet mahdollistavat no- pean ja noninvasiivisen pilaantumisen tarkkailun. Nämä yhdisteet reagoivat tyypillisiin pilaan- tumisessa muodostuviin yhdisteisiin, kuten TMA:han, DMA:han, kadaveriiniin ja putreskiiniin. Zaragoza ym. (2012) tutkivat hammasahvenen säilyvyyttä 4 °C:ssa 11 päivän ajan. Eri yhdistei- den värimuutoksista, ja fysiokemiallisista kokeista (kosteusprosentti, TVB-N, valumahävikki, En- terobacteriaceae-bakteerien määrä, ATP:n kaltaisten yhdisteiden määrät sekä K-arvo) tehtiin peruskomponenttianalyysi, joka mahdollisti näytteiden jakamisen neljään ryhmään: ensimmäi- seen ryhmään kuuluivat mittaustulokset 0, 2 ja 4 päivien kohdalla ja toiseen, kolmanteen ja neljänteen ryhmään mittauspäivät 7, 9 ja 11. Mallin avulla voidaan siis ennustaa, mihin ryhmään kalanäyte kuuluu kemosensitiivisten yhdisteiden värimuutosten perusteella. Kovin tarkkaa säi- lytysaikaa mallilla ei kuitenkaan voitu määrittää, vain noin kahden päivän tarkkuudella. Silakalle tällaista analyysia ei ole tehty, joten menetelmän käyttöönotto vaatisi ensin peruskomponent- tianalyysin kaltaisen mallin luomisen, jotta värireaktioita perusteella voidaan määrittää kalan tuoreus. Lisäksi värianturimenetelmä olisi sopiva vain kylmäsäilytyksen seuraamiseen, kun kala on suljetussa pakkauksessa, eli lähinnä elintarvikeketjussa vasta pakkauksen jälkeen. Toisaalta älypakkaukset herättävät kuluttajissa kiinnostusta ja ne saattavat yleistyä tulevaisuudessa. Toisen tutkimuksen mukaan kemosensitiivisten yhdisteidän värin intensiteetin kasvu korreloi suoraan perinteisten pilaantumisten mittareiden eli pH:n ja tiobarbituurihappo-reaktiivisten ai- neiden määrien muutosten kanssa. Useita kemosensitiivisiä yhdisteitä injektoitiin silikonigee- lille, jotka asetettiin suljetun astian kanteen sisäpuolelle säilytyskokeen ajaksi. Eri yhdisteiden intensiteetit vaihtelivat säilytysolosuhteiden, kuten lämpötilan mukaan, joten tarkimmat tulok- set saadaan yhdistelemällä mittauksessa useita yhdisteitä matriisiksi verrattuna yhden väriyh- disteen käyttöön. Kun tutkimuksessa käytetty säilytyslämpötila oli 4 °C, suurimmat signaalin- muutokset antavat yhdisteet olivat rosolihappo, kresolipunainen, alitsariini, metyylipunainen, Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 21 kristalliviolettilaktoni, ksylenoli (sininen), bromifenolisininen sekä bromikresolivihreä. (Morsy ym. 2016). Värimuutoksiin perustuva mittaustapa mahdollistaa säilyvyysmäärityksen lisäämisen suoraan elintarvikepakkaukseen, mutta se ei ole toimiva menetelmä laadunvalvontaan tai tuo- reuden määrittämiseen kalastusaluksilla tai lajittelussa. 3.8. Haihtuvien amiinien mittaus P3HT-sensorilla Orgaanisia puolijohteita voidaan käyttää hyväksi haihtuvien typpiyhdisteiden analyysissä. Chang ym. (2017) kehittivät menetelmän (Kuva 4), jossa anturi koostuu 40 nm paksuisesta puo- lijohtavasta P3HT-polymeeristä (poly-(3-heksyylitiofeeni)). Alapuolen elektrodi on puolestaan indiumtinaoksidia (ITO) ja yläpuolen elektrodi on huokoista alumiinia. Biogeenisten amiinien ja P3HT:n välinen pelkistysreaktio johtaa sähkönjohtavuuden heikkenemiseen, joka voidaan ha- vaita. P3HT-sensori voi mitata kuivasta ilmasta alimmillaan 100 ppb ammoniakkipitoisuuden. Laitteen antama signaali muodostuu kuitenkin ammoniakin, DMA:n ja TMA:n yhteispitoisuuk- sista. Sensorin lisäksi mittalaitteisto koostuu kaasuputkesta, kuivatussylinteristä ja pumpusta, joka kontrolloi kaasujen virtausnopeuksia. Yhtä määritystä varten tarvitaan noin gramma lihas- näytettä, mutta näyte pitäisi ottaa aina samasta kohdasta, jotta mittaustulokset ovat luotetta- via. Menetelmän nopeus ja helppokäyttöisyys mahdollistaisivat sen käytön rutiinianalyyseissä, mutta se ei ole vielä kaupallisesti saatavilla. Herkkä P3HT-sensori tunnistaa haihtuvat amiinimolekyylit, kuten ammoniakin (engl. ammonia), dimetyyliamiinin (DMA) ja trimetyyliamiinin (TMA) raa’asta kalasta minuutissa. Yh- disteet aiheuttavat muutoksen sähkönjohtavuudessa, joka voidaan mitata. Kuva: Chang ym. (2017). Kuvan julkaisu ABC Publicationin luvalla. 3.9. Arvio soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille Taulukossa 2 on esitetty koonti biokemiallisista menetelmistä, jotka on esitelty tässä raportissa. Biokemiallisista menetelmistä K-arvon mittaukseen perustuvat kaupalliset pikamenetelmät Biokemiallisista menetelmistä pH:n mittaus, peroksidiluku, para-anisidiiniluku ja näistä laskettu TOTOX (engl. Total Oxidation Products) ovat tunnettuja ja laajasti käytettyjä menetelmiä. pH:n mittaus on nopeaa, joskin se pitäisi kalibroida silakalle. Peroksidi ja para-anisidiinilukujen mit- tauksiin löytyy virallisia menetelmiä, mutta ne vaativat näytteenkäsittelyä ja soveltuvat parem- min tutkimukseen kuin nopeaan laadunvalvontaan. K-arvon mittaukseen perustuvat kaupalliset pikamenetelmät kuten ”Freshness checker” ja ”PRECICE® Freshness Assay Kit” soveltuvat ka- Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 22 laketjun alkupäähän laadunvalvontaan ja tuoreuden arviointiin. Kyseiset menetelmät ovat help- pokäyttöisiä ja nopeita, joskin laitteiden ja kittien saatavuudesta ei ole kirjoitushetkellä var- muutta. Pakattujen kalatuotteiden laadun seurantaan sopivat puolestaan erilaiset värimuutokseen pe- rustuvat sensorit, jotka viestivät kalan laadusta sekä kuljetuksen että säilytyksen aikana. Kemo- sensitiivisiä sensoreita ei ole saatavilla valmiina, vaan ne vaatisivat kehitystyötä kullekin kalala- jille ja tuotteelle, jotta värimuutoksen signaalin voimakkuus saadaan kalibroitua vastaamaan juuri kyseisen tuotteen laatua. Tutkimuksessa ja uusien menetelmien validoinnissa voidaan käyttää tunnettuja ja luotettavia laadunmittausmenetelmiä, kuten nestekromatografiaan pohjautuvaa K-arvon määritystä, edel- lämainittuja peroksidi- ja para-anisidiinilukumäärityksiä, tiobarbituurihapporeaktiivisten ainei- den määritystä sekä trikloorietikkahappoon liukenevien peptidien mittausta. Näitä laborato- riomenetelmiä voitaisiin siis käyttää uusien menetelmien kalibroinnissa, ja näihin menetelmiin käytettävät reagenssit ja laitteistot ovat yleisesti saatavilla elintarvikealan laboratorioissa. Kemialliset ja biokemialliset menetelmät Menetelmä Soveltuvuus Hyödyt Haasteet Muuta pH:n mittaus pH laskee kalan kuo- leman jälkeen, kun ensin muodostuu mai- tohappoa ja alkaa nousta, kun mikrobit muodostavat emäksi- siä aineenvaihdunta- tuotteita Laadunvalvonta •Nopea •Edullinen •Näytteenkäsittelyksi riit- tää kalanäytteen ho- mogenointi veden kanssa •pH:n yhteys laatuun täy- tyy mallintaa silakalle erik- seen •pH laskee kalan kuole- man jälkeen ja nousee taas uudestaan hajoami- sen edetessä: kertooko mittaustulos, että kala on todella tuore, vai jo monta päivää vanha? •pH:n yhteys laatuun täy- tyy mallintaa silakalle erik- seen •pH laskee kalan kuole- man jälkeen ja nousee taas uudestaan hajoami- sen edetessä: kertooko mittaustulos, että kala on todella tuore, vai jo monta päivää vanha? Laktaattidehydro- genaasin (LDH) mit- tauskitti Mittaa LDH:n (ent- syymi) määrää Tutkimus •Valmiita testikittejä saata- villa •Tarkkuutta vaativa näyt- teenkäsittely •Kitit ovat kalliita •Vaatii ELISA-kuoppalevy- lukijan •Vaatii myös kalibroinnin silakalle Peroksidiluvun mää- ritys Mittaa primäärisiä ha- pettumisyhdisteitä, pääasiassa peroksi- deja Tutkimus ja laa- dunvalvonta •Yleinen rasvojen hapettu- misesta kertova mene- telmä •Spektrofotometriä hyö- dyntävä menetelmä on no- pea Anisidiiniluvun mää- ritys Mittaa sekundäärisiä hapettumisyhdisteitä, kuten aldehydejä ja ketoneja Tutkimus ja laa- dunvalvonta •Spektrofotometriä hyö- dyntävä menetelmä on no- pea •Myrkyllinen reagenssi •Sopii käytettäväksi pe- roksidilukumäärityksen rin- nalla TOTOX Lasketaan peroksidilu- vun ja anisidiiniluvun avulla Tutkimus ja laa- dunvalvonta •Kertoo kokonaishapettu- misasteen •Yleisesti käytössä teolli- suudessa, etenkin öljyjen hapettumisen mittaami- seen • Työläs, sillä vaatii sekä peroksidiluvun että anisi- diiniluvun mittaamisen •Laskukaava: TOTOX = AV + 2 x PV Freshness Checker, QS-Solution, Japani Laadunvalvonta •Nopea •Helppo näytteenkäsittely •Saatavuus •Ei ole ajantasaista tietoa laitteen saatavuudesta Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 23 Mittaa k-arvoa, joka liittyy ATP:n hajoamis- tuotteisiin (https://www.qs-solu- tion.jp/english/index.html) PRECICE® Fresh- ness Assay Kit, No- voCIP, Lyon, Ranska Mittaa k-arvoa, joka liittyy ATP:n hajoamis- tuotteisiin Laadunvalvonta, tutkimus •Nopea •Saatavuus •Tutkimuksen mukaan ei yhtä luotettava kuin laa- tuasteikolliset menetelmät •22:n näytteen kitti mak- saa 480 € (http://www.no- vo- cib.com/Freshness_Princi- ple.html) Trikloorihappoon liu- kenevien peptidien mittaus Mittaa tiettyjä pepdi- tejä, eli proteiinien ha- joamista Tutkimus •Nopea •Vaatii ”kalibroinnin” sila- kalle •Vaatii spektrofotometrin Kemosensitiiviset yhdisteet Mittaa pilaantumi- sessa muodostuvia haihtuvia yhdisteitä, kuten trimetyyliamii- nia, dimetyyliamiinia, kadaveriinia ja putres- kiinia Laadunvalvonta, älypakkaukset •Nopea •Tulokset helposti nähtä- villä •Vaatii kehitystyötä •Ei kaupallisesti saatavilla •Kalliimpi kuluttajapak- kaus Haihtuvien amiinien mittaus P3HT-senso- rilla Mittaa ammoniakin, dimetyyliamiinin ja tri- metyyliamiinin määriä Laadunvalvonta •Nopea •Helppokäyttöinen •Ei kaupallisesti saatavilla •Vaatii vielä kehitystyötä Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 24 4. Fysikaalis-kemialliset menetelmät 4.1. Sähköisten ominaisuuksien muutoksiin perustuvat menetelmät 4.1.1. Fischtester Kalan resistanssi riippuu sen tuoreudesta, mutta matalilla taajuuksilla kalan ja mittauselektro- dien rajapinta (tästä aiheutuva ns. elektrodien polarisaatio) sekä kalan sisäiset kalvorakenteet aiheuttavat reaktiivisia impedansseja (kapasitansseja), jotka vääristävät mittaustulosta. Reaktii- viset impedanssit ovat kuitenkin taajuusriippuvia ja niiden vaikutus on eliminoitavissa tekemällä mittaus kahdella tai useammalla taajuudella. Intellectron Fischtester VI:ssä menetellään näin mittaamalla impedanssi Wheatstone-sillalla samanaikaisesti kahdella eri taajuudella. Elektrodit kytketään kalan kylkiin lähelle peräaukkoa. Tulos saadaan analogiselta tai digitaali- selta näytöltä, jonka lukemat ovat välillä 0–100. Taulukossa 3 on esitetty Fischtesterin näyttämät lukemat eri kalalajien tapauksessa, kun kalat on mitattu tuoreina (alle 1 tunti post mortem). Näitä lukemia voidaan käyttää mittauksen kalibrointiin. Jäädytetty ja sulatettu kala voi näyttää tuoreelta, mutta sen solukalvot ovat rikkoutuneet, minkä Fischtester paljastaa heti näyttämällä lukemaa nolla. Eri kalalajien tuoreiden kalojen Fischtester-lukemat. Taulukon lähde Rehbein & Oehlenschläger (2009). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 25 4.1.2. Torrymeter Torrymeterissä (Kuva 5) elektrodien polarisaation ongelmaa vähennetään käyttämällä neljää elektrodia. Virtaa syötetään kalaan toisen elektrodiparin kautta (tähän muodostuu elektrodien polarisaatiota) ja näiden välillä olevalla toisella elektrodiparilla mitataan jännite (näiden kautta kulkee vain pieni virta ja elektrodien polarisaatiota ei synny). Mitatusta resistanssista ja kapasi- tanssista laskettu ns. Q-kerroin korreloi hyvin sen kanssa, miten monta päivää kalaa on säily- tetty jäissä. Torrymeter mittaa 2 kHz:n taajuudella elektrodiparien välisen vaihe-eron, joka on hyvällä tarkkuudella Q-kerroin. 4.1.3. Fischtesterin ja Torrymeterin vertailua Torrymeter on helppokäyttöinen, koska elektrodit painetaan tiiviisti kalan toiselle sivulle, kun taas Fischtesterillä mittaus tehdään kalan läpi. Kalan koolla on vain vähäinen vaikutus mittauk- sen tarkkuuteen molempien mittalaitteiden tapauksessa. Kun mitataan laatikossa olevaa kalaa, molemmat mittarit näyttävät pinnalta otetun kalan olevan tuoreempaa kuin pohjalta otetun, koska ilmeisesti kalojen paino aiheuttaa pieniä vaurioita. Tiettyyn tarkkuuteen (esim. ± 1 päivää jäissä) pääsemiseksi Torrymeterillä tarvitaan jonkin verran enemmän mittauksia kuin Fischtes- terillä (Taulukko 4). Joidenkin kalalajien tapauksessa Torrymeter näyttää toimivan huonosti. Täl- laisia lajeja ovat esimerkiki purple Lethrinus lentjan, Scomperomorous commerson, Lutjanus lent- jan ja Solea senegalensis. Monet tekijät voivat aiheuttaa virheellisiä mittaustuloksia: ihovauriot mittauskohdissa tai ihon kuivuminen, kala on suomustettu, kala on ollut kontaktissa elektro- lyyttien kanssa, kala on jäätynyt kokonaan tai osittain, kalan lämpötila on yli 10 °C, lima tai suomut peittävät mittauselektrodeja. Tarvittava mittausten määrä eri menetelmillä, jotta päästäisiin tarkkuuteen ±1 päivää (95 %:n luottamusväli). Taulukko muokattu lähteestä Rehbein & Oehlenschläger (2009). Menetelmä Arvio Ennuste Torrymeter 27 31 Fischtester 17 20 Trimetyyliamiini 7 10 Yleinen ulkonäkö 3 4 Raa’an haju 2 3 Kypsennetyn haju 2 4 Kypsennetyn maku 2 4 Torrymeteriä ja Fischtesteriä on käytetty pitkään kalan tuoreuden mittaamisessa (Cheyne, 1975). Esimerkiksi Lougovois ym. (2003) vertasivat useita eri menetelmiä (esim. Torrymeter, ais- tinvarainen, K-arvo, mikrobiologinen) jäitetyn kultaotsa-ahvenen laadun seuraamisessa. Torrymeter-lukemat laskivat lineaarisesti varastoinnin ajan ja olivat linjassa aistinvaraisen arvi- oinnin kanssa. Johtopäätös oli, että Torrymeter mittaus on luotettava keino seurata kalan laatua ja tarkkuudeksi määritettiin ±2,2 päivää. Oehslenschlager (2005) mukaan myös Fischtester on edelleen käyttökelpoinen laite kalan tuoreuden mittaamisessa. Toisaalta Hattula ym. (1995) to- tesivat, että Torrymeter ei ollut tarpeeksi herkkä, kun vertailtiin eri kalastusmenetelmien vaiku- tusta silakan laatuun. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 26 Torrymeter (ja Fischtester) ovat edelleen käyttökelpoisia laitteita esimerkiksi silakan laadun mit- taamiseen, mutta ne ovat epäherkkiä ja monet tekijät saattavat aiheuttaa virheellisiä mittaus- tuloksia. Kaupallisia laitteita: Distell Industries Ltd, Fauldhouse, West Lothian, UK (Torrymeter); Intel- lectron International Electronics, Hamburg, Germany (Fishtester VI (IT); RT Rafagnataekni Reyk- javik, Iceland (RT-Freshness Grader). Distell Industries -yrityksen Torrymeter-mittalaite. Kuva julkaistu valmistajan luvalla. 4.2. Värin mittaus Väriä mitataan värimittarilla, joka antaa numeeriset arvot väreille. Yleisimmin käytettyjä väriar- voja ovat CIELAB tai L*a*b*. Kun värille mitataan arvot, eliminoidaan epämääräisyys värien ku- vaamisesta. Näin voidaan laskea ja tallentaa eri mittausten välinen ero, väriero. Numeroarvoista nähdään värierojen suunnat, onko kyse vaaleuden muutoksesta värin pysyessä samana, vai onko värisävyssä eroa. Värieron laskeminen on jatkuvassa kehityksessä, jotta se saadaan pa- remmin vastaamaan ihmisnäköä. Värin mittaamista käytetään yleisimmin vesiviljelyssä esimerkiksi kirjolohien ruokinnan opti- moinnissa, kalamassojen ja surimien laadunvalvonnassa sekä kalan prosessoinnin vaikutusten seuraamisessa (jäähdytys, pakastaminen, kuumennuskäsittelyt, savustus ja korkeapaineproses- sointi). Kalan tuoreutta voidaan seurata mittaamalla värin muutosta kalan kiduksissa ja silmissä konenäön avulla (esimerkiksi Lalabadi ym. 2020, ks. kohta 4.4). Värinmittausta käytetään myös erilaisten jäähdytysprosessien vaikutusten seuraamiseen. Värin mittaamisen potentiaali on Suomessa lähinnä tuotteistuspuolella, ei niinkään kalan tuoreuden seurannassa. Värin mittaa- miseen on olemassa erilaisia värianalysaattoreita, värisensoreita ja spektrofotometrejä, kuten esimerkiksi Spectropen®. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 27 4.3. Sähkökemiallinen impedanssispektroskopia (EIS) Sähkökemiallinen impedanssispektroskopia (electrochemical impedance spectroscopy, EIS) on menetelmä, jossa mitataan ensin näytteen impedanssi Z(f) taajuuden funktiona (Kuva 6). Mi- tattu impedanssi sovitetaan tietokoneella sopivaa algoritmia käyttäen sähköiseen sijaiskytken- tään, joka sisältää resistansseja (R) ja kapasitansseja (C) ja periaatteessa myös induktansseja (L). Lopputuloksena saadaan impedanssia Z(f) parhaiten kuvaavat resistanssien ja kapasitanssien lukuarvot, jotka puolestaan korreloivat näytteen ominaisuuksien kanssa. Sijaiskytkentä voidaan valita monella tavalla ja se voi olla fysikaalinen tai empiirinen. Zhao ym. (2017) esittelee EIS-menetelmän käyttömahdollisuuksia elintarvikkeiden laadun tut- kimisessa. Menetelmää voidaan käyttää muun muassa kalojen tuoreuden selvittämiseen, koska kalan kudosten sähköiset ominaisuudet riippuvat sen tuoreudesta. EIS on automatisoitavissa ja toteutettavissa melko edullisin laittein, näytettä tuhoamaton ja tulokset saadaan nopeasti. Esimerkiksi Niu & Lee (2000) tutkivat karppia, silliä ja meribassia. Kalaan asetettiin yksinkertaiset elektrodit ja impedanssi mitattiin taajuusalueella 0,1 Hz–100 kHz. Sekä impedanssin vaihekul- man että suuruuden muutoksien havaittiin korreloivan kalan pyydystämisestä kuluneen ajan kanssa. Kalat voitiin näin jakaa helposti neljään tuoreusluokkaan (tuore, melko tuore, melko pilaantunut, pilaantunut). Viime aikoina EIS:ää on käytetty useiden eri kalojen tuoreuden mit- taamiseen (Pérez-Esteve ym. 2014; Yuan ym. 2018; Zavadlav ym. 2016; Sun ym. 2017, 2018). EIS:ää on käytetty myös muun muassa suolapitoisuuksien monitorointiin suolaus-savustus - prosesseissa (Rizo ym. 2013) sekä kalan rasvapitoisuuden mittaamisessa (Rasmussen ym. 2012; Willis & Hobday 2008). EIS vaikuttaa lupaavalta kalojen tuoreuden mittausmenetelmältä. Elektrodien ja näytteen raja- pinnalle syntyvä elektrodien polarisaatio on merkittävin mittaustarkkuuden haaste. Potentiaalia näyttäisi olevan, mutta mahdollisuuksia silakan laadun monitorointiin tulisi tutkia lisää. Tampe- reen yliopistossa on kaksi laitetta impedanssimittauksiin ja asiantuntemus impedanssitietojen käsittelyyn ja analysointiin (Computational Biophysics and Imaging -ryhmä CBIG). Professor Jari Hyttinen (jari.hyttinen@tuni.fi; p. +358 40 849 0020). Lisätietoja on saatavilla osoitteesta: https://www.tuni.fi/fi/tutkimus/electrical-impedance-spectroscopy-eis#switcher-trigger--ser- vices Sähkökemiallisen impedanssin mittaus. Kuva: Virpi Alarautalahden luvalla lähteestä Tampereen yliopisto https://www.tuni.fi/fi/tutkimus/electrical-impedance-spectroscopy-eis. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 28 Fishermen Seafood Analytics esitteli uuden elektronisen kalanseurantalaitteen vuonna 2015 (Kuva 7). Laite on täysin integroitu elektroninen kalan ominaisuuksien seurantaan tarkoitettu laite. Se antaa tutkijoille, vesiviljelylaitoksille, jalostajille, merellä toimiville tarkkailijoille, kalas- tajille ja muille kalatalousalan toimijoille mahdollisuuden mitata ja tallentaa tärkeitä elektronisia tietoja kaloista nopeasti ja helposti. Fishboard-sovelluksen avulla käyttäjät voivat nopeasti ja helposti arvioida yksittäisten kalojen pituuden, painon, terveyden, tilan ja pilaantumisen tilan sekä kehon koostumuksen. Laitetta voidaan käyttää mittausten reaaliaikaisen tarkkailuun ja tal- lentamisen. Certified Quality Reader, CQ Foods Inc., USA. Kuva: Sara Hiidenhovi, Luke 4.4. Konenäkö Konenäkö on teknologiaa, jossa yhdistyvät mekaniikka, optinen instrumentointi, sähkömag- neettisen säteilyn havaitseminen sekä digitaalisen videon ja kuvan prosessointiteknologia. Ko- nenäköteknologia tarjoaa korkeaa joustavuutta ja toistettavuutta suhteellisen alhaisilla kustan- nuksilla sekä sallii melko nopean tuotannon läpivirtauksen tarkkuutta vaarantamatta. Ko- nenäköä käytetään laajalti erilaisissa tutkimus- ja monitorointisovelluksissa eri aloilla, kuten lääketieteellisessä diagnostiikassa, automaattisessa valmistuksessa ja valvonnassa, kaukokar- toituksessa, robottien ohjauksessa sekä maataloudessa ja elintarviketeollisuudessa (Patel ym. 2012). Tyypillisesti konenäkösysteemi koostuu valaisinyksiköstä (valonlähde), kuvankaappaus- systeemistä, liitäntäkortista kameralle (frame grabber) ja tietokoneesta (He ym. 2015). Yksinkertaisimmissa konenäkösovelluksissa, joissa analysoitava näkymä on kaksiulotteinen yk- sittäinen kuva, kuva-analyysiprosessi koostuu eri vaiheista: esikäsittely, segmentointi, sisällön kuvauksen muodostus, sovitus, mallit ja tunnistus. Ensimmäisenä vaiheena on kuvan muodos- taminen kuvalähteellä, esimerkiksi digikameralla. Seuraavaksi kuva esikäsitellään: tällöin kuva muokataan digitaalisen kuvankäsittelyn menetelmillä analyysin kannalta edullisempaan muo- toon, esimerkiksi normalisoimalla siten, että valaistuksessa tapahtuneet vaihtelut eivät vaikuta liikaa lopputulokseen. Kuvasta usein suodatetaan pois kohinaa tai muita analyysiä häiritseviä sävyvaihteluja sekä korostetaan mielenkiinnon kohteina olevia piirteitä. Geometrista korjausta voidaan tehdä esimerkiksi kameran linssin aiheuttamien vääristymien vuoksi. Segmentoinnin Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 29 tavoitteena on erottaa kohteet ja kohteiden osat toisistaan ja taustastaan. Segmentointiin voi- daan käyttää aluepohjaista menetelmää, jossa kuva jaetaan harmaasävyltään, väriltään tms. ominaisuudeltaan homogeenisiin alueisiin tai reunanilmaisua, jossa kuvasta ilmaistaan jyrkkiä sävynmuutoskohtia eli alueiden reunoja. Segmentointi on kuva-analyysin kriittisimpiä kohtia. Segmentoinnin jälkeen lasketaan segmentoitujen alueiden, reunojen tms. ominaisuuksia ku- vaavia piirteitä (mm. muoto, väri ja alueiden pintarakennetta kuvaava tekstuuri), joiden perus- teella erilaisia kohteita voidaan erottaa toisistaan. Muodostettuja kuvauksia verrataan systee- mille etukäteen opetettujen prototyyppikohteiden malleihin ja näin voidaan tunnistaa kuvassa esiintyviä kohteita tai ilmaista poikkeamia malleista. (Pietikäinen & Silvén 2019) Konenäköä alettiin käyttää elintarviketeollisuudessa 1990-luvun alusta. Nykyisin sitä käytetään laajalti erilaisten elintarvikkeiden laaduntarkkailussa- ja valvonnassa, sillä kyseinen teknologia tarjoaa objektiivisen ja tarkan tiedon tutkittavasta kohteesta. Kalan ja kalatuotteiden laadun- tarkkailussa konenäköä on käytetty analysoimaan muun muassa väriä, muotoa, pituutta, kokoa, painoa ja pinnan vioituksia sekä kemiallisia ominaisuuksia, kuten rasvaa. Konenäköä on myös käytetty kuolonkankeuden määrittämisessä, luokittelussa sekä lajittelussa (Taulukko 5). Tehokas kalankasvatus edellyttää tarkkaa ajantasaista tietoa kalojen lukumäärästä, aktiivisuu- desta, terveydentilasta sekä biomassasta, jotta voidaan optimaalisesti hallita esimerkiksi ruo- kintaa ja kasvatustiheyksiä. Janhunen ym. (2019) selvittivät 3D-kameratekniikan ja koneoppi- misen hyödyntämistä suomalaisessa kalankasvatuksessa. Kuvauskokeiluissa ruokailevasta kir- jolohesta ja siiasta saadusta liikedatasta pystyttiin toteamaan niiden aktiviteetin muutoksia. Ku- hakasvatusten kuvauksissa kuhan liikeaktiivisuutta ei havaittu samean veden ja kuhan passiivi- sen ruokailukäyttäytymisen vuoksi. Sen sijaan kalojen pituudesta saatiin luotettavia metrisiä mittaustuloksia 3D-kameradatan avulla, mutta näytemäärä ei ollut riittävä suoraan biomassan arviointiin. Tulosten perusteella 3D-kuvasta saatuja pituusmittoja voitaisiin käyttää kalojen kas- vun tarkempaan arviointiin. Menetelmää voidaan käyttää myös kalan kidusten ja silmien värin seurantaan (ks. kohta 4.2). Saatavilla on erilaisia kaupallisia laitteita. Esimerkiksi AIA:n Vision Online – Vision Systems:n sivuilta https://www.visiononline.org/vision-resources.cfm löytyy tietoa konenäkösysteemeistä, teknologiasta, tapahtumista, koulutuksista, yrityksistä sekä tuotteista ja palveluista. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 30 Valittuja esimerkkejä konenäön käytöstä kala ja kalatuotteiden laadunarvioin- nissa. Ominaisuus Kalalaji Viite Väri Taimen (Salmo trutta) Marty-Mahé ym (2004); Quevedo ym. (2010) Kirjolohi (Oncorhynchus mykiss W.) Stien ym. (2006a, 2006b) Tonnikala (Thunnus thynnus L.1758) Mateo ym. (2006) Atlantin lohi (Salmo salar) Erikson ym. (2011) Paino Kirjolohi (Oncorhynchus mykiss) Gümüş & Balaban (2010) Alaskan seiti (T. chalcogramma) Balaban ym. (2010a) Silli (Clupea harengus) Mathiassen ym. (2011) Kolja (Melanogrammus aeglefinus), silli (C. harengus), seiti (Pollachius virens) Svellingen ym. (2006) Koko ja muoto Turska (G. morhua), lohi (S. salar) Misimi ym. (2008) Tilavuus Alaskan seiti (T. chalcogramma) Balaban ym. (2011a, 2011b) Vioitukset Lohi (Salmo salar L.) Ashton ym. (2010) Kuolonkankeus (rigor mortis) Kirjolohi (O. mykiss) Stein ym. (2006b) Rasva Atlantin lohi (S. salar) Borderías ym. (1999) Taimen (Salmo trutta L.) Marty-Mahé ym. (2004); Stien ym. (2007) Luokittelu/ lajittelu Meriantura eli kielikampela (Solea solea), punakam- pela, valkoturska (Merlangius merlangus), hieta- kampela (Limanda limanda), turska (G. morhua), pikkupääkampela (Microstomus kitt) Storbeck & Daan (2001) Liejukampela (H. platessoides), meriantura (S. vul- garis), pikkupääkampela (Microstomus kitt) White ym. (2006) Karppi (C. carpio), Niilin tilapia (Oreochromis sp.) Zion ym. (2007) Atlantin lohi (S. salar) Misimi ym. (2008) 4.5. Raman-spektroskopia Raman-spektroskopiassa mitataan molekyylin värähtelytaajuuden siirtymää verrattuna vaikut- tavan säteen taajuuteen. Siinä näyte säteilytetään monokromaattisella UV-, VIS- tai NIR -alueen lasersäteellä, jolloin molekyylin värähtelyenergiataso siirtyy perustasolta korkeamman energian tasolle. Kun molekyyli siirtyy takaisin matalamman energian tasolle, Raman-sironta tapahtuu alemmalla taajuudella kuin lasersäteen taajuus. Sen vuoksi samanaikaisesti voidaan saada tie- toa näytteen laadullisista ja määrällisistä rakenne- ja kemiallisista ominaisuuksista. Raman- spektroskopialla voidaan mitata kaasumaisia, nestemäisiä sekä kiinteitä näytteitä. (Hassoun & Karoui 2017) Tyypillisesti Raman-spektroskopialaitteisto koostuu seuraavista pääkomponenteista: lasersä- teen lähde, kuituoptinen Raman koetin, kuvantava spektrograafi ja valoherkkä kenno. Kuvauk- sessa näyte, kuten lohifile, valaistaan lasersäteellä. Sen jälkeen sironnut valo kerätään kuituopti- selle Raman-koettimelle, josta se syötetään kuvantavalle spektrograafille. Sironnut joustava sä- teily suodatetaan pois ja jäljelle jäänyt valo dispergoidaan valokennolle, joka tallentaa koko spektrin samanaikaisesti (Xu ym. 2015). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 31 Elintarvikesektorilla Raman-spektroskopiaa on hyödynnetty elintarvikkeiden väärennösten, nii- den maantieteellisen alkuperän ja fysikokemiallisten ominaisuuksien määrittämisessä sekä pro- sessin kontrolloinnissa. Raman-spektroskopian on osoitettu olevan käyttökelpoinen mene- telmä kalan laadun mittaukseen prosessilinjalla, mutta kyseisen teknologian käyttö on vielä vähäistä (Hassoun & Karoui 2017). Velioglu ym. (2015) testasivat, voidaanko Raman-spektro- skopialla erottaa pakastettu ja sulatettu kala toisistaan. Testauksessa tutkittiin 6 eri kalalajin näytettä: piikkimakrilli (Trachurus trachurus), sardelli (Engraulis encrasicolus), keltajuovamullo (Mullus surmuletus), sinikala (Pomatamus saltatrix), Atlantin lohi (S. salar) ja isokurnusimppu (Trigla lucerna). Kun kuvadata prosessointiin PCA-mallilla, kalalajit pystyttiin erottamaan toisis- taan sekä lajin että tuoreuden perusteella. Raman-spektroskopiaa on käytetty myös kalojen rasvan hapettumisen seurantaan ja rasvapi- toisuuden sekä proteiinirakenteiden määrittämiseen. Herrero ym. (2004) tutkivat kummeliturs- kan lihaksen rakennemuutoksia -10 °C ja -30 °C:n pakastuksen aikana. Muutoksia havaittiin proteiinin sekundäärirakenteessa spektrialueella 1 600–1 680 cm-1. Lisäksi proteiinin tertiääri- rakenteessa havaittiin muutoksia spektrialueella 2 935 cm-1, mikä osoittaa lihaproteiinin dena- turoitumisen. Sanchez-Alonso ym. (2012) puolestaan tutkivat kummeliturskan (Merluccius mer- luccius L) fileestä eristetyn rasvan muutoksia -10°C:ssa varastoinnin jälkeen. Näytteitä varastoi- tiin 3, 14 ja 23 viikkoa. Muutokset rasvan hapettumisessa havaittiin spektrialueella noin 1658 cm-1. Kanadalaisen TellSpecsin kehittämä laite on tarkoitettu siian laadun tarkkailuun reaaliaikaisesti (Kuva 8). Määritykset voidaan tehdä kokonaisesta kalasta tai fileestä. Sovellusta voidaan käyttää koostumuksen mittaamiseen sekä väärennösten toteamiseen. TellSpecin laitteiston toiminta- tapa on lyhyesti seuraava: laite lähettää lasersäteen mitattavaan elintarvikkeeseen, mittaa hei- jastuneen valon, ja lähettää sen bluetoothin välityksellä pilvipalveluun serverille. Siellä infor- maatiota verrataan referenssidataan lukuisten algoritmien avulla. Lopuksi tulokset (kosteus-, rasva- ja proteiinipitoisuus, lisätty veden määrä) lähetetään käyttäjälle, joka voi nähdä ne heti kännykässään grafiikkana ja taulukoina (FOODnavigator 2018; SalmonBusiness 2018). TellSpe- cin pikalaite näyttää lupaavalta. Sitä ei voi kuitenkaan suoraan käyttää silakalle, vaan sille pitää luoda oma sormenjälkikirjasto ja datan perusteella tarvittavat algoritmit. TellSpecin laite siian laaduntarkkailuun reaaliaikaisesti. Kuva valmistajan luvalla. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 32 4.6. VIS/NIR-spektroskopia Infrapunasäteily (IR) on osa sähkömagneettista säteilyä. Se toimii sähkömagneettisen spektrin aallonpituusalueella 780 nm–1 mm, ja voidaan jakaa lähi-infrapuna- (NIR: 0,78–2,5 μm), keski- infrapuna- (MIR: 2,5–25 μm) ja kaukoinfrapuna-alueisiin (FIR: 25–1000 μm). NIR-alue voidaan jakaa lyhytaaltoinfrapuna- (SW-NIR: 780–1300 nm) ja pikäaaltoinfrapuna-alueisiin (LW-NIR: 1300–2500 nm) (Cen & He 2007). Infrapunaspektroskopia perustuu säteilyn absorbanssiin or- gaanisen aineen tiettyjen molekyylien (O-H-, N-H-, ja C-H-ryhmät sekä C-C-, C-O-, C-N- ja N- O-ryhmät) värähtelytaajuuksilla (Soriano-Disla ym. 2014). Elektronien siirtymät absorboivat nä- kyvän valon ja ultraviolettivalon aallonpituusalueilla (Rossel ym. 2006). NIR-spektroskopiassa näytteen pinnalle lähetetään valoa ja sen jälkeen mitataan näytteestä tuleva valo eri aallonpituuksilla. Tutkittavan kohteen spektri voidaan tuottaa neljällä tavalla. Transmittanssitavassa mitataan näytteen läpi kulkemaa valoa. Siinä valonlähde ja detektori ovat näytteen vastakkaisilla puolilla, ja näytteen läpi kulkema valo mitataan vastakkaisella puolella täsmällisesti samassa kohtaa kuin se on lähtenytkin. Reflektanssitavassa mitataan näytteestä heijastunutta valoa. Siinä valonlähde ja detektori sijaitsevat samalla puolella näytettä. Pintahei- jastuksen välttämiseksi detektorit sijoitetaan tavallisesti 45 asteen kulmaan näytteeseen näh- den. Transflektanssi on transmittanssi- ja reflektanssitapojen yhdistelmä, ja siinä mitataan näyt- teen läpi kulkemaa ja heijastunutta valoa. Näyte on sijoitettu ikään kuin heijastuksen mittausta varten, mutta heijastinyksikkö sijaitsee valonlähdettä vastapäätä näytteen takana. Heijastinyk- sikön heijastama valo siirtyy näytteen läpi detektorille. Vuorovaikutustapa on transmittanssi- ja reflektanssi-tapojen yhdistelmä. Myös siinä mitataan näytteen läpi kulkemaa ja heijastunutta valoa. Tässä mittaustavassa näyte valaistaan valokuitukaapeleilla, jotka ovat suorassa kosketuk- sessa näytepinnan tai näytepidikkeen kanssa. Valo etenee näytteen sisällä ja on vuorovaikutuk- sessa kulkeutumalla läpi, heijastuen ja/tai absorboituen. Lähteiden kanssa samalle puolelle si- joitetut kuitukimput palauttavat näytteen sisällä etenevän valon detektoriin. (Alander ym. 2013) NIR-mittauksessa kertyvä valtava datamäärä pitää esikäsitellä ja arvioida kemometrisesti. Pro- sessi sisältää kolme vaihetta: spektritiedon esikäsittely, kalibrointimallin rakentaminen ja mallin siirto. Spektridatan esikäsittelyn tavoitteena on saada data käyttökelpoisempaan muotoon mo- nimuuttuja-analyysia varten (Alander ym. 2013; Cortés ym. 2019). Sähkömagneettisen säteilyn spektrin ultravioletti-, näkyvän valon ja infrapuna-alueiden aallon- pituusalueilla toimivaa spektroskopiaa käytetään yhä enemmän elintarvikkeiden laadun mit- taamiseen, sillä laitteistot ovat entistä laadukkaampia, niiden hinnat ovat laskeneet ja datan käsittelyyn tarvittavat kemometriset työkalut ovat kehittyneet (Hassoun & Karoui 2017). Kalassa ja kalatuotteissa VIS/NIR-spektroskopiaa on käytetty kemiallisen koostumuksen, kuten vesi-, rasva-, proteiini- ja suolapitoisuuden analysoinnissa. Lisäksi laaduntarkkailussa sitä on käytetty vioittumien ja kalan tuoreuden arvioinnissa sekä kalojen luokittelussa ja alkuperän määrittämisessä (He ym. 2015). Menetelmä on tutkittavaa kohdetta tuhoamaton. Taulukossa 6 on esitetty sovellusesimerkkejä VIS/NIR -spektroskopian käytöstä kalan ja kalatuotteiden laa- dun arvioinnissa. VIS/NIR-spektroskopian soveltuvuutta kalan kemiallisen koostumuksen määrittämiseen on ovat tutkineen muun muassa Nortvedt ym. (1998) ja Folkestad ym. (2008). Nortvedt ym. (1998) määritti proteiinipitoisuuden ruijanpallaksesta ja tulos vastasi tarkkuudeltaan kemiallisella me- netelmällä saatua tulosta. Folkestad ym. (2008) tutki NIR-spektroskopian soveltuvuutta rasva- pitoisuuden määrittämiseen. Tutkijat käyttivät aallonpituusaluetta 760–1040 nm ja näytteinä oli eläviä ja teurastettuja Atlantin lohia. Tulos oli suhteellisen hyvä. NIR-spektroskopiaa on käytetty Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 33 myös määrittämään kalan mustelmia, joita voi tulla kalastuksen, varastoinnin ja kuljetuksen ai- kana. Perustuen deoksihemoglobiinille luonteenomaiseen absorbanssikaistaan 760 nm koh- dalla, Hammers ym. (2007) käytti aallonpituusaluetta 600–1100 nm määrittämään mustelmia kokonaisesta hopealohesta (Oncorhynchus kisutch). VIS/NIR -spektroskopian on osoitettu soveltuvan kalan tuoreuden arviointiin. Turskafileiden tuoreuden arviointiin Nilsen ym. (2002) käytti näkyvän valona aallonpituusaluetta 400–700 nm, ja lohen tuoreuden arviointiin tutkijat käyttivät VIS/NIR-aallonpituusaluetta 700–1100 nm. Ud- din & Okazaki (2004) pystyivät tutkimuksessaan erottamaan NIR -spektroskopialla tuoreen ja pakastetun ja sitten sulatetun Japanin hevosmakrillin (T. japonicus) tosistaan perustuen siihen, että kalan liha absorboi ja heijastaa valoa eri tavalla varastoinnin ja sulatuksen aikana. Testauk- sessa he käyttivät aallonpituusaluetta 1100–2500 nm ja heijastunut spektri analysoitiin kemo- metrisesti. Costa ym. (2011) puolestaan käytti VIS/NIR-spektroskopiaa aallonpituusalueella 400–970 nm määrittämään merellä häkeissä kasvatetun ja sementtitankeissa maalla kasvatetun meribassin (Dicentrarchus labrax) lihan eroavaisuudet. Erot voitiin havaita 48 h teurastuksen jälkeen, mutta 96 tunnin jälkeen erot eivät olleet niin selvät. Ottavian ym. (2012) käytti NIR- spektroskopiaa kalan alkuperän toteamiseen. Tutkijat onnistuivat erottamaan luonnonvaraisen meribassin (D. labrax) kasvatetusta meribassista käyttämällä aallonpituusaluetta 1100–2500 nm. Taulukkoon 6 on koottu esimerkkejä VIS/NIR-spektroskopian käytöstä kalan ja kalatuot- teiden laadun arvioinnissa. Esimerkkejä VIS/NIR-spektroskopian käytöstä kalan ja kalatuotteiden laadun ar- vioinnissa. Ominaisuus Kalalaji Aallonpituus (nm) Viite Rasva, proteiini, kuiva-aine Ruijanpallas (Hippoglossus hippoglossus) 850–1048 Nortvedt ym. (1998) Tuoreus Turska (G. morhua), lohi (S. salar) turska: 400–700; lohi: 700–1100 Nilsen ym. (2002) Erottelu Japanin hevosmakrilli (T. japonicus) 1100–2500 Uddin & Okazaki (2004) Mustelmat Hopealohi (Oncorhynchus kisutch) 600–1100 Hammers ym. (2007) Rasva, pigmentti Viljelty Atlantin lohi (Salmo salar L.) 760–1040 Folkestad ym. (2008) Erottelu Euroopan meribassi (Dicentrarchus labrax) 1100–2500 Ottavian ym. (2012) Suomessakin on alan laitevalmistajia (muun muassa GrainSense), jotka voisivat rakentaa linjoja tai yksittäisiä mittalaitteita kala-alankin käyttöön. Tarvitaan kuitenkin referenssiaineiston kerää- mistä, testausta ja tutkimusta. Laboratoriolaitteet. NIR spektroskopiaan perustuvia kaupallisia laboratoriolaitteita eri ainei- den koostumuksen määrittämiseen on markkinoilla paljon, kuten Metrohmin (https://www.metrohm.com/fi-fi/products-overview/spectroscopy/nirs-lab-analyzers/) ja Fos- sin (https://www.fossanalytics.com/en/productfinder) laitteet. On-line/In-line laitteet (anturit) teollisuuteen. Myös eri valmistajien erilaisia antureita on kaupallisesti saatavilla teollisuuden käyttöön, esimerkiksi BÜCHI Labortechnik AG Switzerland https://www.buchi.com/en/products/nir-online/nir-online-process-analyzer. Heidän BUCHI NIR-Online® -sarjassaan on monenlaisia antureita erilaisten prosessien ohjaukseen (Kuva 9). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 34 Yhtenä käyttökohteena on mainittu kalarehun valmistus https://static1.buchi.com/sites/de- fault/files/NIR-Online_Solution_Brochure_en.pdf. BUCHI NIR-Online® -sarjan NIR -spektroskopiaan perustuvia antureita erilaisten pro- sessien ohjaukseen. Kuva BÜCHI Labortechnik AG:n luvalla https://static1.buchi.com/sites/de- fault/files/NIR-Online_Solution_Brochure_en.pdf. Kannettavat mittalaitteet. Hiljattain markkinoille on tullut kädessä pidettäviä laitteita, kuten suomalainen GrainSensen valmistama viljalaboratorio, joka analysoi siementen (vehnä, ruis, ohra, kaura, rypsi, rapsi) valkuaisen, kosteuden, öljy- ja hiilihydraattipitoisuuden noin viidessä sekunnissa. Mittaukset voidaan tehdä jo pellolla ennen sadonkorjuuta (Maatilan Pellervo 2018). GrainSense- mittarin toimintaperiaate on seuraava: se yhdistetään älypuhelinsovellukseen bluetooth-yhteydellä, jolloin laatutiedot voidaan nähdä laitteen näytöltä ja kännykkäsovelluk- sesta. Sovellus tallentaa mittaustulokset ja GPS-paikkatiedon automaattisesti. Sieltä ne välite- tään pilvipalveluun, jossa ne ovat käytettävissä tietokoneellakin. Lisäksi laatutiedot voi jakaa suoraan sovelluksesta teksti-, whatsapp- tai sähköpostiviestinä. Mittalaitteet kuluttajien käyttöön. Markkinoilla on tai tulossa NIR-teknologiaan perustuvia laitteita kuluttajienkin käyttöön, kuten suomalaisen Spectral Enginesin ja israelilaisen SCiOsca- nin kehittämiä laitteita. Spectral Enginesin laite mittaa ruoan ainesosat, ravintoaineet ja aller- geenit (Food Navigator 2017). 4.7. Hyperspektrikuvantaminen Spektraalisessa kuvantamisessa yhdistyvät spektroskopia ja kuvantamisteknologia, minkä an- siosta saadaan samanaikaisesti tietoa kohteen fysikaalisista ja geometrisistä piirteistä (muoto, koko, ulkonäkö ja väri) sekä kemiallisesta koostumuksesta spektrianalyysin perusteella (Elmasry Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 35 ym. 2012). Menetelmä on tutkittavaa kohdetta tuhoamaton. (Hyper)spektraalinen kuvantami- nen perustuu siihen, että erilaisen kemiallisen koostumuksensa ja fysikaalisen rakenteensa vuoksi kaikki materiaalit lähettävät eli emittoivat, heijastavat sekä absorboivat säteilyä eri tavoin ja eri aallonpituuskaistoilla (Ks. 4.6). Sensorilla havaitusta säteilyn intensiteetistä ja aallonpituu- desta saadaan tietoa kohteen ominaisuuksista, ja kohteet voidaan tunnistaa sen heijastusomi- naisuuksien perusteella (Keto 2020). Multi- ja hyperspektrikuvauksessa säteilyä mitataan usealla eri sähkömagneettisen spektrin aal- lonpituusalueella eli kaistalla. Multispektrikuvauksessa havainnoitavien kaistat ovat suhteellisen leveitä, mutta niiden määrä on pieni (tavallisesti alle 10), jolloin kuvapikselistä ei saada koko spektriä. Hyperspektrikuvauksessa sensorit mittaavat satoja tarkkaan rajattuja, säännöllisellä etäisyydellä toisistaan olevia kapeita kaistoja, ja jokaiselle kuvapikselille saadaan täysi spektri mitatulla aallonpituusalueella. Molemmissa tapauksissa kuvat voidaan kasata päällekkäin ta- soina, jolloin saadaan niin kutsuttu datakuutio. Siinä x-y-tasoilla saadaan paikkatieto ja kuution kolmannella ulottuvuudella kuvataan eri aallonpituuskaistoista otetuista kuvista koostuvia ta- soja. (Elmasry ym. 2012) Hyperspektraalinen kuvatieto voidaan tuottaa monin tavoin, kuten pistepyyhkäisyllä, viiva- pyyhkäisyllä tai säädettävällä aallonpituussuotimella. Pistepyyhkäisyssä kuva tuotetaan piste pisteeltä, viivapyyhkäisyssä kuva skannataan viiva viivalta yhdensuuntaisesti ja aluekuvauksessa (aallonpituusskannaus) kuva koko kohteesta tai alueesta tuotetaan yhdellä aallonpituudella kerrallaan (Elmasry ym. 2012). Hyperspektrimittauksessa kertyy valtavasti spektridataa. Kuva- datan tulkintaan tarvitaankin pitkälle kehittyneitä kemometrisiä menetelmiä (Thomas ym. 2018). Detektorityypistä riippuen hyperspektikuvia voidaan muodostaa valon eri aallonpituusaluilla: ultraviolettialueella (UV) 200–400 nm, näkyvän ja lähi-infrapuna-alueella (VIS/NIR) 400–1000 nm ja lyhytaaltoinfrapuna-alueilla (SWIR) 900–1700 nm tai 1000–2500 nm (Elmasry ym. 2012). Hyperspektrikuvantamista käytetään laajalti eri teollisuudenaloilla. Hyperspektrikuvantamista on käytetty kalan laadun ja turvallisuuden arviointiin. Sitä on käytetty erilaisten kalan tuoreutta ilmaisevien indikaattoreiden, kuten haihtuvien typpiyhdisteiden (TVB-N) (Cheng ym. 2017), tiobarbituraattihapon reaktiivisten yhdisteiden (TBARS) (Dai ym. 2015) ja bakteerien kokonais- määrän (Khoshnoudi-Nia ym. 2018) sekä aistittavan laadun (Cheng ym. 2015) arviointiin. Lisäksi sitä on käytetty kemiallisten koostumuksen, kuten rasvan, kosteuden ja suolapitoisuuden mää- rittämiseen. Khoshnoudi-Nia & Moosavi-Nasab (2019) kehittivät multispektraalisen kuvantamismenetel- män kirjolohifileiden kemiallisen, mikrobiologisen ja aistinvaraisen laadun yhtäaikaiseen mää- rittämiseen. Työssään he kuvasivat lohifileitä (O. mykiss) 12:n vuorokauden ajan aallonpituus- alueella 430–1010 nm. Hyperspektridata käsiteltiin kemometrisesti. Samoista näytteistä määri- tettiin haihtuvat typpiyhdisteet (TVB-N), psyktrotrofisten bakteerien kokonaismäärä (PPC) sekä arvioitiin aistinvaraisesti. Tuloksen mukaan multispektrikuvantamisella voidaan ennustaa kirjo- lohen kemiallista, mikrobiologista ja aistinvaraista laatua yhtäaikaisesti, joskin vielä tarvitaan kemometristen menetelmien kehittämistä. Taulukkoon 7 on koottu esimerkkejä hyperspektri- kuvantamisen käytöstä kalan ja kalatuotteiden laadun arvioinnissa. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 36 Esimerkkejä hyperspekrtikuvantamisen käytöstä kalan ja kalatuotteiden laadun arvioinnissa. Ominaisuus Kalalaji Aallonpituus (nm) Viite Kosteus, rasva Ruijanpallas (Hippoglossus hippoglossua), kissakala (Icatalurus punctatus), turska (G. morhua), Japanin makrilli (Scomber japo- nicus), silli (C. harengus), seiti (Pollachius virens) 760–1040 Elmasry & Wold (2008) Suola, rasva Lohi (S. salar) 760–1040 Segtnan ym. (2009a, 2009b) Pigmentti (astaxanthin) Kirjolohi (O. mykiss) 385–970 Dissing ym. (2011) Sukkulamadot Turska (G. morhua) 400–1000 Sivertsen ym. (2011) Luokittelu Lohi (S. salar L.) 400–1100 Sone ym. (2012) TVB-N Ruohokarppi (Ctenopharyngodon idella) 400–1100 Chen ym. (2017) TVB-N, PPC, ais- tinvarainen laatu Kirjolohi (O. mykiss) 430–1010 Khoshnoudi-Nia & Moosavi-Nasab (2019) Hyperspektrikuvantamisella on paljon sovelluskohteita Suomessa myös kala-alalla. Nofiman kehittämä teknologia (ks. kohta kaupalliset laitteet) voisi soveltua vaalealihaisen kalan, silakan- kin, luokitteluun, mutta se pitäisi testata. Nofima on kehittänyt hyperspektriteknologiaan pe- rustuvan teknologian (Kuva 10), jolla turskat voidaan lajitella automaattisesti jo ennen kuin ne toimitetaan jalostamoille. Hyvälaatuisen (suolistetun) kalan liha on valkoinen ja hieno. Suolis- tamattoman tai kalastuksen yhteydessä vaurioituneeseen kalan lihaan muodostuu veritahroja ja -hyytymiä. Kalat valaistaan tuotantolinjalla ja lihaksen veripitoisuus arvioidaan anturiin hei- jastuvien valosignaalien perusteella. Näin kalat voidaan lajitella eri laatuluokkiin niiden veripi- toisuuden perusteella. Kone pystyy mittaamaan ja analysoimaan kalat kuljetinhihnalla nopeu- della kaksi metriä sekunnissa. (Sciencenorway, 2019) Suomestakin löytyy hyperspektrikuvantamiseen erikoistuneita yrityksiä, joilta löytyy eri aallon- pituusalueilla toimivia eri käyttötarkoituksiin soveltuvia hyperspektrikameroita. Uusi sovellus- alue vaatii kuitenkin kehitystyötä. Nofiman kehittämä hyperspektriteknologiaan perustuva teknologia, jolla turska voi- daan automaattisesti lajitella jo ennen kuin se toimitetaan jalostamoille. Kuva julkaisijan © Norsk Elektro Optikk luvalla https://partner.sciencenorway.no/fish-fisheries-nofima/using- light-to-ascertain-the-quality-of-fish-has-the-potential-to-revolutionize-the-fishing-in- dustry/1594685 Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 37 4.8. Elektroninen nenä Elektroninen nenä (EN, tekonenä) koostuu näytteensyöttöjärjestelmästä, sensorikammiosta sekä tietokoneesta. EN sisältää useita erilaisia sensoreita, joilla on osittainen spesifisyys suurelle joukolle haihtuvia yhdisteitä. Nämä sensorit on kytketty näytteen tunnistamiseen kykenevään hahmontunnistusjärjestelmään. Kun haihtuva yhdiste adsorboituu sensorin pinnalle, muuttuvat sensorin johtokyky, resonanssitaajuus tai optiset ominaisuudet (fluoresenssi, adsorptio) senso- rin tyypin mukaisesti. Muutokset rekisteröidään tietokoneella spektreinä ja näytteet tunniste- taan muodostamalla niistä "sormenjälkiprofiilileja" erilaisten tilastollisten menetelmien, kuten pääkomponenttianalyysin (PCA, Principal component analysis), multilineaarisen regression (MLR) ja keinotekoisien neuroverkkojen (ANN, Artificial Neural Network), avulla. Tekonenän tärkeimpiä ominaisuuksia ovat herkkyys, nopeat reaktio- ja palautumisajat ja osittainen selek- tiivisyys aineryhmille. Lisäksi sensoreiden pitäisi olla mahdollisimman epäherkkiä ulkoisten olo- suhteiden muutoksia kohtaan. Elektronisen nenän sovellutuksia kehitettäessä on syytä käyttää vertailumenetelmiä, joiden avulla voidaan arvioida tekonenän erottelukykyä tutkittaville näyt- teille ja löytää perusteet näytteiden erottumiselle. Tällaisia vertailumenetelmiä ovat esimerkiksi aistinvarainen arviointi, haihtuvien yhdisteiden määritykset kaasukromatografisesti ja mikro- biologiset määritykset. (Albers ym. 2003) Tekonenää hyödynnetään monilla aloilla (Karakaya ym. 2020): • elintarvike- ja juomateollisuus (laadun arviointi, säilyvyyden ja pilaantumisen valvonta, vaarallisten kemikaalien tai bakteerien havaitseminen ja luokittelu). • maa- ja metsätalous (hedelmät, vihannekset, kukat, kasvit, tupakka ja vastaavat tuotteet vapauttavat erityisiä haihtuvia orgaanisia yhdisteitä yhdisteet, jotka voidaan havaita E-nenällä; hedelmien ja kasvisten laadun ja kypsyyden seuranta, torjunta- ainejäämien havaitseminen) • lääketiede ja terveydenhuolto (sairauksien havaitseminen, esimerkiksi astma, syöpä ja tuberkuloosi) • sisä- ja ulkoilmanlaadunseuranta • turvallisuus (räjähteiden toteaminen). Elektronista nenää voidaan hyödyntää kalalajien lajittelussa. Güney & Atasoy (2015) pystyivät erottamaan kolme erilaista kalalajia, piikkimakrillin, sardellin ja valkoturskan, toisistaan käyttä- mällä elektronista nenää. Keinonenää voidaan käyttää myös kalan tuoreuden tai pilaantumisen arviointiin. Sen avulla voidaan esimerkiksi havainnoida mikrobien tuottamia haihtuvia yhdis- teitä niin kylmäsavustetuista kuin tuoreista lohifileistä (Olafsdottir ym. 2005). Teknologiaa voi- daan hyödyntää myös laaduntarkkailussa. Li ym. (2020) raportoivat, että keinonenän avulla voi- tiin tunnistaa ja erottaa varastoidun kalajauhon erilaiset tuoreusasteet. Menetelmän avulla voi- tiin arvioida kalajauhon happoluku ja TVB-N-arvo ja siten määrittää kalajauhon tuoreus kvan- titatiivisesti. Ranskalaisen Alpha MOSin Heracles Neo (Kuva 11) on laboratoriotason laite, jolla lukuisia so- velluksia muun muassa tuotteiden laadun ja yhdenmukaisuuden seurantaan, tuotekehityksen tueksi sekä ruokaväärennösten havaitsemiseen. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 38 Heracles Neo -laitteisto, Alpha MOS, Ranska (https://www.alpha-mos.com) on eten- kin laboratoriokäyttöön suunnattu elektroninen nenä. Kuva Alpha MOSin luvalla https://www.alpha-mos.com/sites/default/files/alphamos/images/photo-heracles-neo-au- tosampler-computer-operator2.jpg Sensigentin valmistama Cyranose®320 (Kuva 12) on kannettava mittauslaite. Valmistajan si- vulta löytyy lista julkaisuista, joissa laitetta on hyödynnetty erilaisissa sovelluksissa (https://www.sensigent.com). Mittauslaite Cyranose® 320, Sensigent, USA (https://www.sensigent.com). Kuva Sensigent:in luvalla http://www.sensigent.com/products/cyranose.html. Ohessa linkkejä muiden laitevalmistajien sivuille: https://aryballe.com/ https://airsense.com/en http://www.roboscientific.com/products/model-307b/ http://e-nose.asia/index.php?lang=en Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 39 4.9. Elektroninen kieli Elektronisen kielen toimintaperiaate on sama kuin keinonenässä sillä erotuksella, että siinä näyte on kosketuksissa anturiin. Keinokielet soveltuvat käytettäväksi nestemäisten elintarvik- keiden makuominaisuuksien määrittämiseen. Mittauslaite koostuu kolmesta osasta: anturi-, signaalinkeruu- ja hahmontunnistusjärjestelmät. Yleisimmin käytetyt anturit ovat joko poten- tiometrisiä tai amperometrisiä. Alun perin keinonenää sovellettiin viiden perusmaun erottami- seen ja analysointiin mutta vähitellen siitä on tullut käyttökelpoinen työkalu elintarvikeväären- nösten, aitouden ja lääkejäämien havaitsemiseksi. Perinteiset menetelmät, kuten massaspekt- rometria, sähkökemiallinen analyysi ja aistinvaraisen arvioinnin raati voivat olla aikaa vieviä, kalliita, ja niitä ei voida käyttää online-mittauksiin, koska vaihtelua esiintyy usein ihmisen väsy- myksen tai stressin takia. Keinokielen etuja perinteisiin menetelmiin nähden ovat näytteiden tuhoutumattomuus testauksessa, mahdollisuus myrkyllisten aineiden analyysiin sekä objektii- vinen arviointi yleensä ilman näytteen esikäsittelyä. Elektronisen kielen käyttö onkin laajentunut muun muassa lääketeollisuuteen, ympäristön ja käymisprosessien seurantaan. Keinokielimene- telmien heikkous ihmiseen verrattuna on kuitenkin se, että ne ovat usein herkkiä ympäristöte- kijöiden, kuten esimerkiksi lämpötilan vaikutukselle. (Jiang ym. 2018) Keinokieltä on mahdollista käyttää myös kalan tuoreuden arviointiin. Rodriquez-Mendez ym. (2009) määritti suutarin (Tinca tinca) pilaantumisasteen analysoimalla biogeenisten amiinien muodostumista keinokielen avulla. Han ym. (2015) osoitti, että keinokieltä voidaan käyttää ka- lan mikrobiologisen laadun määrittämiseen. Han ym. (2019) ovat kehittäneet keinokielen, jonka avulla hän pystyttiin samanaikaisesti ja kvantitatiivisesti arvioimaan kolmen raskasmetallin kad- miumin, elohopean ja lyijyn, jäämät ruutanasta. Menetelmä on kirjoittajien mukaan sovelletta- vissa myös muihin kalatuotteisiin. Ruiz-Rico ym. (2013) luokittelivat keinokielen avulla kyl- mäsäilytetyt (4 °C) turskat tuoreisiin (varastoitu ≤ 1 vrk) ja pilaantuneisiin (varastoitu ≥ 4 vrk). Keinokielellä saadut tulokset olivat verrannollisia fysikaalis-kemiallisten ja mikrobisten määri- tysmenetelmien (kosteuspitoisuus, TVBN ja ATP:iin liittyvät yhdisteet) avulla saatujen tulosten kanssa. Tämän tutkimuksen perusteella elektronista kieltä voidaan soveltaa rutiininomaiseen laadunvalvontaan toimitusketjun missä tahansa vaiheessa. Sähköistä kieltä käyttämällä havait- tiin myös makueroja eri kalalajien (Thamnaconus modestus, Sebastiscus marmoratus, Inimicus japonicus ja Pagrus major) lihan happamuuden, karvauden, umamin ja suolaisuuden suhteen (Mabuchi ym. 2018). Markkinoilla on myös kaupallisia elektronisia kieliä (Kuva 13). Niitä käytetään elintarvikkeiden, juomien ja lääkkeiden makujen arviointiin. Laitteita voidaan soveltaa tutkimukseen ja tuoteke- hitykseen, laadunvalvontaan ja laadunvarmistukseen. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 40 Astree-mittauslaite, Alpha MOS, Ranska (https://www.alpha-mos.com). Kuva Alpha MOSin luvalla https://www.alpha-mos.com/sites/default/files/alphamos/images/photo- astree-autosampler-computer-operator2.jpg 4.10. Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia - NMR Ydinmagneettinen resonanssispektrometria (NMR, nuclear magnetic resonance spectrometry) perustuu sähkömagneettisten aaltojen määrittämiseen radiotaajuusalueella. NMR-tekniikalla saadaan tarkkaa ja yksityiskohtaista tietoa näytteiden kemiallisesta koostumuksesta ja mole- kyylirakenteista. Molekyylin NMR-spektri on ikään kuin molekyylin sormenjälki, jonka perus- teella se voidaan tunnistaa ja tehdä sen rakenteesta päätelmiä. Menetelmällä voidaan analy- soida seoksia molekyylitasolla nopeasti ilman, että tarvitaan erottamis- ja/tai puhdistusvaiheita (Hatzakis 2018). NMR-tekniikkaa voidaan soveltaa monipuolisesti kalan koostumuksen ja laatua määrittävien yhdisteiden mittaamiseen. NMR-menetelmällä saadaan tarkkoja ja spesifisiä tuloksia nopeasti. NMR-tekniikkaa on käytetty esimerkiksi kalan rasvahappopitoisuuksien määrittämiseen, kalan laatuun liittyvien nukleotidien ja nukleosidien määrittämiseen, kalan alkuperän tunnistamiseen, sekä tuoreen ja jäädytetyn-sulatetun kalan erottamiseen kemiallisten markkeriyhdisteiden pe- rusteella. (Erikson ym. 2012) Monista eduistaan huolimalla NMR-menetelmien käyttöönottoa rajoittaa NMR-laitteiden kallis tekniikka sekä määrityksiin tarvittavat spesifiset kalibroinnit. Toisaalta, kun kalibroinnit ovat kunnossa, menetelmä on helppokäyttöinen. Perinteiset laitteistot vaativat erillisen näytteen- oton, jolloin tulee kiinnittää huomiota edustavien ja homogeenisten näytteiden ottamiseen. Viime aikoina on kehitetty ja kaupallistettu matalan resoluution laitteita, jotka ovat halvempia ja pienempiä sekä paremmin sovellettavissa teollisuuteen (Hatzakis 2018), esimerkkikuva lait- teistosta on esitetty Kuvassa 14. Uutta tekniikkaa edustaa esimerkiksi kuljetettava laite (ns. NMR mouse), joka mahdollistaa jopa alle 20 s analyysiajan ja on-line - ja in vivo -analyysit https://www.sensor-test.de/ausstellerbereich/upload/mnpdf/en/profilemouse.pdf). NMR-me- netelmällä on monipuolista potentiaalia silakan laadun määrittämiseen ja laatuun vaikuttavien tekijöiden tunnistamiseen. Viime aikoina kehitettyjen laitteiden ja tekniikan soveltuvuutta laa- dun määrittämiseen ketjun eri vaiheissa tulisi selvittää lisää. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 41 Helppokäyttöinen ja nopeatoiminen NMR-laite tutkimuskäyttöön. Laitetta myy Buck Scientific. Kuva: Nanalysis Corp. luvalla https://www.bucksci.com/products/nmr-benchtop- spectrometer. 4.11. Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetri – DSC Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetri (engl. differential scanning calorimetry, DSC) mittaa faasimuutoksiin ja kemiallisiin reaktioihin liittyvää entalpiaa ja määrittää lämpötilan, jossa nämä prosessit tapahtuvat. Tekniikkaa käytetään mm. materiaalien tunnistamiseen ja karakterisoin- tiin. Mittaukset voivat antaa sekä määrällistä että laadullista tietoa fysikaalisista ja kemiallisista muutoksista, joihin liittyy endoterminen (energiaa kuluttava) ja eksoterminen (energiaa tuot- tava) prosessi, tai muutoksia lämpökapasiteetissa (Gill ym. 2010). DSC sopii hyvin elintarvikkeiden analysointiin, koska valmistusprosesseihin liittyy usein kuu- mennus ja/tai jäähdyttäminen. DSC-menetelmää voidaan käyttää sekä laadunvalvontaan että T&K tarkoituksiin. DSC on helppo käyttää eikä useimmissa tapauksissa vaadi erityistä näytteen valmistelua. Menetelmä soveltuu sekä kiinteiden että nestemäisten elintarvikkeiden analysoin- tiin (Gill ym. 2010; Biliaderis 1983). Tyypillisiä määrityksiä, joita elintarvikkeilla tehdään DSC- menetelmällä ovat öljyjen, rasvojen ja levitteiden sulamis- ja hyytymislämpötilat, polysakkari- dien gelatoituminen ja kristallisaatio, sekä proteiinien denaturoituminen ja aggregaatio (Farkas & Mohácsi-Farkas 1996). Kala ja kalatuotteet ovat tyypillisesti herkkiä lämpötilan muutoksille. DSC on edullinen ja helppokäyttöinen menetelmä, jota voidaan hyödyntää tunnistamaan läm- pötilaan liittyviä muutoksia kalan laadussa, erityisesti kalan rakenteeseen liittyviä muutoksia. Menetelmällä voidaan tuottaa soveltuvaa tietoa myös uusien kalatuotteiden kehittämisessä. DSC-laitteistoja on saatavilla analyyttisestä laboratoriomittakaavasta teolliseen mittakaavaan. Kuvassa 15 on esitetty esimerkkinä kaupallisesti saatavilla oleva laitteisto, joka soveltuu sekä teollisuuden että tutkimuksen käyttöön tuotekehityksessä ja laadunvalvonnassa. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 42 DCS 8000 -differentiaalinen pyyhkäisykalorimetri. Kuva PerkinElmerin luvalla https://www.perkinelmer.com/fi/product/dsc-8000-lab-system-n5340511. 4.12. Kaksiulotteinen elektroforeesi (2DE) Kaksiulotteisella polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (engl. two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D-PAGE) tarkoitetaan proteiinianalyysiä, jossa näytteen proteiinit erotel- laan ensin isoelektrisen pisteensä perusteella (isoelektrinen fokusointi) ja sen jälkeen edelleen molekyylipainon perusteella (SDS-PAGE) toisiaan vastaan kohtisuorissa suunnissa. Isoelektri- nen fokusointi erottelee proteiinit niiden isoelektristen pisteiden perusteella. Ajo suoritetaan ohuessa kapillaariputkessa, johon valettuun geeliin muodostetaan pH-gradientti liuosten avulla sähkökentässä. Kun proteiinit joutuvat gradienttiin sähkökentässä, ne liikkuvat varauk- sensa mukaisesti joko anodia tai katodia kohti. Ne lähestyvät omaa isoelektristä pistettään, jossa niiden nettovaraus on nolla, ja pysähtyvät siihen. Tämän jälkeen samasta näytteestä aje- taan SDS-PAGE kohtisuorassa suunnassa, jolloin isoelektrisen pisteensä mukaisesti erottuneet proteiinit erottuvat toisistaan vielä molekyylipainonsa mukaan. Proteiinit paikannetaan geelistä sopivalla menetelmällä (proteiinivärjäys- tai vasta-aineperusteinen Western blot) analysointia varten. Kuva 16 havainnollistaa menetelmän kulkua ja tulokseksi saatavaa proteiinikarttaa. Me- netelmän erotuskyky on yksiulotteista geelielektroforeesia parempi, ja sillä pystytään erottele- maan samanaikaisesti huomattavan suuria määriä erilaisia proteiineja toisistaan. Kaksisuuntaisen geelielektroforeesin toimintaperiaate. Kuva Creative Proteomicsin luvalla https://www.creative-proteomics.com/services/2d-electrophoresis-2.htm. Ensimmäi- sessä vaiheessa proteiinit erotellaan isoelektrisen pisteensä perusteella ja toisessa vaiheessa edelleen molekyylikoon perusteella. Tuloksena saadaan ns. proteiinikartta. Elintarviketieteiden alueella 2DE on ollut käytössä melko pitkään, ainakin kaksi vuosikymmentä. Tässä ajassa elektroforeesitekniikka ja proteiinipisteiden tunnistamiseen käytettävät ohjelmis- tot ovat kehittyneet siten, että menetelmä on nykyään edullisempi sekä toistettavuudeltaan ja Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 43 erotuskyvyltään parempi aiempaan verrattuna. Kalan laatuun liittyen tyypillisiä sovelluskohteita ovat kala- ja äyriäistuotteiden proteomitutkimukset (Kjærsgård ym. 2006; Piñeiro ym. 1998) ja alkuperän todentamiseen (Martinez & Jakobsen Friis 2004; Martinez ym. 2007) sekä vesivilje- lyyn ja kalojen fysiologiaan liittyvät tutkimukset (Kjærsgård & Jessen 2003). 2DE on ensisijaisesti tutkimuskäyttöön sopiva menetelmä. Se tarjoaa paljon yksityiskohtaista ja syvällistä tietoa kalan proteiineista liittyen esimerkiksi kalan laadun muodostumiseen kalan elinkaaren aikana. Menetelmä vaatii monivaiheisen ja varsin tarkan näytteiden esikäsittelyn ja tulosten tulkinta syvällistä tieteellistä asiantuntemusta proteomiikasta. Tämän vuoksi mene- telmä ei sellaisenaan toimi nopeana analyysityökaluna kalan laadun määrittämiseen kalastus- aluksilla ja/tai prosessoinnissa. Toisaalta menetelmä tarjoaa monipuolisia mahdollisuuksia sila- kan laadun muodostuksen syvällisempään ymmärrykseen sekä laatuun liittyvien markkeriyh- disteiden ja biokemiallisten reaktioiden tunnistamiseen. Tämä tieto voi auttaa kehittämään uu- sia tehokkaita menetelmiä laadunvarmistukseen ja parantamiseen. Laboratoriokäyttöön tarkoi- tettuja 2DE -laitteistoja on saatavilla kaupallisesti useilta laitevalmistajilta, esimerkiksi 2-D Electrophoresis, Bio-Rad Laboratories Inc., USA (Kuva 17). 2DE-analyysilaitteisto ja reagenssit. Kuva: Bio-Rad Laboratories Inc., USA luvalla https://www.bio-rad.com/en-fi/category/2-d-electrophoresis?ID=6916a228-0f95-4b26-a37a- 5e4afe76add7 4.13. Terahertsispektroskopia ja -kuvannus Terahertsialue (THz) tarkoittaa sähkömagneettisen spektrin hyvin kapeaa aluetta mikroaalto- ja infrapuna-alueiden välillä, taajuusalueella 0,1–10 THz. THz-alue sähkömagneettisessa spekt- rissä on havainnollistettu kuvassa 18. THz-aalloilla on ainutlaatuisia ominaisuuksia, jotka vas- taavat osin mikro- ja infrapuna-aaltojen ominaisuuksia. Terahertsiaallot voivat tunkeutua ja olla vuorovaikutuksessa monien yleisesti käytettyjen materiaalien kanssa, mikä tekee niistä sopivia sekä perustutkimukseen että teollisuuteen. THz-säteily on erinomainen ei-ionisoiva vaihtoehto röntgensäteille, koska sillä pystytään tuottamaan korkean resoluution kuvia kiinteän kappaleen sisältä. Monilla yhdisteillä on ainutlaatuiset absorptio- ja hajontaominaisuudet THz-alueella. THz-spektroskopialla ja -kuvannuksella voidaan tehdä määrityksiä kahdella eri tavalla: a) taa- juusaluemääritykset käyttäen THz-lähdettä ja detektoria jatkuvatoimisesti sekä b) aika- aluemääritykset (engl. THz time domain spectroscopy). (Gowen ym. 2012) Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 44 THz-alue sähkömagneettisessa spektrissä. Kuva Boston Electronicsin luvalla https://blog.3g4g.co.uk/2018/07/terahertz-and-beyond-100-ghz-progress.html. Tekniikka kehitettiin 1990-luvun alkupuolella, mutta tekniikan kalleus ja säteilylähteiden sekä detektorien tehottomuus rajoittivat tuolloin tekniikan laajempaa käyttöönottoa. Viime aikoina on tapahtunut merkittävää kehitystä säteilylähteiden ja detektorien tekniikassa, mikä on pa- rantanut menetelmän suorituskykyä huomattavasti. Huomattavaa vaikutusta on ollut esimer- kiksi lasertekniikan kehittymisellä. Kehityksen myötä THz-spektroskopia ja -kuvantaminen on siirtynyt laboratoriomittakaavan tekniikasta monipuoliseksi kuvantamisvälineeksi, jolla on mo- nia käytännön sovelluksia, joista yksi esimerkki on elintarvikkeiden laadunvalvonta. (koostear- tikkeli Afsah-Hejri ym. 2019) Viime vuosina THz-spektroskopian ja -kuvantamisen on todettu olevan lupaava menetelmä elintarvikkeiden tarkastamiseen ja laadunvalvontaan. THz-spektroskopialla saadaan sekä laa- dullista että määrällistä tietoa elintarvikenäytteistä. THz-tekniikan tärkeimpiä sovelluksia elin- tarviketeollisuudessa ovat kosteuden ja vierasesineiden havaitseminen ja laadunvalvonta. Muita THz-spektroskopian sovelluksia elintarviketeollisuudessa ovat haitallisten yhdisteiden, antibioottien ja mikro-organismien havaitseminen (Gowen ym. 2012). THz-spektroskopia on hyvä työkalu myös elintarvikkeiden koostumuksen, esimerkiksi hiilihydraattien, aminohappo- jen, rasvahappojen ja vitamiinien määrittämiseen (koosteartikkeli Afsah-Hejri ym. 2019). THz-tekniikan käyttöä rajoittavat sirontavaikutus, rajallinen herkkyys ja se, että elintarvikeyh- disteille ei ole vielä saatavilla kattavaa tietokantaa. THz-spektroskopia on edelleen myös melko kallis tekniikka. Myös skannausnopeutta tulee kehittää seuraavissa THz-järjestelmissä. Haas- teista huolimatta THz-tekniikka on jo vakiintunut elintarviketeollisuudessa tehokkaana työka- luna havainnointiin ja kvantitointiin (koosteartikkeli Afsah-Hejri ym. 2019). THz-spektroskopia ja -kuvantaminen vaikuttavat monipuolisuutensa vuoksi lupaavalta menetelmältä silakan laa- dun analysointiin. Menetelmän mahdollisuudet ulottuvat kemiallisten yhdisteiden ja mikro-or- ganismien analysoinnista vierasesineiden havaitsemiseen. Menetelmän sovellusmahdolli- suutta, sopivien yhdisteiden löytymistä tietokannoista ja kustannustehokkuutta tulisi tutkia li- sää. Kaupallisia laitteita löytyy moniin eri käyttötarkoituksiin (Kuva 19). Teollisuuden käyttöön on saatavilla terahertsikuvantamiseen tarkoitettuja kameroita ja skannereita, jotka soveltuvat käy- tettäväksi monien teollisten prosessien tarkkailuun. Kameran tai skannerin lisäksi kuvantamista varten tarvitaan säteilylähde. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 45 Terahertsikamera vasemmalla, -skanneri keskellä ja säteilylähde oikealla (Mesurex, Spain). Kuvat Terasensen www.terasense.com luvalla https://www.mesurex.com/en/pro- ducts/terahertz-cameras-and-sensors 4.14. Rakenteen mittaus Rigor mortis -tilassa kalan liha pehmenee helposti, mikä luonnollisesti vaikuttaa sen rakentee- seen. Siksi kalojen tuoreutta arvioidaan pääasiassa niiden rakenteen perusteella. Rakennepara- metrien avulla myös tutkitaan ja arvioidaan kalan laatua arvoketjussa seuraamalla erilaisten kalan käsittely- ja prosessointimenetelmien vaikutusta kalan säilyvyyteen ja kuluttajahyväksyn- tään. Erityisesti kalan käsittely- ja prosessointilämpötilojen on havaittu vaikuttavan suuresti ka- lan rakenteeseen. Yleisimmät rakennevirheet ovat kalan lihasten pehmeneminen ja lihasjaok- keiden irtaantuminen (gaping). Nämä ongelmat liittyvät enimmäkseen kemiallisen koostumuk- sen muutoksiin ja lihasproteiinien hajoamisiin. Kalan rakenteeseen ja rakenteen mittaukseen vaikuttavat erilaiset fyysiset (kalalajit, ikä ja koko, rehun aineosat, näytteen heterogeenisuus ja lihasjaokkeiden irtaantuminen), kemialliset (vesipitoisuus ja sen jakauma, rasvapitoisuus ja sen jakauma sekä kollageenipitoisuus) ja prosessitekniset tekijät (varastointiaika ja lämpötila, jää- dyttäminen, jäähdytys, sekä suolaaminen ja savustus). (Cheng ym. 2014) Kalan rakenteeseen liittyvää laatua mitataan joko aistinvaraisin menetelmin tai rakennemitta- reilla. Perinteinen aistinvarainen menetelmä on ns. sormitesti. Siinä arviointi suoritetaan paina- malla kalaa tai kalafilettä sormella. Tulos perustuu suurelta osin asiantuntijapaneelin subjektii- viseen arviointiin. Rakennemittareilla saatujen tulosten on osoitettu olevan täsmällisempiä kuin aistinvaraisilla menetelmillä, koska niissä inhimillisistä tekijöistä johtuva vaihtelu on vähäisem- pää. (Cheng ym. 2014) Kalan rakenteen mittaukseen ja arviointiin käytettävät instrumentaalitekniikat ja -menetelmät perustuvat leikkaus-, lävistys-, jännitys- tai puristusvoiman mittaamiseen. Leikkausvoiman määrittämiseen käytetään joko Kramer tai Warner-Bratzler -leikkauskennoa. Kramer-leikkaus- kenno sisältää yläosan terineen, joka painetaan näytteen sisältävään laatikkoon, jossa on raot terille (Kuva 20 A). Laite ilmoittaa tuloksen leikkausvoima-aika -kuvaajana. Menetelmä sopii ns. bulk-näytteiden mittaamiseen. Näyte valmistetaan mittaukseen joko siten, että keiton jälkeen kalafileet pilkotaan, sekoitetaan huolellisesti ja pakataan yhtenäiseksi kerrokseksi laatikkoon tai laatikkoon levitetään tasaisesti vakiomäärä kuutioitua ja kypsennettyä kalalihaa. Sitä on käy- tetty myös vertailumenetelmänä ei-hajottavien mittausten, kuten UV/VIS-spektroskopian, kanssa (Isaksson ym. 2002). Menetelmä vaatii suhteellisen paljon näytettä ja on aikaa vievä. Warner-Bratzler -leikkauskenno puolestaan koostuu terästä, jossa on kaksi leikkuureunaa 60 asteen kulmassa ja joka tunkeutuu tasoon, jossa on rako (Kuva 20 B). Terä leikkaa näytteen kuten giljotiini ja näytteeseen kohdistuu siten monimutkainen jännitys-, puristus- ja leikkaus- voimien yhdistelmä. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 46 A) Kramer-leikkauskenno. Kuva Stable Micro Systems:in luvalla https://3.bp.blogs- pot.com/-6zQ0RbXC4to/U57gXyjdRGI/AAAAAAAAA_A/EBTLHJyBwhw/s1600/kramer-cell.jpg B) Warner-Bratzler -leikkauskenno. Kuva Stable Micro Systems:in luvalla https://3.bp.blogs- pot.com/-mbVIOY3Ajs4/UvItXhtzJ1I/AAAAAAAAAmQ/M611R4MqBts/s1600/blade-fish.jpg Lävistystestissä mitataan voimaa, jolla kartiomainen, lieriömäinen tai kiilamainen mittauspää uppoaa elintarvikkeeseen tai murtaa mitattavan elintarvikkeen rakenteen (Kuva 21). Laite il- moittaa tuloksen voima-aika -kuvaajana, josta käy ilmi mittaukseen kulunut aika sekä murta- miseen tarvittava voima. Käyrä nousee ylöspäin, kunnes elintarvikkeen rakenne antaa periksi, jolloin käyrä alkaa äkillisesti laskea. Mittauspää tunkeutuu joko vakiosyvyyteen tai murtumis- pisteeseen. Käytetty voima voi kasvaa lineaarisesti tai vakiona. Testiä tehdessä pitää miettiä, millaista tukea käyttää tutkittavan elintarvikkeen alla, koska vääränlainen tuki saattaa aiheuttaa virheitä tuloksiin. Mitattavan tuotteen tulisi olla kolme kertaa suurempi kuin mittauspää tai murenevilla tuotteilla jopa enemmän. (Vallin, 2016) Kalafileen kiinteyden mittaus palloanturilla. Kuva Stable Micro Systems:in luvalla https://www.stablemicrosystems.com/images/secondary-image/food/spherical-probe- fish.jpg A B Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 47 Vetotestauksessa näyte kiinnitetään kahden puristimen väliin vakioetäisyydellä toisistaan (Kuva 22). Kuormausvarsi (kiinnitetty yläpuristimeen) liikkuu ylös vakionopeudella venyttäen näytettä. Näyte muuttaa muotoaan ensin elastisesti ja sitten plastisesti. Jos näytteen rikkomi- seen vaadittava voima on kuormituskennon rajoissa, tapahtuu murtuma. Vetotestauslaitteisto. Kuva Stable Micro Systems:in luvalla https://3.bp.blogs- pot.com/-ZOVH2wu8DXs/W2L8uJjo3LI/AAAAAAAAGQI/z7RLXIEq6NcoPs5vPHPVSdId- VuJyZNNwACLcBGAs/s320/hdplus-tensile.jpg Mitattava näyte leikataan käsipainon muotoiseksi tai liuskoiksi. Jos näytettä ei valmisteta huo- lellisesti, se voi johtaa puristimien luistamiseen tai näytteen ennenaikaiseen murtumiseen. Mit- taamalla vedon aikaista voimaa ja kappaleen venymää saadaan voima-venymäkäyrä, jonka avulla voidaan laskea muun muassa venytettävän näytteen vetolujuus ja murtovenymä. Veto- lujuus (Tensile strenght, TS, MPa) lasketaan jakamalla maksimivoima (N, joka tarvitaan näyte- kalvon katkeamiseen) näytekalvon poikkileikkauksen pinta-alalla (m2). Näytekalvon keskimää- räistä paksuutta käytetään näytteen poikkipinta-alan laskemisessa. Murtovenymä (Elongation at break, EAB, %) lasketaan jakamalla kalvon venymä (mm) murtumishetkellä näytteiden alku- peräisellä tartuntapituudella (esimerkiksi 50 mm) kerrottuna 100 %. Puristustestissä mitattavaa näytettä puristetaan kahdella yhdensuuntaisella tasaisella pinnalla, joista toinen on kiinteä ja toinen liikkuva. Testi suoritetaan joko puristamalla näytettä vakio- määrä (prosentuaalinen muodonmuutos) tai ennalta asetettuun voima-arvoon. Puristuksen ai- kana näytteen muoto muuttuu mutta tilavuus ei muutu. Mittausanturin tulisi olla suurempi kuin näyte. Testi voi myös olla ns. ei-hajottava, jos käytetty voima ei ole riittävä aiheuttamaan näyt- teelle peruuttamattomia vaurioita. Jauhetulle ja keitetylle kalatuotteelle käytetään puristusvoi- maa, joka aiheuttaa 50 % muodonmuutoksen. Jauhetulle tuoreelle kalalle käytetään puristus- voimaa, joka aiheuttaa 30 %, ja tai fileille käytetään puristusvoimaa, joka aiheuttaa 10 % muo- donmuutoksen. Toinen puristustestin muoto on ns. rakenneprofiilianalyysi (engl. texture profile analysis, TPA). TPA-menetelmä perustuu näytteen puristamiseen kahdesti edestakaisella liikkeellä. Tes- tillä jäljitellään puremisliikettä. Voima-aikakäyrän (Kuva 23) avulla voidaan määrittää erilaisia rakenneparametreja, kuten kovuus (hardness, ensimmäisen puristuksen maksimivoima) tai joustavuuus (cohesiveness, area 1/area 2). Lisää parametrejä ja niiden laskemisohjeita löytyy linkistä: https://texturetechnologies.com/resources/texture-profile-analysis. Taulukkoon 8 on koottu esimerkkejä instrumentaalimenetelmien käytöstä kalan rakenteen mittauksessa ja Ku- vassa 24 on esitetty Stable microsystemsin valmistamia erilaisia rakennemittareita. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 48 TPA-testin voima-aika-kuvaaja. Kuva Texture Techogies Corporation:in luvalla https://texturetechnologies.com/resources/texture-profile-analysis. Esimerkkejä instrumentaalimenetelmien käytöstä kalan ja kalatuotteiden raken- teen mittauksessa. Kalalaji Testi/ominaisuus Rakenteeseen vaikuttava tekijä Viite Turska (G. morhua) Kramer Pyydystystapa ja vuodenaika Botta ym. 1987 Piikkikampela (Scophthalmus maximus), file Kramer Erilaiset keittomenetelmät Madeira & Penfield 1985 Kirjolohi (O. mykiss) Puristustesti Kalarehu, lihaksen rasvapitoi- suus ja varastointiaika jäissä Andersen ym. 1999 Lohi (S. salar), file WB, lävistystesti (litteäpäinen sauva ja pallomainen anturi) Fileen kosteus Jonsson ym. 2001 Jättilabeo (Labeo rohita) Lävistystesti (litteäpäinen sauva) Varastointi jäissä Jain ym. 2007 Lohi (S. salar) WB, TPA, uusi vetotesti Savustus Ashton ym. 2010 Katla (Catla catla), jättilabeo (L. rohita), Intian-mutakarppi (Cirrhinus mrigala) TPA/gelatiinin geelinmuodos- tus Kalalaji Chandra & Shama- sundra 2015 Monni (Silurus glanis) TPA, aistinvarainen arviointi Keittäminen ja pakastus Bland ym. 2018 WB = Warner-Bratzler, TPA = rakenneprofiiilianalyysi Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 49 Stable Micro Systemsin rakennemittareita. Kuva Stable Micro Systems:in luvalla https://www.stablemicrosystems.com/images/main-image/ta-range-C.jpg 4.15. Arvio soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille Fysikaalis-kemiallisia menetelmiä on olemassa useita ja ne mittaavat eri asioita (Taulukko 9), joten tarkoituksenmukaisen menetelmän valitseminen ketjun eri vaiheisiin ja laitteiden kalib- rointi mitattaville suureille vaatii perehtyneisyyttä. Menetelmien etuja ovat, että ne ovat näy- tettä tuhoamattomia, nopeita ja soveltuvat usein on-line -menetelmiksi sekä niitä voidaan käyt- tää ketjun useassa eri vaiheissa. Kalan sähköisten ominaisuuksien muutoksiin perustuvat Torrymeter sekä Fischtester VI ovat edelleen käyttökelpoisia, kaupallisesti saatavia, koko ketjun seurantaan soveltuvia kalan tuo- reusmittareita, mutta ne ovat epäherkkiä ja alttiita erilaisille virhemittauksille. Sähkökemiallinen impedanssispektrosopia (EIS) antaa kalan koostumuksesta tarkempaa informaatiota. EIS- laite on myös kaupallisesti saatavissa (esimerkiksi https://certifiedqualityseafoods.com/). Konenäköä voidaan käyttää laaduntarkkailussa ja kemiallisten ominaisuuksien analysoinnissa koko arvoketjussa, myös kalankasvatuksessa. Konenäköteknologia tarjoaa joustavuutta ja hy- vää toistettavuutta suhteellisen alhaisilla kustannuksilla sekä sallii melko nopean tuotannon lä- pivirtauksen tarkkuutta vaarantamatta. Raman-spektroskopia on lupaava menetelmä, jolla voidaan määrittää kokonaisen, prosessoi- dun tai pakastetun kalan fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia sekä todeta kalan aitous ja alku- perä. Kaupalliset pikalaitteet eivät sellaisenaan sovellu suomalaisten kalalajien monitorointiin, joten uusi sovellusalue vaatii tutkimus- ja kehitystyötä. VIS/NIR -spektroskopiaa voidaan hyödyntää monipuolisesti kalan laaduntarkkailussa ja ke- miallisten ominaisuuksien analysoinnissa koko arvoketjussa. Menetelmään perustuvia kaupal- lisia laitteita on saatavilla sekä laboratoriokäyttöön että prosessinohjaukseen. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 50 Hyperspektrikuvantamisen sovellusmahdollisuudet kalan laadun analysoinnissa ovat moni- puoliset. Sitä voidaan käyttää esimerkiksi kalan tuoreuden, mikrobiologisen ja aistittavan laa- dun sekä kemiallisten koostumuksen määrittämisessä koko arvoketjussa. Uusi sovellusalue vaa- tii tutkimus- ja kehitystyötä. Elektronista nenää voidaan hyödyntää kalan tuoreuden tai pilaantumisen arvioinnissa ketjun eri vaiheissa. Sen avulla voidaan esimerkiksi havainnoida mikrobien tuottamia haihtuvia yhdis- teitä. Menetelmä soveltuu tuoreen kalan ja kalatuotteiden lisäksi myös kalajauholle. Sen avulla voidaan tunnistaa ja erottaa varastoidun kalajauhon erilaiset tuoreusasteet. Lisäksi sitä voidaan hyödyntää myös lajittelussa, esimerkiksi erottelemaan eri kalalajit toisistaan. Elektronista kieltä voidaan soveltaa kalan ja kalatuotteiden rutiininomaiseen tuoreuden ja tuoteturvallisuuden valvontaan toimitusketjun missä tahansa vaiheessa. Keinokielen avulla voi- daan esimerkiksi analysoida biogeenisten amiinien muodostumista ja kalan mikrobiologisen laadun muutoksia. Lisäksi sitä on käytetty arvioimaan raskasmetallien (Cd, Pb ja Hg) jäämiä kalasta. Differentiaalista pyyhkäisykalorimetriä (DSC) voidaan hyödyntää esimerkiksi tunnistamaan lämpötilaan liittyviä muutoksia kalan laadussa, erityisesti kalan rakenteeseen liittyviä muutok- sia. Menetelmä on edullinen ja yksinkertainen, mutta menetelmän herkkyys on rajallinen. Me- netelmän käyttö on mahdollista ketjun eri vaiheissa. Terahertsispektroskopia ja -kuvantaminen vaikuttaa monipuolisuutensa vuoksi lupaavalta menetelmältä silakan laadun analysointiin. Menetelmän mahdollisuudet ulottuvat kemiallisten yhdisteiden ja mikro-organismien analysoinnista vierasesineiden havaitsemiseen. Menetelmän sovellusmahdollisuutta, sopivien yhdisteiden löytymistä tietokannoista ja kustannustehok- kuutta tulisi tutkia lisää. Kalan tuoreutta voidaan arvioida myös sen rakenteen (kovuuden/pehmeyden) avulla rakenne- mittareilla. Lisäksi proteiinikoostumusta voidaan tutkia kaksisuuntaisella elektroforeesilla. Nämä menetelmät ovat pikemminkin tutkimukseen soveltuvia menetelmiä eivätkä sovi kalan tuoreuden seuraamiseen arvoketjussa yhtä hyvin kuin muut yllä mainitut menetelmät. Fysikaalis-kemiallisia analysointimenetelmiä. Menetelmä Soveltu-vuus Hyödyt Haasteet Muuta Fischtester kalan tuoreuden mittausmene- telmä koko arvo- ketjussa Laadunval- vonta ja tutki- mus •Kaupallisesti saatavilla •Mittaus tehdään kalan läpi, ei siten näytteenkäsittelyä •Epäherkkä •Altis erilaisille virhemittauk- sille Kaupallisia laitteita: Intellec- tron International Electronics, Hamburg, Germany (Fishtester VI (IT) Torrymeter kalan tuoreuden mittausmene- telmä koko arvo- ketjussa Laadunval- vonta ja tutki- mus •Kaupallisesti saatavilla •Helppokäyttöinen: elektrodit painetaan tiiviisti kalan toi- selle sivulle, ei siten näyt- teenkäsittelyä •Epäherkkä •Altis erilaisille virhemittauk- sille Kaupallisia laitteita: Distell In- dustries Ltd, Fauldhouse, West Lothian, UK (Torryme- ter) Värin mittaus Väriä mitataan värimittarilla, joka antaa numeeriset arvot väreille. Laadunval- vonta ja tutki- mus •Kun värille mitataan arvot, eliminoidaan epämääräisyys värien kuvaamisesta. •Voidaan laskea ja tallentaa eri mittausten välinen väriero. •Potentiaali Suomessa lä- hinnä tuotteistuspuolella, ei niinkään kalan tuoreuden seurannassa •Värin mittaamiseen on ole- massa erilaisia värianalysaat- toreita, värisensoreita ja spektrofotometreja, kuten Spectropen®. Myös ko- nenäköä voidaan käyttää. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 51 Sähkökemialli- nen impedans- sispektroskopia (EIS) Mittaa kalan ku- dosten sähköisiä ominaisuuksia. Laadunval- vonta ja tutki- mus •Antaa kalan koostumuk- sesta ja tuoreudesta tarkem- paa tietoa •Näytettä tuhoamaton •Kaupalliset laitteet yksinker- taisia ja nopeita käyttää •Mahdollistaa reaaliaikaisen laadun seurannan •Kalibroitava silakalle •Kaupallisia laitteita: Certified Quality Reader, CQ Foods Inc., USA https://certifiedqual- ityseafoods.com/ Konenäkö mekaniikka, opti- nen instrumen- tointi, sähkömag- neettisen säteilyn havaitseminen sekä digitaalisen kuvainformaation automaattinen havainnointi ja tulkinta Laadunval- vonta ja tutki- mus •Nopea •Ei vaadi näytteenkäsittelyä •Näytettä tuhoamaton •Tarjoaa joustavuutta ja hy- vää toistettavuutta suhteelli- sen alhaisilla kustannuksilla •Sallii melko nopean tuotan- non läpivirtauksen tarkkuutta vaarantamatta. •Teknologian soveltaminen suomalaisten kalalajien mo- nitorointiin vaatii tutkimus- ja kehitystyötä. nettilinkkejä https://www.vi- siononline.org/vision-resour- ces.cfm Raman-spektro- skopialla tunnis- tetaan molekyy- lejä ja selvitetään niiden kemiallisia ominaisuuksia ja rakenteita. Laadunval- vonta ja tutki- mus •Nopea •Ei vaadi näytteenkäsittelyä •Näytettä tuhoamaton •Kaupalliset pikalaitteet ei- vät sellaisenaan sovellu suomalaisten kalalajien mo- nitorointiin, joten uusi sovel- lusalue vaatii tutkimus- ja kehitystyötä. Esimerkki TellSpecsin laite siian laaduntarkkailuun reaali- aikaisesti https://tells- pec.com/eit-food/fishproject/ VIS/NIR-spektro- skopia analysoidaan ke- miallisia ominai- suuksia sähkö- magneettisen sä- teilyn avulla. Laadunval- vonta ja tutki- mus •Kaupallisia laitteita saata- villa sekä laboratoriokäyttöön että prosessinohjaukseen •Prosessilaitteet näytettä tu- hoamattomia •Prosessilaitteet eivät vaadi näytteenkäsittelyä •Tarkoitukseen sopivien lait- teiden valinta On-line/In-line laitteet (anturit) teollisuuteen https://www.buchi.com/en/pro- ducts/nir-online/nir-online-pro- cess-analyzer, myös kalare- hun valmistukseen https://sta- tic1.buchi.com/sites/default/fi- les/NIR-Online_Solu- tion_Brochure_en.pdf. https://www.grainsense.com/ Hyperspektriku- vaus spektroskopian ja kuvantamistekno- logian yhdistelmä Laadunval- vonta ja tutki- mus •Nopea •Ei vaadi näytteenkäsittelyä •Näytettä tuhoamaton •Monipuoliset sovellusmah- dollisuudet koko arvoket- jussa •Saadaan samanaikaisesti tietoa tietoa kohteen fysikaa- lisista ja geometrisistä piir- teistä (muoto, koko, ulkonäkö ja väri) sekä kemiallisesta koostumuk-sesta spektriana- lyysin perusteella. •Teknologian soveltaminen silakan tai muun suomalai- sen kalan laadunvalvontaan vaatii tutkimus- ja kehitys- työtä. Nofima the Norwegian Insti- tute of Food, Fisheries and Aquaculture Research kehittä- nyt sovelluksen turskan auto- maattiseen lajitteluun jo en- nen kuin ne toimitetaan jalos- tamoille Elektroninen nenä Mittaa haihtuvia yhdisteitä. Laadunval- vonta, tuoteke- hitys ja tutki- mus, monipuo- liset sovellus- mahdollisuudet koko arvoket- jussa. •Nopea •Ei vaadi näytteenkäsittelyä •Näytettä tuhoamaton •Soveltaminen silakan tai muun suomalaisen kalan kanssa vaatii tutkimus- ja kehitystyötä •Sovelluksia kehitettäessä on syytä käyttää vertailume- netelmiä, joiden avulla voi- daan arvioida tekonenän erottelukykyä tutkittaville näytteille ja löytää perusteet näytteiden erottumiselle. Tällaisia vertailumenetelmiä ovat esimerkiksi aistinvarai- Saatavilla sekä kannettavia että laboratoriotason laitteita Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 52 nen arviointi, haihtuvien yh- disteiden määritykset kaasu- kromatografisesti ja mikro- biologiset määritykset. Elektroninen kieli Mittaa elintarvik- keiden makuomi- naisuuksia. Laadunval- vonta, laadun- varmistus, tuo- tekehitys ja tut- kimus, moni- puoliset sovel- lusmahdolli- suudet koko arvoketjussa. •Nopea •Ei vaadi yleensä näytteen esikäsittelyä •Näytettä tuhoamaton •Voidaan analysoida myrkyl- lisiä näytteitä •Objektiivinen arviointi •Soveltaminen silakan tai muun suomalaisen kalan laadunvalvontaan vaatii tut- kimus- ja kehitystyötä •Herkkä ympäristötekijöi- den, kuten lämpötilan, vai- kutuksille Saatavilla laboratoriotason laitteita Ydin- magneettinen resonanssispek- trometria (NMR) Tutkimus ja tuotekehitys Monipuoliset mahdollisuudet kalan koostu- muksen ja laa- tua määrittä- vien yhdistei- den mittaami- seen •Tarkkoja ja spesifisiä tulok- sia nopeasti •Voidaan analysoida seoksia molekyylitasolla nopeasti il- man, että tarvitaan erottamis- ja/tai puhdistusvaiheita •Soveltuu mm. kalan rasva- happopitoisuuksien määrittä- miseen, kalan alkuperän tun- nistamiseen, sekä tuoreen ja jäädytetyn-sulatetun kalan erottamiseen •Kallis tekniikka •Määrityksiin tarvittavat spe- sifiset kalibroinnit (kuitenkin helppokäyttöinen, kun kalib- roinnit on tehty) •Perinteiset laitteistot vaati- vat erillisen näytteenoton, jolloin tulee kiinnittää huo- miota edustavien ja ho- mogeenisten näytteiden ot- tamiseen. Viime aikoina on kehitetty ja kaupallistettu matalan reso- luution laitteita, jotka ovat hal- vempia ja pienempiä ja pa- remmin sovellettavissa teolli- suuteen. Uutta tekniikkaa edustaa esi- merkiksi kuljetettava laite (ns. NMR mouse), joka mahdollis- taa jopa alle 20 s analyysiajan ja on-line - ja in vivo -analyy- sit. Differentiaalinen pyyhkäisykalo- rimetri (DSC) Tutkimus, tuo- tekehitys, teol- lisuus. Tyypillisiä määrityksiä ovat sulamis- ja hyytymis- lämpötilojen, geelinmuodos- tuksen ja kitey- tymisen, sekä proteiinien de- naturoitumisen määrittäminen. •DSC on helppo käyttää eikä useimmissa tapauksissa vaadi erityistä näytteen val- mistelua •DSC on edullinen ja help- pokäyttöinen menetelmä •Menetelmää voidaan hyö- dyntää tunnistamaan lämpö- tilaan liittyviä muutoksia ka- lan rakenteessa. •Menetelmä sellaisenaan ei suoraan sovellu kalan laa- dun määrittämiseen. DSC-laitteistoja on saatavilla analyyttisestä laboratoriomit- takaavasta teolliseen mitta- kaavaan sekä teollisuuden, että tutkimuksen käyttöön. Molemmat laitteet soveltuvat sekä teollisuuden, että tutki- muksen käyttöön tuotekehi- tyksessä. Kaksiulotteinen polyakryyli-ami- digeelielektrofo- reesi (2D-PAGE) Tutkimus •Saadaan yksityiskohtaista ja täsmällistä tietoa näyttei- den proteiinikoostumuksesta •Vaatii erityisosaamista, lait- teistoa ja kemikaaleja •Mittaukset ja tulosten tul- kinta vievät melko paljon ai- kaa Terahertsispekt- roskopia ja -ku- vannus Elintarvikkei- den tarkasta- minen ja laa- dunvalvonta. Mahdollisuuk- sia kemiallisten yhdisteiden ja mikro-organis- mien analy- soinnista vie- rasesineiden havaitsemi- seen. •Saadaan sekä laadullista että määrällistä tietoa elintar- vikenäytteistä •Monipuolinen, nopea ja te- hokas menetelmä •Toistaiseksi kallis tekniikka •Käyttöä rajoittavat rajalli- nen herkkyys, sirontavaiku- tus, ja se, että elintarvikeyh- disteille ei ole vielä saata- villa kattavaa tietokantaa Kaupallisia laitteita löytyy mo- niin eri käyttötarkoituksiin. Haasteista huolimatta tek- niikka on jo vakiintunut elintar- viketeollisuudessa tehok- kaana työkaluna havainnoin- tiin ja kvantitointiin. Rakenteen mit- taus Mittaa kalan li- haksen raken- netta. Tuotekehitys ja tutkimus Rakennemittareilla saatujen tulosten on osoitettu olevan täsmällisempiä kuin aistinva- raisilla menetelmillä saadut tulokset. •Vaatii erityisosaamista •Pääsääntöisesti näytteet tuhoutuvat mittauksissa •Laitteet melko kalliita •Mittaukset usein aikaa vie- viä, vaativat useita toistoja Useita laitevalmistajia Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 53 5. Mikrobiologiset menetelmät 5.1. Johdanto Kaloissa voi esiintyä monenlaisia ihmisten terveyteen haitallisesti vaikuttavia biologisia vaara- tekijöitä, kuten patogeenisiä organismeja ja toksiineja. Ne voivat aiheuttaa sairauksia kalan- syönnin seurauksena tai muuta reittiä (EFSA, 2010). Kalan nahassa, kiduksissa ja suolistossa esiintyy luontaisesti erilaisia mikrobeja. Ulosteperäisiä mikrobeja voi esiintyä erityisesti rannik- koalueilla, ja kala voi kontaminoitua pyydystämisen jälkeen tai prosessoinnissa (Novoslavskij ym. 2016). Kaloissa luontaisesti esiintyviä patogeenisiä organismeja ovat loiset (muun muassa Anisakis spp.), virukset (muun muassa hepatiitti A ja kalikivirus), bakteerit Clostridum botulinum, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila sekä Listeria mono- cytogenes. Lisäksi kaloissa voi esiintyä Enterobacteriaceae-heimon bakteerilajeja, kuten Salmo- nella spp., Shigella spp. ja Escherichia coli. Kaloissa mahdollisesti esiintyvät toksiinit voivat olla lämmönkestäviä, vesiliukoisia biotoksiineja, kasviplanktonin tuottamia toksiineja sekä biogee- nisiä amiineja (EFSA, 2010). Helposti pilaantuvien kalastustuotteiden mikrobiologista laatua valvotaan tarkasti Euroopan Unionin (EU) jäsenmaiden alueella (Eviran ohje 16023/5). Mikrobiologista elintarviketurvalli- suutta säätelee mikrobikriteeriasetus (EY) No 2073/2005, jonka mukaan elintarvikealan toimi- joiden on varmistettava, että elintarvikkeiden turvallisuudelle ja prosessin hygienialle asetetut vaatimukset täyttyvät. Toimija valvoo tuottamiensa elintarvikkeiden turvallisuutta omavalvon- nan avulla. Turvallisuusvaatimuksissa tietyille elintarvikepatogeeneille, niiden tuottamille tok- siineille tai aineenvaihduntatuotteille on asetettu pitoisuuksien sallitut raja-arvot. Suomalaisissa kala-alan laitoksissa tämä turvallisuusvaatimus koskee erityisesti L. monocytogenes -bakteeria (Ruokaviraston ohje 4095/04.02.00.01/2020/3). Mikrobiologisessa analysoinnissa toimijat voivat käyttää omavalvonnassaan mikrobikriteeri- asetuksessa mikrobiologiselle vaatimukselle asetettua vertailumenetelmää (yleensä CEN- tai ISO-menetelmä) tai Ruokaviraston listaamia vaihtoehtoisia menetelmiä. Myös muita analyysi- menetelmiä voidaan käyttää edellyttäen, että menetelmä on validoitu mikrobikriteeriasetuksen vertailumenetelmää vastaan EN/ISO 16140 -standardin tai muun samanlaisen, kansainvälisesti hyväksytyn protokollan mukaisesti. (Ruokaviraston ohje 4095/04.02.00.01/2020/3). Tuotanto- ympäristön ja -laitteiden pintapuhtausnäytteiden analyysimenetelmistä ei säädetä mikrobikri- teeriasetuksessa. L. monocytogenes -bakteerin lisäksi toinen vakavia ruokamyrkytyksiä aiheuttava bakteeri on C. botulinum, joka kasvaa vain hapettomissa olosuhteissa. Sen itiöitä esiintyy yleisesti maaperässä, vesistöjen pohjalietteessä sekä kalojen ja muiden eläinten suolistossa. C. botulinum -bakteerin tuottama hermomyrkky, botuliini, aiheuttaa halvaustilan, eli botulismin, joka saattaa johtaa kuolemaan. Botuliinia syntyy elintarvikkeessa bakteerin kasvuvaiheen aikana, kun elintarviketta säilytetään yli 3 °C:n lämpötilassa hapettomissa olosuhteissa. Suolatut ja kuivatut lihatuotteet, säilykkeet sekä lämminsavustetut, vakuumipakatut kalat ovat ruokamyrkytysbotulismin ylei- simmät tartuntalähteet (Ruokavirasto 2019a). Botulismi on harvinainen Suomessa, eikä bak- teeri-itiöiden, bakteerin, tai niiden tuottamien toksiinien esiintyvyyttä valmiissa elintarvikkeissa seurata järjestelmällisesti (Ruokavirasto 2019b). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 54 Elävän kalan mikrobiomi on lajikirjoltaan hyvin laaja, ja osa lajeista aiheuttaa raaka-aineen pi- laantumisen (Gram & Huss 1996). Säilytysolosuhteet luovat sopivat kasvuolosuhteet osalle ka- lassa olevista mikrobeista, jolloin ne pystyvät lisääntymään toisia lajeja paremmin. Jotkut näistä lajeista ovat aktiivisia pilaajia, sillä ne muodostavat lisääntyessään aineenvaihduntatuotteita, minkä seurauksena elintarvikkeeseen syntyy sivumakuja ja -hajuja (Gram ym. 1987). Kalassa on paljon aminohappoja ja usein myös trimetyyliamiinioksidia (TMAO), joita monet bakteerit hyö- dyntävät energiantuotannossaan (Gram & Dalgaard 2002). Kalatuotteiden pilaajamikrobit tuot- tavat aminohapoista muun muassa ammoniakkia, biogeenisiä amiineja, orgaanisia happoja ja rikkiyhdisteitä. Monet mikrobit pelkistävät TMAO:a trimetyyliamiiniksi (TMA), mistä tulee pi- laantuvalle kalalle ominainen ammoniakkinen sivumaku (Gram & Dalgaard 2002). Tyypilliset pilaajalajit ovat erilaisia riippuen muun muassa säilytyslämpötilasta ja siitä, onko kala säilötty vai tuore (Gram & Huss 1996). Kylmässä säilytetyn tuoreen kalan pilaajia ovat osa Pseu- domonas-suvun lajeista (Parlapani ym. 2013; Boziaris & Parlapani 2016) sekä rikkivetyä tuotta- vat bakteerit, joita ovat erityisesti Shewanella-sukuun kuuluvat S. putrefaciens ja S. baltica (Fon- nesbech Vogel ym. 2005). Lämpimässä säilytetty kala puolestaan pilaantuu usein enterobak- teerien sekä Vibrio- ja Aeromonas-sukuihin kuuluvien bakteerien vaikutuksesta (Gram ym. 1987; Gram ym. 1990; Parlapani ym. 2013). Pakkausmenetelmä vaikuttaa myös suuresti kalan säilyvyyteen ja siihen, mitkä mikrobilajeista pystyvät kasvamaan tuotteessa (Rudi ym. 2004). Suojakaasuun tai vakuumiin pakattu kala pilaantuu yleisimmin Photobacterium phosphoreum - bakteerin ja eri maitohappobakteerien, kuten Carnobacterium spp. ja Brochotrix thermosphacta, vaikutuksesta (Dalgaard 1995; Rudi ym. 2004; Boziaris & Parlapani 2016). Pilaaja- tai muiden haitallisten bakteerien pitoisuuksille ei ole lainsäädännöllisiä raja-arvoja, mutta Elintarviketeollisuusliitto (ETL) on koostanut suositukset mikrobiologisista ohjausarvoista viimeisenä käyttöpäivänä (ETL 2017). Kaloille ja kalajalosteille on suositukset muun muassa rik- kivetyä tuottavien pilaajabakteerien ja aerobisten mikrobien enimmäismääristä. Elintarvikediagnostiikassa käytettävien analyysimenetelmien kirjo on nykyisin laaja (Välimaa ym. 2015). Tässä kappaleessa esitellään mikrobiologiseen laadunvarmistukseen käytettäviä va- lidoituja, kaupallisesti saatavilla olevia viljely-, immunologisia ja molekulaarisia (nukleiinihap- poperusteiset) menetelmiä sekä proteiinirakenteiden tunnistukseen perustuvia menetelmiä. 5.2. Viljelymenetelmät Viljelymenetelmät perustuvat kohdeorganismin moninkertaistumiseen kasvatusliemessä tai -agarissa siten, että lukumäärän kasvu voidaan nähdä sameutena, värinmuutoksena tai laskea pesäkkeinä mikrobikohtaisten inkubointiolosuhteiden jälkeen (Jasson ym. 2010). 5.2.1. Elintarvikepatogeenien määrittäminen Viljelymenetelmiä käytetään edelleen virallisina, hyväksyttyinä määritysmenetelminä sekä elin- tarvikepatogeenien määrityksessä. Esimerkiksi L. monocytogenes -bakteerin osalta ISO 11290- 1:1996 -menetelmällä kohdeorganismin esiintyminen tai poissaolo määritetään yleensä 25 grammassa ruoka-ainetta. Menetelmässä elintarvikenäyte ensin esirikastetaan esirikastus- liemessä, jotta lähes kuolleet, stressaantuneet, bakteerit saadaan toipumaan ja lisääntymään. Sen jälkeen vaihdetaan selektiivinen rikastusliemi. Sen tarkoituksena on lisätä kohdeorganis- mien määrää estämällä kilpailevien mikrobien kasvua. Rikastusvaihetta seuraa bakteerien kas- vatus selektiivisillä kasvualustoilla. Tulos varmistetaan mikroskooppisin, biokemiallisin, serolo- gisin tai geneettisin testein (Jasson ym. 2010). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 55 Tuloksen saaminen kuitenkin kestää jopa useita päiviä: negatiivisen tuloksen saaminen vie 4–5 vuorokautta (esirikastus, rikastus, eristys selektiiviselle agarille). Positiivisen tuloksen varmista- miseen (maljaus ja inkubointi agarilla ja biokemialliset varmistukset) vie lisäksi aikaa (Jasson ym. 2010). Taulukossa 10 on esitetty mikrobikriteeriasetuksen mukainen vertailumenetelmä ja sille vaihtoehtoinen menetelmä L. monocytogenes -bakteerille (Elintarvikkeiden mikrobiologiset vaatimukset, komission asetuksen (EY) No 2073/2005 soveltaminen - Eviran ohje 10501/2, Evira 2009 ja Mikrobiologisten menetelmien ja niille vaihtoehtoisten menetelmien luettelo, 5.3.2019). Mikrobikriteeriasetuksen mukainen vertailumenetelmä ja sille vaihtoehtoinen menetelmä L. monocytogenes -bakteerille. Mikrobi Asetuksen mukainen vertailumenetelmä Vaihtoehtoinen menetelmä L. monocytogenes SFS-EN ISO 11290-1:2017 (raja-arvo ei todettu/ 25 g näytettä) NMKL 136: 2010 SFS-EN ISO 11290-2:2017 (raja-arvo 100 pmy/g) 5.2.2. Mikrobiologisen laadun määrittäminen Kalan ja muiden elintarvikkeiden mikrobiologisen laadun mittarina käytetään yleisimmin bak- teerien kokonaismäärää. Myös rikkivetyä tuottavien bakteerien määrittäminen on tärkeää kyl- mässä säilytetyn tuoreen kalan osalta, sillä niiden määrän on havaittu vastaavan melko tarkasti kalan aistinvaraista laatua (Gram & Dalgaard 2002; Fogarty ym. 2019b). Sekä kokonaisbaktee- rimäärästä että rikkivetyä tuottavien bakteerien määrästä viimeisenä käyttöpäivänä on ole- massa Elintarvikeliiton koostamat ohjearvot (ETL 2017). Viljelymenetelmillä voidaan tutkia myös muita kalatuotteen mikrobiologisen laadun kannalta tärkeitä mikrobiryhmiä, kuten sulfiittia pelkistäviä klostrideja (ETL 2017). Kokonaismikrobimäärä määritetään usein standardoiduilla menetelmillä, jotta menetelmä olisi yhdenmukainen ja tulokset vertailukelpoisia. ISO 4833-2:2013 -menetelmän mukaan kalatuo- tetta hienonnetaan viljelyä varten ja siitä valmistettu laimennussarja levitetään viljelyalustan pinnalle. Viljelyalustana käytetään yleisalustaa, Plate count agaria, jossa mahdollisimman moni viljeltävissä oleva bakteerilaji pystyy muodostamaan pesäkkeitä. Viljeltyjä maljoja pidetään läm- pökaapissa 30 °C:n lämpötilassa kolmen vuorokauden ajan, jonka jälkeen maljoille muodostu- neet pesäkkeet lasketaan. Kalojen viileän elinympäristön ja vaihtolämpöisyyden vuoksi kala- tuotteissa on kuitenkin myös sellaisia mikrobeja, jotka eivät kasva riittävän nopeasti tai ollen- kaan 30 °C:n lämpötilassa (Gram & Huss 1996). Tällaiset kylmiin oloihin sopeutuneet bakteerit, eli psykrotrofit, voivat lisääntyä jääkaappilämpötilassa ja ovat siksi yleensä vastuussa kylmäsäi- lytetyn kalan pilaantumisesta. Siksi 30 °C:n lisäksi kokonaismikrobimäärän määrittämiseen käy- tetään usein myös kylmempiä lämpötiloja, kuten 6,5 °C:ta (ISO 17340:2019). Suomessa Elintar- viketeollisuusliitto on koostanut suosituksen elintarvikkeiden mikrobiologisista arvoista viimei- senä käyttöpäivänä (ETL 2017). Suosituksen mukaan tuoreen tai pakastetun kalan tai äyriäisten kokonaismikrobimäärän ei tule toistuvasti ylittää tasoa 106 pesäkettä muodostavaa yksikköä grammassa elintarviketta (pmy/g) viimeisenä käyttöpäivänä. Jos 107 pmy/g taso ylittyy, toimi- jan on tehtävä riskiarviointi ja ryhdyttävä tarvittaessa toimenpiteisiin elintarvikkeen mikrobio- logisen laadun parantamiseksi. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 56 5.2.3. Valikoivat kasvatusalustat (kromogeeniset kasvualustat) Kromogeenisiä kasvatusalustoja käytetään vähentämään kasvatusjaksojen ja biokemiallisten testien määrää, ja siten nopeuttamaan ja helpottamaan mikrobien tunnistusta. Kyseisissä kas- vatusalustoissa tiettyjä värejä (kromogeeninen aine) ja entsyymiin yhdistettyä kromogeenistä substraattia käytetään erottamaan kohdeorganismi helposti muista mikrobeista. Mikrobin kas- vaessa entsyymiin sidotun substraatin vapautuminen kasvualustaan nähdään värin muutok- sena sekä joissain tapauksissa saostuskehänä (Dwivedi & Jaykus 2011; Jasson ym. 2010). Kromogeenisiä kasvatusalustoja on olemassa sekä elintarvikepatogeenien että pilaajamikro- bien määrittämiseen. Kuvassa 25 on esimerkki Listeria-lajien tunnistukseen soveltuvasta RA- PID'L.Mono -kromogeenisestä kasvatusalustasta, joka perustuu fosfatidylinositolifosfolipaasi (PIPLC) -entsyymin aktiivisuuteen sekä ksyloosi-sokerin käyttökykyyn. L. monocytogenes- ja Lis- teria ivanovii -bakteereilla on PIPLC-aktiivisuus, jolloin pesäkkeet nähdään värillisinä, kun taas muilta lajeilta se puuttuu, ja pesäkkeet nähdään valkoisina. Ksyloosin käyttökyvyn perusteella erottelu perustuu siihen, että L. monocytogenes -bakteeri ei pysty käyttämään ksyloosia, jolloin pesäkkeet nähdään sinisinä ja kehättöminä. Sen sijaan L. ivanovii- bakteeri pystyy käyttämään ksyloosia, jolloin sen tuottamat pesäkkeet ovat sinivihreitä keltaisen kehän ympäröimiä. (bio- rad) Listeria -lajit RAPID'L.Mono kromogeenisella kasvualustalla (Bio-Rad). Vasemmalta lukien L. monocytogenes (PIPLC+, xylose–), L. ivanovii (PIPLC+, xylose+), Listeria welshimeri (PIPLC–, xylose+) ja Listeria innocua (PIPLC–, xylose–). Kuva Bio-Radin luvalla, muotoiltu läh- teestä https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_3046B.pdf Kromogeenisia agareita löytyy useilta eri valmistajilta. Päivitetyt tiedot AFNORin validoimista kasvatusalustoista löytyvät osoitteesta https://nf-validation.afnor.org/en/wp-con- tent/uploads/sites/2/2014/04/List-of-methods-certified-NF-VALIDATION-Food.pdf. Taulu- kossa 11 on listattu viljelymenetelmiä yleisimmille pilaajamikrobeille. Esimerkiksi rikkivetyä tuottavien bakteerien tunnistamiseen käytetään rauta-agaria, jossa rikkivetyä tuottavat baktee- rit voidaan erottaa mustina pesäkkeinä. Viljelymenetelmiä yleisimpien pilaajamikrobien määrittämiseen elintarvikkeista. Mikrobiryhmä Viljelyalusta ISO-standardi /Viite Enterobakteerit Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) ISO 21528-2:2017 Pseudomonas spp. ja Aeromonas spp. Pseudomonas-Aeromonas-selektiiviagar Kielwein ym. 1969, Kielwein 1971 Pseudomonas spp. CFC-agar ISO 13720:2010 Vibrio spp. ISO 21872-1:2017 Maitohappobakteerit De Man Rogosa Sharpe agar (MRSA) ISO 15214:1998 Rikkivetyä tuottavat bakteerit Lyngby-rauta-agar Gram ym. 1987 Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 57 5.3. Immunomääritysmenetelmät Immunomääritysmenetelmät perustuvat erityisen spesifiseen vasta-aineen ja antigeenin väli- seen sitoutumiseen. Vasta-aineen tarttumisosa tunnistaa tarkasti antigeenimolekyylin raken- neosan epitooppin ja sitoutuu siihen. Vasta-aineen sitoutumisvoimakkuus määrää menetelmän herkkyyden ja spesifisyyden. Vasta-aine voi olla monoklonaalinen tai polyklonaalinen. Mo- noklonaalisella vasta-aineella saadaan tunnistettua täsmällisesti yksi epitooppi, jolloin esimer- kiksi yksittäisen bakteerilajin serotyyppi saadaan tunnistettua. Polyklonaalisella vasta-aineella voidaan tunnistaa useita saman tai monien antigeenien epitooppeja. Sillä voidaan tunnistaa tietyt bakteerilajit, esimerkiksi Listeria-lajit. Immunomääritysmenetelmissä tarvitaan näytteen rikastusvaiheita ennen varsinaista mittausta, ja postitiivinen tulos vaatii varmistuksen standar- dimenetelmällä. (Jasson ym. 2010). Elintarvikediagnostiikassa on kaupallisesti saatavilla monen- laisia immunomääritysmenetelmiä, joista tässä yhteydessä käsitellään lateraalivirtaustestejä (la- teral flow devices, LFD) sekä ELISA- (enzyme linked immunosorbent assay) ja ELFA (enzyme linked fluorescent assays) -menetelmiä. 5.3.1. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ELISA-menetelmä on immunologisen ja entsymaattisen määritysmenetelmän yhdistelmä. ELISA-menetelmiä on erilaisia, ja elintarvikediagnostiikassa käytetyt menetelmät ovat yleisim- min ns. sandwich-menetelmiä. Siinä kohdespesifiset sieppaajavasta-aineet sidotaan esimerkiksi 96-kuoppalevyn pohjalle, näyte lisätään, ja siinä mahdollisesti olevat kohdeantigeenit sitoutu- vat vasta-aineisiin. Sitoutumaton näyte pestään pois. Seuraavaksi lisätään detektoiva vasta- aine, joka sitoutuu antigeeniin. Tämän jälkeen lisätään entsyymiin liitetty vasta-aine, jonka an- netaan sitoutua detektoivaan vasta-aineeseen. Sitoutumattomat vasta-aine-entsyymikomplek- sit pestään pois. Viimeiseksi lisätään substraatti, jonka entsyymi muuntaa mitattavaksi väril- liseksi yhdisteeksi (Jasson ym. 2010). Substraatti voi olla esimerkiksi piparjuuriperoksidaasi (horseradish peroxidase, HRP), alkaalinen fosfataasi (alkaline phosphatase) ja β-galaktosidaasi (Yeni ym. 2014). ELISA-testejä on kaupallisesti saatavissa erilaisten elintarvikepatogeenien ja niiden toksiinien sekä ympäristönäytteiden määrittämiseen. Esimerkiksi BIOCONTROL:n valmistama TRANSIA® PLATE Listeria monocytogenes -testi (http://www.biocontrolsys.com/as- sets/uploads/14051955097-transia-plate-listeria-monocytogenes-dfu-englishrev-02.pdf.) on tarkoitettu määrittämään L. monocytogenes elintarvike- ja ympäristönäytteistä. Testi on spesifi- nen, sillä siinä ei tule ristireaktioita saman suvun eri lajien, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi ja L. murrayi, kanssa. L. monocytogenes -bakteerin suhteen esirikastetusta näytteestä negatiivinen tulos saadaan 46 tunnin inkuboinnin jälkeen. Positiivinen tulos on var- mistettava biokemiallisin testein (Valderrama ym. 2016). 5.3.2. ELFA (enzyme linked fluorescent assays) ELFA-menetelmä on pääperiaatteeltaan ELISA-menetelmän kaltainen, mutta analysoinnin pää- tepisteessä mitataan fluoresenssi. Kaupallinen VIDAS®-menetelmä koostuu muovisesta pipe- tistä (SPR*, the Solid Phase Receptacle), jonka sisäpintaan vasta-aineet on sidottu ja testilius- kasta, jossa on tarvittavat analysointireagenssit käyttövalmiina. Nestemäinen, rikastettu näyte pipetoidaan reagenssiliuskaan, joka asetetaan mini VIDAS®- laitteeseen (Vaz-Velho ym. 2000). (Nykyisin on saatavilla myös monipaikkaisempia VIDAS®- ja VIDAS® 3 -laitteita. https://www.biomerieux-diagnostics.com/vidas-solution). Laite suorittaa ELFA:n siirtämällä näytettä automaattisesti SPR:n kaivoissa, jotka sisältävät tarvittavat laimennus- ja pesuliuokset sekä entsyymikonjugoidun vasta-aineen ja substraatin, 4-metyyliumbelliferyylifosfaatin. Vasta- Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 58 aineeseen konjugoitu entsyymi, alkaalinen fosfataasi, katalysoi substraatin hydrolyysiä fluore- soivaksi tuotteeksi, 4-metyyliumbelliferoniksi. Syntyvä fluoresenssi mitataan aallonpituudella 450 nm (Kuva 26). Instrumentti analysoi tuloksen automaattisesti ja tulkitsee sen joko positii- viseksi tai negatiiviseksi. Testaukseen kuluu noin 45 min–2 h testisarjasta riippuen. Positiivinen tulos on varmistettava standardimenetelmällä (Vaz-Velho ym. 2000). Kaupallinen VIDAS®-menetelmä. Kuva julkaistu bioMérieux:n luvalla https://www.biomerieux-nordic.com/product/vidasr-solution. Uusimmassa VIDAS UP®-menetelmässä käytetään kohteen vasta-aineiden sijasta kohdes- pesifisiä rekombinantteja faagiproteiineja, jotka on leimattu alkaalisella fosfataasilla (Chajęcka‐ Wierzchowska ym. 2012). Bakteriofaagit (faagit) ovat bakteereita tappavia viruksia, ja ovat erit- täin isäntäspesifisiä pystyen infektoimaan vain saman lajin tai jopa vain tietyn kannan baktee- reita. Ne tunnistavat isäntäbakteerinsa tietyn pintarakenteen ja kiinnittyvät solun pintaan hän- nän avulla (Hagens & Loessner 2007). Menetelmään on saatavissa useita kittejä eri mikrobien, esimerkiksi AFNORin validoimia kittejä L. monocytogenes -bakteerin määrittämiseen https://nf- validation.afnor.org/en/food-industry/listeria-monocytogenes/. Menetelmää hyödynnetään omavalvonnassa ja viranomaisnäytteiden seulonnassa. 5.3.3. Lateraalivirtaustestit Lateraalivirtaustesti (lateral flow assay, LFA) on ELISA-testin muunnos, joka perustuu vasta-ai- neen ja sen kohdemikrobin, esimerkiksi patogeenin, väliseen, paljain silmin nähtävään reakti- oon. Huokoisesta kalvosta, kuten nitroselluloosasta, valmistetussa kiinteässä testialustassa on omat kohtansa lisättävälle näytteelle, sieppaajavasta-aineelle ja detektoivalle vasta-aineelle, jo- hon on yhdistetty esimerkiksi kolloidinen kulta- tai lateksipartikkeli. Näyte kulkeutuu alustaa pitkin kapillaarisesti, ja siinä oleva kohdemolekyyli sitoutuu detektoivaan vasta-aineeseen. Syn- tynyt kompleksi siirtyy jälleen kapillaarisesti kohti sieppaajavasta-ainetta, ja tulos nähdään pal- jain silmin värillisenä viivana. Kontrollia, sitoutumatonta vasta-ainetta, varten on oma sieppaus- vyöhykkeensä. Kohdespesifinen reaktio nähdään kontrollista eroavana viivana. Lateraalivirtaus- testit ovat edullisia ja helppoja käyttää. Itse kvalitatiivinen mittaustulos saadaan nopeasti, mutta näyte täytyy rikastaa ja saatu tulos on varmistettava biokemiallisin ja serologisin testein (Val- derrama ym. 2016; Dwivedi & Jaykus 2011). Esimerkiksi Neogenin valmistamassa Reveal for L. monocytogenes -testissä mittausaika on 2 tuntia, mutta rikastusaika on 30–48 tuntia, jolloin mittaukseen kuluu aikaa yhteensä 32–50 tuntia (Valderrama ym. 2016). Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 59 5.4. Nukleiinihappoihin perustuvat menetelmät 5.4.1. Polymeraasiketjureaktio Polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on geenitekniikan menetelmä, jossa tunnettua DNA-jaksoa monistetaan siihen sopivien alukkeiden avulla. Alukkeet ovat ly- hyitä DNA-jaksoja, jotka sitoutuvat tutkittavaan DNA:han, jos sitä on näytteessä. Reaktiossa voi käyttää myös useita alukepareja, jolloin esimerkiksi usean eri patogeenin toteaminen näyt- teestä on mahdollista yhtäaikaisesti (monianalyysi-PCR) (Espiñeira ym. 2010). PCR tehdään läm- pösyklilaitteessa, joka vuoroin lämmittää ja viilentää näytettä (Candrian 1995). Lämpötilavaih- telun avulla DNA:n kaksoisjuosteet saadaan irtoamaan toisistaan, ja yksijuosteisia molekyylejä mallina käyttäen rinnalle valmistetaan uudet juosteet tiettyjä entsyymejä käyttäen (Kuva 27). Monistussyklien aikana tutkittavan DNA:n määrä näytteessä kasvaa eksponentiaalisesti. PCR- monistustuotteita voidaan kuvantaa elektroforeesilla agaroosi-geelissä, jolla monistunut DNA saadaan näkyviin tiettyinä vyöhykkeinä. Tuloksen lopulliseksi varmistamiseksi vyöhykkeiden si- sältämä DNA voidaan tunnistaa tarvittaessa sekvensoimalla DNA:n nukleiinihappojärjestys. Polymeraasiketjureaktion vaiheet. DNA-kaksoisjuosteet irtoavat toisistaan (1), jolloin alukkeet pääsevät kiinnittymään yksijuosteisiin molekyyleihin (2). Uudet DNA-juosteet raken- tuvat vapaina olevista nukleotideista yksijuosteisia molekyylejä mallina käyttäen (3). Kuva: Jaana Huotari/VTT. Viljelypohjaisiin menetelmiin verrattuna PCR on nopeampi ja tarkempi, sillä sen avulla voidaan havaita näytteestä myös pieniä populaatioita ja mikrobeja, joita ei pystytä viljelemään (Can- drian 1995). Elintarvikemikrobiologiassa on käytössä useita PCR-pohjaisia sovelluksia, joita on sovellettu muun muassa lajintunnistukseen, virulenssigeenien tunnistukseen, ruokamyrkytys- ten ja ruuan aitouden tutkimukseen (Le Nguyen ym. 2008; Mafra ym. 2008; Espiñeira ym. 2010; Qin ym. 2011). PCR-menetelmiin patogeenien havaitsemiseksi elintarvikkeista on olemassa ISO-standardeja (mm. ISO 22174:2005) (Postollec ym. 2011). BAX® System (Hygiena, https://www.hygiena.com/endpt-pcr-works.html#) on kaupallinen esi- merkki PCR-pohjaisesta menetelmästä. Siinä BAX® System PCR tabletit sisältävät interkalatoi- van ja fluoresoivan värin, joka sitoutuu reaktiossa syntyvään kaksijuosteiseen DNA:han. Monis- tussyklin jälkeen näytteen lämpötila lasketaan tasolle, jossa DNA:n kaksoisjuosteet irtoavat toi- sistaan. Tällöin interkalatoiva väri vapautuu, mikä vähentää fluoresenssia. Laite laskee fluore- senssin muutoksen ja ilmoittaa joko negatiivisen tai positiivisen tuloksen. Positiivinen tulos on varmistettava biokemiallisin testein. Taulukossa 12 on esitetty BAX System -pikamenetelmään käytettävä aika L. monocytogenes -bakteerin määrittämisessä. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 60 BAX System -pikamenetelmään käytettävä aika L. monocytogenes -bakteerin määrittämisessä. Muotoiltu lähteestä Valderrama ym. (2016). Kitti Rikastusaika (h) Mittausaika (h) Kokonaisaika (h) BAX® System L. monocytogenes 24E 24–28 3,5 27,5–31,5 BAX® System L. monocytogenes 48 3,5 51,5 5.4.2. Reaaliaikainen PCR Reaaliaikainen PCR (quantitative PCR tai real-time PCR) on menetelmä, jossa paitsi tietyn DNA- jakson läsnäoloa myös sen määrää näytteessä voidaan mitata (Postollec ym. 2011). Reaktiossa rakentuva DNA-juoste voidaan havaita qPCR-laitteella sen rakentuessa, reaaliaikaisesti. QPCR- tuotteiden havaitseminen perustuu joko kaksijuosteiseen DNA:han sitoutuvien fluoresoivien värien tai koettimien käyttöön. Molemmissa tekniikoissa fluoresenssin voimakkuus kasvaa jo- kaisessa syklissä, jos PCR-tuotteen määrä reaktiossa lisääntyy. Havaittavissa olevan fluoresens- sin tuottamiseksi tarvittavien PCR-syklien määrä on riippuvainen siitä, kuinka monta kopiota DNA:sta oli alun perin näytteessä, joten menetelmän avulla voidaan laskea näytteen alkuperäi- nen DNA-pitoisuus (Postollec ym. 2011). Elintarvikemikrobiologiassa qPCR-menetelmää käyte- tään ruokaperäisten patogeenien sekä esimerkiksi hyötymikrobien havaitsemiseen ja niiden määrän laskemiseen näytteissä, sillä ne ovat usein viljelymenetelmiä nopeampia toteuttaa (Pos- tollec ym. 2011). Erilaisia qPCR (RT-PCR) -kittejä L. monocytogenes -bakteerin määrittämiseen on kaupallisesti saatavilla (Taulukko 13). Huomioitavaa on, että kaikkia kittejä ei voida ajaa kaikilla qPCR (RT- PCR) -laitteilla, vaan tarvitaan oma erityinen laite, kuten GeneDisc -teknologiassa (Pall Corpo- ration 2014). Esimerkkejä AFNORin validoimista qPCR (RT-PCR) -kiteistä L. monocytogenes - bakteerin määrittämiseen (AFNOR, 2020c. https://nf-validation.afnor.org/en/food-in- dustry/listeria-monocytogenes/). Valmistaja Menetelmä Qualicon Diagnostics, LLC BAX System RT PCR Assay Genus Listeria monocyto- genes Eurofins GeneScan Technologies GmbH BACGene Listeria monocytogenes Eurofins GeneScan Technologies GmbH BACGene Listeria Multiplex OXOID Ltd, Part of Thermo Fisher Scientific ThermoScientific SureTect Listeria monocyto- genes PCR Assay Qiagen GmbH QIAGEN mericon Manual Listeria monocytogenes/ Life Technologies Corporation, Part of Thermo Fisher Scientific MicroSEQ Listeria monocytogenes BIO-RAD iQ-Check Listeria monocytogenes II Pall GeneDisc Technologies GeneDisc Listeria monocytogenes bioMérieux GENE-UP Listeria monocytogenes Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 61 5.4.3. Isoterminen monistus Perinteisten ja reaaliaikaisten PCR-menetelmien lisäksi on kuvattu monia muitakin nukleiini- happojen monistusmenetelmiä. Silmukkavälitteisessä isotermisessä DNA -monistustekniikassa (Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP) reaktio tapahtuu vakiolämpötilassa (60–65 °C) nopeasti, tehokkaasti ja spesifisesti (Notomi ym. 2000). Spesifisyyttä ja nopeutta parantaa se, että LAMP sisältää useita alukepareja, jotka kohdistuvat kohdegeenin kuuteen eri alueeseen. Reaktion nopeuttamiseksi voidaan lisäksi käyttää silmukka-alukkeita (Notomi ym. 2000; Naga- mine ym. 2002). Lähtömateriaalina voidaan käyttää myös RNA:ta. LAMP ei vaadi erityistä lait- teistoa, vaan reaktiot voidaan monistaa tavanomaisessa laboratoriossa käytettävässä lämpö- hauteessa (Notomi ym. 2000). Monistustuotteiden muodostuminen voidaan havaita silminnäh- tävästi sameuden, värireaktion tai fluoresenssin avulla. LAMP-reaktiossa DNA-synteesin sivu- tuotteena muodostuvan magnesiumpyrofosfaatin vuoksi monistustuotteiden muodostuminen voidaan havaita sameutena (Notomi ym. 2015). Värireaktioon perustuvassa havainnoinnissa käytetään interkalatoivia värejä, kuten kalseiinia. Fluoresenssin perustuvassa detektoinnissa käytetään fluoresoivia värejä (esim. SYBR Green). Detektointi geelielektroforeesin avulla on myös mahdollista (Notomi ym. 2015; Wong ym. 2017). Monelaisia LAMP -menetelmään perus- tuvia määritysmenetelmiä ja sen erilaisia muunnoksia on kehitetty myös elintarvikepatogee- nien määrittämiseen elintarvikkeista ja ympäristönäytteistä (Wong ym. 2017). Esimerkkejä LAMP-teknologiaan perustuvista menetelmistä ovat L. monocytogenes -bakteerin määrittämi- seen tarkoitetut AFNORin validoimat kitit: 3M Molecular Detection Assay 2- Listeria (AFNOR 2020a) ja ANSR for Listeria spp (AFNOR 2020b). 5.4.4. Seuraavan sukupolven sekvensointi Viljelypohjaisia menetelmiä käytetään yhä yleisesti elintarvikkeiden mikrobiologisen laadun selvittämisessä. Kuitenkin vain murto-osa ympäristössä olevista mikrobeista pystytään havait- semaan käytössä olevilla viljelymenetelmillä (Whitman ym. 1998), joten niiden rinnalla käyte- tään myös uudempia, mikrobien geeniperimän sekvensointiin pohjautuvia teknologioita. Sek- vensointi tarkoittaa perintöaineksen (DNA:n tai RNA:n) sekvenssin eli emäsjärjestyksen selvit- tämistä, ja koska eri eliölajeilla sekvenssi on hieman erilainen, ne voidaan erottaa toisistaan sen perusteella. Seuraavan sukupolven sekvensointi (Next-generation sequencing, NGS) kattaa joukon erilaisia teknologioita, joiden avulla voidaan analysoida suuria määriä lyhyitä sekvens- sejä yhtäaikaisesti. Tämä nopeuttaa lajintunnistusta esimerkiksi PCR-tekniikkoihin verrattuna, sillä sekvensoimalla voidaan tutkia yhtäaikaisesti useita geenejä monesta eri näytteestä. Sekvensointia varten tutkittava DNA eristetään joko mikrobiviljelmästä tai suoraan näytteestä, esimerkiksi elintarvikkeesta. DNA:ta täytyy joissain tapauksissa pilkkoa tai monistaa ja siihen on lisättävä sekvensointiadapterit, eli pienet DNA-juosteet, joiden avulla sekvensoitava DNA saa- daan kiinnittymään sekvensointialustaan. Tätä vaihetta kutsutaan DNA-kirjaston valmista- miseksi. Analyysivaiheessa sekvenssejä verrataan sekvenssitietokantoihin, jolloin saadaan sek- vensseille taksonominen luokitus. Sekvenssidatan analysointiin on käytettävissä erilaisia ohjel- mistoja ja työkaluja, joista osa on pitkälle automatisoituja ja usein ilmaisia (Jagadeesan ym. 2019; High-Throughput Sequencing and Food Microbiology 2020). Ohjelmistojen käyttö ja tu- losten tulkinta vaatii kuitenkin asiantuntijuutta, sillä tällä hetkellä saatavilla ei ole teollisuudelle soveltuvia pikamenetelmiä (Jagadeesan ym. 2019). Elintarvikemikrobiologiassa seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmiä käytetään pääasi- assa joko yksittäisen viljelymenetelmillä eristetyn mikrobin koko genomin sekvensointiin tai tietyn geenialueen (markkerigeenialueen) kohdennettuun sekvensointiin, jossa tavoitteena on analysoida kaikki näytteen sisältämät mikrobit (Jagadeesan ym. 2019). Elintarviketeollisuudessa Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 62 kokogenomisekvensointia voidaan hyödyntää mikrobikontaminaation lähteen jäljittämiseen, sillä sen avulla voidaan tutkia esimerkiksi, onko jokin mikrobikanta tuotantotiloissa uusi vai toistuva (Jagadeesan ym. 2019). Kokogenomisekvensointi sopii myös antibioottiresistenssigee- nien ja patogeenisten kantojen määrittämiseen (Rantsiou ym. 2018). Markkerigeenialueiden sekvensoinnilla saadaan taksonominen luokitus teoreettisesti kaikille näytteessä oleville mikrobeille, jolloin voidaan tutkia monimuotoisia mikrobiyhteisöjä - myös niitä mikrobeja, joiden olemassaoloa ei osata epäillä, tai jotka eivät ole viljeltävissä (Jagadeesan ym. 2019). Mikrobipopulaatioiden muutoksia voidaan seurata ajan kuluessa, mitä on hyödyn- netty esimerkiksi fermentoitujen elintarvikkeiden (Roh ym. 2010) sekä pilaantumisen tutkimi- sessa (Chaillou ym. 2015). 5.5. Proteiinirakenteiden tunnistukseen perustuvat menetelmät 5.5.1. MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Lazer Desorption Ionization/Time of Flight Mass Spectrometry eli MALDI-TOF MS on teknologia, jonka avulla on mahdollista tunnistaa mikrobisoluja niiden proteiiniraken- teiden avulla suku- ja lajitasolle asti. Myös lajien alatyypitys on mahdollista, sillä esimerkiksi mikrobilääkeresistenssiin liittyviä proteiineja voidaan tunnistaa MALDI-TOF-menetelmällä (Bru- ker Daltonics Inc. 2019). Menetelmä perustuu massaspektrometriaan, jossa näyte ionisoidaan varautuneiksi molekyyleiksi niin, että niiden massan ja varauksen suhdetta voidaan mitata (Clark ym. 2013). Kuvassa 28 on kuvattu MALDI-TOF massaspektrometrian toimintaperiaate: mikrobimassaa hierotaan pieni määrä näytelevylle, jonka jälkeen se peitetään matriisiliuoksella ja annetaan kuivua, jolloin näytteen ja matriisin seos kiteytyy. Tämän jälkeen levy ladataan MALDI-TOF -laitteeseen. Laser ionisoi näytteen ja matriisin muodostamat makromolekyylit, ja ne kaasuuntuvat ja erottuvat massan ja varauksen mukaan laitteen TOF-massananalysaatto- rissa. Suurimassaiset ionit liikkuvat analysaattorin läpi pienimassaisia hitaammin, jolloin ne osu- vat laitteen MS-detektoriin eriaikaisesti. Näin muodostuu näytteelle ominainen massaspektro- metriprofiili, jota laitteen ohjelmisto vertaa referenssitietokantaan, eli kirjastoon, lajitunnistuk- sen saamiseksi. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 63 MALDI-TOF MS -menetelmän periaate. Mikrobimassaa hierotaan näytelevylle ja peitetään matriisiliuoksella. Levy ladataan MALDI-TOF -laitteeseen, joka erottelee näytteen sisältämät molekyylit niiden massan ja varauksen mukaan ja luo näytteelle MS-profiilin, jota verrataan laitteen referenssitietokantaan lajitunnistuksen saamiseksi. Clark ym. (2013), lisenssi kuvan käyttöön saatu kustantajalta. Mikrobien lajitunnistus on nopeaa MALDI-TOF MS -menetelmällä, ja sen käyttökustannukset ovat kohtuulliset verrattuna sekvensointiin ja biokemiallisiin tunnistusmenetelmiin. MALDI-TOF MS on tullut yleisesti käyttöön kliinisen mikrobiologian alalla, ja sitä on viime vuosina käytetty enenevissä määrin myös elintarvikeperäisten mikrobien tunnistuksessa (Peruzy ym. 2019). Tällä hetkellä MALDI-TOF-laitteita valmistavat Biomerieux (https://www.biomerieux-diagnos- tics.com/vitekr-ms-0 ja Bruker Daltronics https://www.bruker.com/en/products-and-soluti- ons/microbiology-and-diagnostics/microbial-identification.html), jonka MALDI Biotyper® - laite on esitetty Kuvassa 29. Molempien valmistajien ylläpitämiin referenssikirjastoihin kuuluu monia elintarvikkeisiin liittyviä lajeja, ja lisäksi käyttäjät voivat lisätä niihin itse mikrobikantoja. Bruker MALDI-TOF Biotyper on AOAC OMA -sertifioitu ISO 16140-6:2019 -standardin mukai- nen vaihtoehtoinen menetelmä Salmonella-, Cronobacter- ja Campylobacter-sukuihin kuulu- vien bakteerien (AOAC Official method 2017.09, 2017) sekä L. monocytogenes ja Listeria-sukuun kuuluvien bakteerien (AOAC Official method 2017.10, 2017) toteamiseen useilta eri kasvualus- toilta. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 64 MALDI Biotyper® (Bruker). Kuva: Jaana Huotari, VTT. 5.6. Kaupalliset pikatestit ympäristönäytteiden ottoon Mikrobiologisen puhtauden tarkkailua suositellaan osaksi elintarvikehuoneistojen omavalvon- tajärjestelmää (Ruokavirasto 2018). Siivoustoimien riittävyyttä voidaan tarkastella ottamalla pistokoeluontoisesti pinta- ja puhtausnäytteitä puhdistetuilta pinnoilta, kuten työtasoilta, leik- kuulaudoilta, eri työvälineistä ja astioista. Näytteenottoon on olemassa monenlaisia kaupallisia pikamenetelmiä, kuten Hygicult-kontaktilevyt (Orion Diagnostics) ja Petrifilm (3M) (Kuva 30), joilla näyte voidaan ottaa esimerkiksi kosketus- tai sivelymenetelmällä tutkittavasta pinnasta. Petrifilm on validoitu (Microval) ISO 4832:2006 standardia vasten vaihtoehtoiseksi menetel- mäksi β-glukoronidaasi-positiivisen E. coli -bakteerin ja koliformien määrän laskemiseen elin- tarvikkeista ja rehuista. Petrifilm-pikamenetelmä. Kuva: Jaana Huotari, VTT Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 65 5.7. Ennustava mikrobiologia Elintarvikealan toimijoiden on varmistettava, että tuottamansa elintarvikkeet täyttävät niille asetetut tai ilmoitetut mikrobiologiset, kemialliset ja aistinvaraiset vaatimukset myyntiajan lop- puun saakka. Tarvittaessa toimijoiden on määriteltävä turvallinen säilyvyysaika tuottamilleen tuotteille, joille asetetaan viimeinen käyttöajankohta tai parasta ennen -päiväys. Säilyvyystutki- muksia ei tarvitse tehdä kaikille elintarvikkeille, kuten valmistuspäivänä nautittavat elintarvik- keet. Tällöin voidaan käyttää yleisesti käytössä olevia säilyvyysaikoja. Mikrobiologiaan liittyviä säilyvyystutkimuksia tulisi tehdä, kun lainsäädäntö edellyttää sellaisia (esimerkiksi L. monocyto- genes sellaisenaan syötävissä elintarvikkeissa), kyseisen tuotteen säilyvyydestä ei ole riittävää näyttöä (esimerkiksi uudet tuotteet) tai tuote, sen valmistus- tai pakkaustapa oleellisesti muut- tuu siten, että tuotteen säilyvyys heikentyy. Säilyvyystutkimuksissa voidaan käyttää matemaat- tisia ennustemalleja. Esimerkiksi FSSP (Food Spoilage and Safety Predictor) ohjelmaa voidaan käyttää ennustamaan pilaajamikrobien ja taudinaiheuttajien kasvua elintarvikkeissa ja esimer- kiksi vaihtuvan lämpötilan vaikutuksesta varastoinnissa tuotteen säilyvyyteen. Ohjelma on il- maiseksi ladattavissa osoitteesta http://fssp.food.dtu.dk/ Ruokaviraston ohje 4095/04.02.00.01/2020/3. 5.8. Arvio mikrobiologisten menetelmien soveltuvuudesta kotimaiselle silakkasektorille Suomalainen elintarviketeollisuus on valveutunutta ja seuraa lainsäädännön vaatimuksia ja vi- ranomaisten suosituksia. Koonti mikrobiologisista analysointimenetelmistä on esitetty taulu- kossa 14. • Perinteiset viljelymenetelmät mahdollistavat elävien mikrobi-isolaattien eristyksen, ja niiden avulla saadaan kvantitatiivista tietoa mikrobimääristä. • Pikamenetelmät voivat olla hyödyllisiä yritysten omavalvonnassa esimerkiksi ympäristönäytteenotossa. Uudet tekniikat, kuten isoterminen monistus, mahdollistavat myös haittamikrobien, kuten L. monocytogenes -bakteerin, nopean havainnoinnin. • Tutkimuksessa tehokkaita työkaluja mikrobiomin määritykseen ovat sekvensointimenetelmät, kuten seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS). Näillä menetelmillä saadaan geenitason tietoa pilaajamikrobeista ja niiden ominaisuuksista. • Myös kuvantamisteknologiat, kuten hyperspektrikuvantaminen, ovat lupaavia menetelmiä silakan mikrobiologisen laadun arviointiin. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 66 Mikrobiologisia analysointimenetelmiä Menetelmä Soveltuvuus Hyödyt Haasteet Muuta Viljelymenetelmät Viralliset, hyväk- sytyt määritys- menetelmät Mikrobiologisen laadun, elintarvi- kepatogeenien määrittäminen Viranomaisval- vonta, laadunval- vonta ja tutkimus •Standardin mukainen tulos •Virallinen tulos •Tietyt tutkimukset voi tehdä it- sekin •Aikaa vievä ja mo- nivaiheinen •Vaatii perehtynei- syyttä •Reagenssit ja kas- vatusalustat kalliita Palvelu kannattaa ostaa Ruoka- viraston hyväksymistä laboratori- oista https://www.ruokavirasto.fi/labo- ratoriopalvelut/ruokaviraston- hyvaksymat-laboratoriot/elintarvi- kelaboratoriot/ Virallisia, standardoituja menetel- miä (SFS-EN ISO. ISO, NMKL) Valikoivat kasva- tusalustat Elintarvikepato- geenien ja pilaa- jamikrobien mää- rittäminen Laadunvalvonta ja tutkimus •Vähentää kasvatusjaksojen ja biokemiallisten testien määrää ja siten nopeuttaa tunnistusta •Kasvatusalustan värinmuu- tokset tai saostuskehät helpot- tavat mikrobien tunnistusta. •Kasvatusalustat kalliita Validoimattomia ja validoituja kasvatusalustoja löytyy useilta eri valmistajilta. AFNORin vali- doimat: https://nf-validation.af- nor.org/en/wp-con- tent/uploads/sites/2/2014/04/List- of-methods-certified-NF-VALIDA- TION-Food.pdf Immunomääritysmenetelmät ELISA (enzyme linked immuno- sorbent assay) Tunnistetaan mik- robin proteiinira- kenteeseen sitou- tunut spesifinen vasta-aine ent- syymin avulla. Tu- los mitataan väri- reaktiolla. Laadunvalvonta •Kvalitatiivinen tulos (positiivi- nen/negatiivinen) saadaan no- peasti verrattuna viljelymene- telmään •Vaatii kuitenkin näytteen rikastami- sen •Positiivinen tulos on varmistettava standardimenetel- mällä •Vaatii erityislait- teen Kaupallisesti saatavilla monenlai- sia testejä erilaisten elintarvike- patogeenien ja niiden toksiinien sekä ympäristönäytteiden määrit- tämiseen. Esimerkiksi TRAN- SIA® PLATE Listeria monocyto- genes -testi (http://www.biocont- rolsys.com/as- sets/uploads/14051955097-tran- sia-plate-listeria-monocytogenes- dfu-englishrev-02.pdf.) ELFA (enzyme linked fluores- cent assay) Tun- nistetaan mikro- bin proteiiniraken- teeseen sitoutu- nut spesifinen vasta-aine ent- syymin avulla. Tu- los mitataan fluo- resenssin avulla. Laadunvalvonta ja tutkimus •Kvalitatiivinen tulos (positiivi- nen/negatiivinen) saadaan no- peasti verrattuna viljelymene- telmään •Vaatii kuitenkin näytteen rikastami- sen •Positiivinen tulos on varmistettava standardimenetel- mällä •Vaatii erityislait- teen Kaupallisesti saatavilla monen kokoisia VIDAS®-laitteita ja niihin soveltuvia kittejä. Menetelmä on käytössä Ruokavi- raston hyväksymissä laboratori- oissa, esimerkiksi L. monocyto- genes -bakteerin määrittämi- seen Scanlabissa: https://www.ruokavirasto.fi/globa- lassets/laboratoriopalvelut/ruoka- viraston-hyvaksymat-laborato- riot/rekisteriotteet/scanlab- oy_oulu.pdf Lateraalivirtaus- testi (lateral flow assay, LFA) Tun- nistetaan mikro- bin proteiiniraken- teeseen sitoutu- nut spesifinen vasta-aine ent- syymin avulla. Tu- los näkyy värire- aktiolla. Laadunvalvonta •Kvalitatiivinen tulos (positiivi- nen/negatiivinen) saadaan no- peasti verrattuna viljelymene- telmään •Tulos silmin havaittavissa •Helppolukuinen •Vaatii kuitenkin näytteen rikastami- sen •Positiivinen tulos on varmistettava standardimenetel- mällä Kaupallisesti saatavilla monenlai- sia testejä eri patogeeneille Nukleiinihappoihin perustuvat menetelmät Polymeraasiket- jureaktio (PCR) Laadunvalvonta ja tutkimus •Viljelymenetelmiä nopeampi ja tarkempi •Vaatii erityislait- teen PCR-menetelmiin patogeenien havaitsemiseksi elintarvikkeista on olemassa ISO-standardeja Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 67 Mikrobien havait- seminen elintar- vikkeesta DNA- jakson perusteella Reaaliaikainen PCR (qPCR tai RT-PCR) Mikrobien havait- seminen ja niiden määrän laskemi- nen elintarvik- keesta DNA-jak- son perusteella Laadunvalvonta ja tutkimus •Viljelymenetelmiä nopeampi ja tarkempi •Vaatii erityislait- teen Erilaisia qPCR (RT-PCR) -kittejä on kaupallisesti saatavilla esim. L. monocytogenes –bakteerin määrittämiseen Silmukkavälittei- nen isoterminen DNA -monistus (LAMP) Mikrobien havait- seminen elintar- vikkeesta DNA- jakson perusteella Laadunvalvonta ja tutkimus •Nopea •Ei vaadi erityistä laitteistoa Listeria monocytogenes -baktee- rin määrittämiseen on olemassa AFNORin valimoimia kittejä: 3M Molecular Detection Assay 2- Listeria ja ANSR for Listeria spp. Seuraavan suku- polven sekven- sointi (NGS) Mikrobipopulaati- oiden tutkimus DNA-jaksojen pe- rusteella Laadunvalvonta ja tutkimus •Monimuotoisien mikrobiyhtei- söjen tutkiminen esim. fermen- tioprosessissa •Mikrobikontaminaation läh- teen jäljittäminen •Vaatii erityislaitteen •Ohjelmistojen käyttö ja tulosten tulkinta vaatii asiantuntijuutta Muut menetelmät MALDI-TOF MS Mikrobisolujen la- jitunnistus niiden proteiinirakentei- den avulla Laadunvalvonta ja tutkimus •Nopea •Tehokas •Helppokäyttöinen •Vaatii erityislait- teen Kallis laiteinvestointi Kaupalliset pika- testit ympäristö- näytteiden ot- toon Viljelypohjaisia menetelmiä mik- robien määrittämi- seen pinnoilta ja elintarvikkeista Laadunvalvonta •Nopea •Helppokäyttöinen Kaupallisesti saatavilla monenlai- sia testejä eri patogeeneille, ku- ten Hygicult-kontaktilevyt (Orion Diagnostics) ja Petrifilm (3M) Ennustava mik- robiologia Mikrobien kasvun ennustaminen matemaattisilla malleilla osana säilyvyystutki- musta Laadunvalvonta ja tutkimus •Elintarvikealan toimija tietää, mikä on turvallinen säilyvyys- aika tuottamilleen tuotteille, joille asetetaan viimeinen käyt- töajankohta tai parasta ennen - päiväys •Vaatii perehtynei- syyttä asiaan Saatavissa matemaattisia ennus- temalleja, esimerkiksi ilmainen FSSP (Food Spoilage and Safety Predictor) http://fssp.food.dtu.dk/ Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 68 6. Yhteenveto Edellisissä luvuissa olemme käsitelleet yksityiskohtaisesti tarjolla olevia, moderneja mittausmenetelmiä ja tekniikoita kalan laadun monipuoliseen mittaamiseen. Tähän yhteenvetoon olemme tiivistäneet suosituksemme aihepiireittäin suomalaisen kalateollisuuden ja -tutkimuksen käyttöön. Tärkeimmät johtopäätöksemme on koottu taulukkoon 15, jossa listataan kunkin menetelmän soveltuvuus, hyödyt ja haasteet. Aistinvaraiset menetelmät Kalojen aistinvaraisen laadun tutkimuksessa on käytössä monenlaisia menetelmiä. Suomessa- kin kalojen kuvailevia profilointeja on tehty viime vuosituhannelta saakka. Toistaiseksi silakalle on saatavilla hyvin rajallisesti aistinvaraista tutkimusaineistoa. Tähän suositukseen olemme va- linneet menetelmät, joissa on riittävä teoreettinen pohja ja riittävä tieteellinen dokumentaatio niiden toimivuudesta sekä hyvä sovellettavuus tämän innovaatio-ohjelman tarpeisiin. Aistinvaraisten arviointimenetelmien suhteen on tunnistettu kaksi erilaista käyttötarkoitusta: 1) silakan laadun seuranta kalaketjun eri vaiheissa troolista kuluttajalle, ja 2) yksityiskohtaisempi menetelmä tutkimuksen sekä kalan menekin edistämisen käyttöön. Kalaketjun käyttöön tarvi- taan helposti omaksuttava ja mielellään älylaitteessa toimiva yksinkertainen numeerinen mit- tari. Tällaiseksi voisi soveltua silakalle kehitetty QIM-menetelmään perustuva älypuhelinsovel- lus, joka mukailee ”How fresh is your fish”-sovellusta. Tähän tarvitaan yhteistyökumppaniksi ohjelmistoyritys. Tutkimuskäyttöön soveltuu yleinen kuvaileva menetelmä GDA, jolla olisi tarpeen tehdä profi- lointi yleisimmille suomalaisille kalalajeille. Työn pohjana voidaan käyttää aiempaa tutkimus- materiaalia suomalaisista kalalajeista. Näiden kahden menetelmän lisäksi tarvitaan menetelmiä, joissa voidaan lisätä yleisön kiinnos- tusta kotimaisiin kalalajeihin. CATA-menetelmällä tuotettu aineisto sopii nähdäksemme tähän tarkoitukseen. Kemialliset ja biokemialliset menetelmät Biokemiallisista menetelmistä pH:n mittaus, peroksidiluku, para-anisidiiniluku ja näistä laskettu TOTOX (eng. Total Oxidation Products) ovat tunnettuja ja laajasti käytettyjä menetel- miä. pH:n mittaus on nopeaa, joskin se pitäisi kalibroida silakalle. Peroksidi ja para-anisidiinilu- kujen mittauksiin löytyy virallisia menetelmiä, mutta ne vaativat näytteenkäsittelyä ja soveltuvat paremmin tutkimukseen, kuin nopeaan laadunvalvontaan. K-arvon mittaukseen perustuvat kaupalliset pikamenetelmät kuten ”Freshness checker” ja ”PRECICE® Freshness Assay Kit” so- veltuvat kalaketjun alkupäähän laadunvalvontaan ja tuoreuden arviointiin. Kyseiset menetelmät ovat helppokäyttöisiä ja nopeita, joskin laitteiden ja kittien saatavuudesta ei ole kirjoitushet- kellä varmuutta. Pakattujen kalatuotteiden laadun seurantaan sopivat puolestaan erilaiset värimuutokseen pe- rustuvat sensorit, jotka viestivät kalan laadusta sekä kuljetuksen että säilytyksen aikana. Ke- mosensitiivisiä sensoreita ei ole saatavilla valmiina, vaan ne vaatisivat kehitystyötä kullekin ka- lalajille ja tuotteelle, jotta värimuutoksen signaalin voimakkuus saadaan kalibroitua vastaamaan juuri kyseisen tuotteen laatua. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 69 Tutkimuksessa ja uusien menetelmien validoinnissa voidaan käyttää tunnettuja ja luotettavia laadunmittausmenetelmiä, kuten nestekromatografiaan pohjautuvaa K-arvon määritystä, edel- lämainittuja peroksidi- ja para-anisidiinilukumäärityksiä, tiobarbituurihapporeaktiivisten ainei- den määritystä sekä trikloorietikkahappoon liukenevien peptidien mittausta. Näitä laborato- riomenetelmiä voitaisiin siis käyttää uusien menetelmien kalibroinnissa, ja näihin menetelmiin käytettävät reagenssit ja laitteistot ovat yleisesti saatavilla elintarvikealan laboratorioissa. Fysikaalis-kemialliset menetelmät Fysikaalis-kemiallisten menetelmien etuja ovat, että ne eivät tuhoa näytettä, ne ovat nopeita, ne soveltuvat usein on-line -menetelmiksi ja niitä voidaan käyttää ketjun useassa eri vaiheissa. Menetelmiä on olemassa useita ja ne mittaavat eri asioita (ks. alla), joten tarkoituksenmukaisen menetelmän valitseminen ketjun eri vaiheisiin ja laitteiden kalibrointi mitattaville suureille vaatii perehtyneisyyttä. Kalan sähköisten ominaisuuksien muutoksiin perustuvat Torrymeter sekä Fischtester VI ovat edelleen käyttökelpoisia, kaupallisesti saatavia, koko ketjun seurantaan soveltuvia kalan tuo- reusmittareita, mutta ne ovat epäherkkiä ja alttiita erilaisille virhemittauksille. Sähkökemiallinen impedanssispektrosopia (EIS) antaa kalan koostumuksesta tarkempaa informaatiota. EIS- laite on myös kaupallisesti saatavissa (esimerkiksi https://certifiedqualityseafoods.com/). Konenäköä voidaan käyttää laaduntarkkailussa ja kemiallisten ominaisuuksien analysoinnissa koko arvoketjussa, myös kalankasvatuksessa. Konenäköteknologia tarjoaa joustavuutta ja hy- vää toistettavuutta suhteellisen alhaisilla kustannuksilla sekä sallii melko nopean tuotannon lä- pivirtauksen tarkkuutta vaarantamatta. Raman-spektroskopia on lupaava menetelmä, jolla voidaan määrittää kokonaisen, prosessoi- dun tai pakastetun kalan fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia sekä todeta kalan aitous ja alku- perä. Kaupalliset pikalaitteet eivät sellaisenaan sovellu suomalaisten kalalajien monitorointiin, joten uusi sovellusalue vaatii tutkimus- ja kehitystyötä. VIS/NIR-spektroskopiaa voidaan hyödyntää monipuolisesti kalan laaduntarkkailussa ja kemi- allisten ominaisuuksien analysoinnissa koko arvoketjussa. Menetelmään perustuvia kaupallisia laitteita on saatavilla sekä laboratoriokäyttöön että prosessinohjaukseen. Hyperspektrikuvantamisen sovellusmahdollisuudet kalan laadun analysoinnissa ovat moni- puoliset. Sitä voidaan käyttää esimerkiksi kalan tuoreuden, mikrobiologisen ja aistittavan laa- dun sekä kemiallisten koostumuksen määrittämisessä koko arvoketjussa. Uusi sovellusalue vaa- tii tutkimus- ja kehitystyötä. Elektronista nenää voidaan hyödyntää kalan tuoreuden tai pilaantumisen arvioinnissa ketjun eri vaiheissa. Sen avulla voidaan esimerkiksi havainnoida mikrobien tuottamia haihtuvia yhdis- teitä. Menetelmä soveltuu tuoreen kalan ja kalatuotteiden lisäksi myös kalajauholle. Sen avulla voidaan tunnistaa ja erottaa varastoidun kalajauhon erilaiset tuoreusasteet. Lisäksi sitä voidaan hyödyntää myös lajittelussa, esimerkiksi erottelemaan eri kalalajit toisistaan. Elektronista kieltä voidaan soveltaa kalan ja kalatuotteiden rutiininomaiseen tuoreuden ja tuoteturvallisuuden valvontaan toimitusketjun missä tahansa vaiheessa. Keinokielen avulla voi- daan esimerkiksi analysoida biogeenisten amiinien muodostumista ja kalan mikrobiologisen laadun muutoksia. Lisäksi sitä on käytetty arvioimaan raskasmetallien (Cd, Pb ja Hg) jäämiä kalasta. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 70 Terahertsispektroskopia ja -kuvantaminen vaikuttaa monipuolisuutensa vuoksi lupaavalta menetelmältä silakan laadun analysointiin. Menetelmän mahdollisuudet ulottuvat kemiallisten yhdisteiden ja mikro-organismien analysoinnista vierasesineiden havaitsemiseen. Menetelmän sovellusmahdollisuutta, sopivien yhdisteiden löytymistä tietokannoista ja kustannustehok- kuutta tulisi tutkia lisää. Kalan tuoreutta voidaan arvioida myös sen rakenteen (kovuuden/pehmeyden) avulla rakenne- mittareilla. Lisäksi proteiinikoostumusta voidaan tutkia kaksisuuntaisella elektroforeesilla. Nämä menetelmät ovat pikemminkin tutkimukseen soveltuvia menetelmiä eivätkä sovi kalan tuoreuden seuraamiseen arvoketjussa yhtä hyvin kuin muut yllä mainitut menetelmät. Mikrobiologiset menetelmät Suomalainen elintarviketeollisuus on valveutunutta ja seuraa lainsäädännön vaatimuksia ja vi- ranomaisten suosituksia. • Perinteiset viljelymenetelmät mahdollistavat elävien mikrobi-isolaattien eristyksen, ja niiden avulla saadaan kvantitatiivista tietoa mikrobimääristä. • Pikamenetelmät voivat olla hyödyllisiä yritysten omavalvonnassa esimerkiksi ympäristönäytteenotossa. Uudet tekniikat, kuten isoterminen monistus, mahdollistavat myös haittamikrobien, kuten L. monocytogenes -bakteerin, nopean havainnoinnin. • Tutkimuksessa tehokkaita työkaluja mikrobiomin määritykseen ovat sekvensointimenetelmät, kuten seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS). Näillä menetelmillä saadaan geenitason tietoa pilaajamikrobeista ja niiden ominaisuuksista. • Myös kuvantamisteknologiat, kuten hyperspektrikuvantaminen, ovat lupaavia menetelmiä silakan mikrobiologisen laadun arviointiin. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 71 Yhteenveto silakan kalan laadun analysointimenetelmistä. Menetelmä Soveltuvuus Hyödyt Haasteet Muuta Aistinvaraiset menetelmät Laatuindeksi (Quality Index Method, QIM) – Systemaattinen pisteytysmene- telmä kalan tuo- reuden arvioi- miseksi Laadunvalvonta- menetelmä tuo- reelle kalalle kala- ketjun eri vai- heissa troolista kuluttajalle •Selkeä, pisteytys kalan ominaisuuksille (iho, lima, silmät, vatsa, haju, kiduk- set) •Indeksistä voidaan arvi- oida jäljellä olevaa säily- tysaikaa •Nopea ja tarkka Instrumentaalisia menetel- miä herkempi säilytyksen alkuvaiheessa •Lajikohtainen •Vaatii kehitystä joka kala- lajille •Vaatii arvioijan koulutuk- sen •Ei vielä tehty silakalle Mitä vanhempi kala, sitä suu- rempi indeksiluku Menetelmään perustuen on ke- hitetty How Fresh is Your Fish -älypuhelinsovellus, joka on saatavilla 11 kielellä (ei suo- meksi) ja 13 eri kalalajille https://www.qim-eurofish.com/ Yleinen kuvai- leva menetelmä kalan aistinva- raisen laadun ar- vioimiseksi (Ge- neric descriptive analysis, GDA) Tutkimus, eri ka- lalajien aistinva- raisen profiilin ob- jektiivinen kuvaus (ei mieltymysku- vaus) •Erittelee näytteen aistitta- vat ominaisuudet •Mahdollistaa erilaisten näytteiden (esim. kalalajien) tarkan kuvailun ja erottami- sen toisistaan Tulokset yhdistettävissä esim. kemiallisiin mittauk- siin •Työläs •Vaatii koulutetun aistinva- raisen raadin, koulutuksen ja sanaston kehittämisen Näytemäärä rajallinen Menetelmällä kuvailtu ja ero- teltu esimerkiksi siikanäytteitä, turskanäytteitä, hammasah- vennäytteitä ja useita Suomelle merkittäviä kalalajeja, kuten si- lakka, ahven, kuha ja lahna Pikamenetelmä kalan kokonais- valtaisen kulut- tajalaadun arvi- oimiseksi (Choose All That Apply –CATA) Tutkimus, kulutta- jalaadun arviointi •Tunnistaa, mitkä ominai- suudet kuluttaja kokee tär- keiksi •Mahdollistaa suurehkon näytemäärän •Ei vaadi raatilaisten kou- luttamista •Vaatii suurehkon raadin Laadullinen analyysi, ei mitta-asteikkoa ominai- suuksien voimakkuuden mittaamiselle Sopii yleiskatsauksen saami- seen näytteistä sekä näyttei- den seulontavaiheessa Kemialliset ja biokemialliset menetelmät pH:n mittaus pH laskee kalan kuoleman jälkeen, kun ensin muo- dostuu maitohap- poa ja alkaa nousta, kun mik- robit muodostavat emäksisiä aineen- vaihduntatuotteita Laadunvalvonta •Nopea •Edullinen •Näytteenkäsittelyksi riit- tää kalanäytteen ho- mogenointi veden kanssa •pH:n yhteys laatuun täy- tyy mallintaa silakalle erik- seen •pH laskee kalan kuole- man jälkeen ja nousee taas uudestaan hajoami- sen edtessä: kertooko mit- taustulos, että kala on to- della tuore, vai jo monta päivää vanha? pH:n yhteys laatuun täytyy mallintaa silakalle erikseen pH laskee kalan kuoleman jäl- keen ja nousee taas uudes- taan hajoamisen edetessä: kertooko mittaustulos, että kala on todella tuore, vai jo monta päivää vanha? Peroksidiluvun määritys Mittaa primäärisiä hapettumisyhdis- teitä, pääasiassa peroksideja Tutkimus ja laa- dunvalvonta •Yleinen rasvojen hapettu- misesta kertova mene- telmä •Spektrofotometriä hyödyn- tävä menetelmä on nopea Anisidiiniluvun määritys Mittaa sekundää- risiä hapettumis- yhdisteitä, kuten aldehydejä ja ke- toneja Tutkimus ja laa- dunvalvonta •Spektrofotometriä hyö- dyntävä menetelmä on no- pea •Myrkyllinen reagenssi Sopii käytettäväksi peroksidilu- kumäärityksen rinnalla TOTOX Lasketaan perok- sidiluvun ja anisi- diiniluvun avulla Tutkimus ja laa- dunvalvonta •Kertoo kokonaishapettu- misasteen •Yleisesti käytössä teolli- suudessa, etenkin öljyjen •Työläs, sillä vaatii sekä peroksidiluvun että anisi- diiniluvun mittaamisen Laskukaava: TOTOX = AV + 2 x PV Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 72 hapettumisen mittaami- seen Fysikaalis-kemialliset menetelmät Konenäkö Sähkömagneetti- sen säteilyn ha- vaitseminen sekä digitaalisen ku- vainformaation automaattinen ha- vainnointi ja tul- kinta Laadunvalvonta ja tutkimus •Nopea •Ei vaadi näytteenkäsitte- lyä •Näytettä tuhoamaton •Tarjoaa joustavuutta ja hyvää toistettavuutta suh- teellisen alhaisilla kustan- nuksilla •Sallii melko nopean tuo- tannon läpivirtauksen tark- kuutta vaarantamatta. •Teknologian soveltami- nen suomalaisten kalala- jien monitorointiin vaatii tutkimus- ja kehitystyötä. Nettilinkkejä https://www.vi- siononline.org/vision-resour- ces.cfm VIS/NIR-spektro- skopialla analy- soidaan kemialli- sia ominaisuuksia sähkömagneetti- sen säteilyn avulla. Laadunvalvonta ja tutkimus •Kaupallisia laitteita saata- villa sekä laboratoriokäyt- töön että prosessinohjauk- seen •Prosessilaitteet näytettä tuhoamattomia •Prosessilaitteet eivät vaadi näytteenkäsittelyä •Tarkoitukseen sopivien laitteiden valinta On-line/In-line laitteet (antu- rit) teollisuuteen https://www.buchi.com/en/pro- ducts/nir-online/nir-online-pro- cess-analyzer, myös kalarehun valmistukseen https://sta- tic1.buchi.com/sites/default/fi- les/NIR-Online_Solu- tion_Brochure_en.pdf. https://www.grainsense.com/ Hyperspektriku- vaus Spektroskopian ja kuvantamistekno- logian yhdistelmä Laadunvalvonta ja tutkimus •Nopea •Ei vaadi näytteenkäsitte- lyä •Näytettä tuhoamaton •Monipuoliset sovellus- mahdollisuudet koko arvo- ketjussa •Saadaan samanaikaisesti tietoa kohteen fysikaali- sista ja geometrisistä piir- teistä (muoto, koko, ulko- näkö ja väri) sekä kemialli- sesta koostumuksesta spektrianalyysin perus- teella. •Teknologian soveltami- nen silakan tai muun suo- malaisen kalan laadunval- vontaan vaatii tutkimus- ja kehitystyötä. Nofima the Norwegian Institute of Food, Fisheries and Aquaculture Research kehittä- nyt sovelluksen turskan auto- maattiseen lajitteluun ennen ja- lostamoille toimittamista Elektroninen kieli Mittaa elintarvik- keiden makuomi- naisuuksia. Laadunvalvonta, laadunvarmistus, tuotekehitys ja tut- kimus, monipuoli- set sovellusmah- dollisuudet koko arvoketjussa. •Nopea •Ei vaadi yleensä näytteen esikäsittelyä •Näytettä tuhoamaton •Voidaan analysoida myr- kyllisiä näytteitä •Objektiivinen arviointi •Soveltaminen silakan tai muun suomalaisen kalan laadunvalvontaan vaatii tutkimus- ja kehitystyötä •Herkkä ympäristötekijöi- den, kuten lämpötilan, vai- kutuksille Saatavilla laboratoriotason lait- teita Mikrobiologiset menetelmät Viralliset, hyväk- sytyt määritys- menetelmät Mikrobiologisen laadun, elintarvi- kepatogeenien määrittäminen Viranomaisval- vonta, laadunval- vonta ja tutkimus •Standardin mukainen tu- los •Virallinen tulos •Tietyt tutkimukset voi tehdä itsekin •Aikaa vievä ja monivai- heinen •Vaatii perehtyneisyyttä •Reagenssit ja kasva- tusalustat kalliita Kannattaa ostaa palvelu Ruo- kaviraston elintarvikelain no- jalla hyväksymistä laboratori- oista https://www.ruokavirasto.fi/la- boratoriopalvelut/ruokaviras- ton-hyvaksymat-laborato- riot/elintarvikelaboratoriot/ Virallisia, standardoituja mene- telmiä (SFS-EN ISO. ISO, NMKL) Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 73 ELFA (enzyme linked fluores- cent assay) Tunnistetaan mik- robin proteiinira- kenteeseen sitou- tunut spesifinen vasta-aine ent- syymin avulla. Tu- los mitataan fluo- resenssin avulla. Laadunvalvonta ja tutkimus •Kvalitatiivinen tulos (posi- tiivinen/negatiivinen) saa- daan nopeasti verrattuna viljelymenetelmään •Vaatii kuitenkin näytteen rikastamisen •Positiivinen tulos on var- mistettava standardimene- telmällä •Vaatii erityislaitteen Kaupallisesti saatavilla monen kokoisia VIDAS®-laitteita ja nii- hin soveltuvia kittejä. Mene- telmä on käytössä Ruokaviras- ton hyväksymissä laboratori- oissa, esimerkiksi L. mono- cytogenes -bakteerin määrittä- miseen Scanlabissa: https://www.ruokavirasto.fi/glo- balassets/laboratoriopalve- lut/ruokaviraston-hyvaksymat- laboratoriot/rekisteriot- teet/scanlab-oy_oulu.pdf Polymeraasiket- jureaktioon pe- rustuvat mene- telmät (PCR qPCR LAMP) Mikrobien havait- seminen elintar- vikkeesta DNA- jakson perusteella Laadunvalvonta ja tutkimus •Viljelymenetelmiä nope- ampi ja tarkempi •Vaatii erityislaitteen PCR-menetelmiin patogeenien havaitsemiseksi elintarvik- keista on olemassa ISO-stan- dardeja Erilaisia qPCR (RT-PCR) -kit- tejä on kaupallisesti saatavilla esim. Listeria monocytogenes –bakteerin määrittämiseen LAMP-menetelmä: Listeria mo- nocytogenes -bakteerin määrit- tämiseen on olemassa AF- NORin valimoimia kittejä: 3M Molecular Detection Assay 2- Listeria ja ANSR for Listeria spp Seuraavan suku- polven sekven- sointi (NGS) Mikrobipopulaati- oiden tutkimus DNA-jaksojen pe- rusteella Laadunvalvonta ja tutkimus •Monimuotoisien mikro- biyhteisöjen tutkiminen esim. fermentioproses- sissa •Mikrobikontaminaation lähteen jäljittäminen •Vaatii tutkimusta ja lisä- kehitystä, jotta saadaan nopeampia, teollisuuden käyttöön sopivia ratkaisuja Vaatii erityislaitteen Ohjelmistojen käyttö ja tulosten tulkinta vaatii asiantuntijuutta Kaupalliset pika- testit ympäristö- näytteiden ot- toon Viljelypohjaisia menetelmiä mik- robien määrittämi- seen pinnoilta ja elintarvikkeista Laadunvalvonta •Nopea •Helppokäyttöinen Kaupallisesti saatavilla monen- laisia testejä eri patogeeneille, kuten Hygicult-kontaktilevyt (Orion Diagnostics) ja Petrifilm (3M) Ennustava mik- robiologia Mikrobien kasvun ennustaminen matemaattisilla malleilla osana säilyvyystutki- musta Laadunvalvonta ja tutkimus •Elintarvikealan toimija tie- tää, mikä on turvallinen säilyvyysaika tuottamilleen tuotteille, joille asetetaan viimeinen käyttöajankohta tai parasta ennen -päiväys •Vaatii tutkimusta ja lisä- kehitystä, jotta saadaan rakennettua tarkempia mallinnusohjelmia Saatavissa matemaattisia en- nustemalleja, esimerkiksi ilmai- nen FSSP (Food Spoilage and Safety Predic- tor) http://fssp.food.dtu.dk/ Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 74 Lähteet AFNOR 2020a. NF validation mark - 3MTM Molecular Detection Assay 2 - Listeria. La Plaine Saint-Denis, France [verkkoaineisto]. [viitattu 8.6.2020]. Saatavissa: https://nf-valida- tion.afnor.org//en/wp-content/uploads/sites/2/2016/05/3M-01-14-05-16_en.pdf. AFNOR 2020b. NF validation mark - ANSR for Listeria spp [verkkoaineisto]. [viitattu 8.6.2020]. Saatavissa: https://nf-validation.afnor.org//en/wp-content/uploads/si- tes/2/2016/02/NEO-35-03-01-16_en.pdf. AFNOR 2020c. Listeria monocytogenes [verkkoaineisto]. [viitattu 8.6.2020]. Saatavissa: https://nf-validation.afnor.org/en/food-industry/listeria-monocytogenes/. Afsah-Hejri, L., Hajeb, P., Ara, P. & Ehsani, R. J. 2019. A Comprehensive review on food applica- tions of terahertz spectroscopy and imaging. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 18: 1563–1621. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12490. Alander, J. T., Bochko, V., Martinkauppi, B., Saranwong, S. & Mantere, T. 2013. A review of optical nondestructive visual and near-infrared methods for food quality and safety. Interna- tional Journal of Spectroscopy 3. Saatavissa: https://doi.org/10.1155/2013/341402. Alasalvar, C., Shahidi, F., Miyashita, K. & Wanasundara, U. (Eds.) 2011. Handbook of seafood quality, safety and health applications. Wiley-Blackwell, Oxford, UK. Albers, M., Helle, H., Varpula, T., Itävaara, M., Kapanen, A. & Vikman, M. 2003. Kompostointi- prosessin monitorointi ja ohjaus. Kirjallisuusselvitys. Espoo, VTT Tiedotteita 2207, 81 s. Saatavissa: http://www.vtt.fi/inf/pdf/tiedotteet/2003/T2207.pdf. Andersen, U. B., Thomassen, M. S. & Rørå A. M. B. 1999. Texture properties of farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): effects of diet, muscle fat content and time of storage on ice. Journal of the Science of Food and Agriculture 74: 347–353. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0010(199707)74:3<347::AID-JSFA802>3.0.CO;2-F. Ashton, T. A., Michie, I. & Johnston, I. A. 2010. A novel tensile test method to assess texture and gaping in salmon fillets. Journal of Food Science 75: 182–190. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2010.01586.x. Balaban, M. O., Chombeau, M., Cırban, D. & Gümüş, B. 2010. Prediction of the weight of Alaskan pollock using image analysis. Journal of Food Science 75 (8): E552–E556. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2010.01813.x. Balaban, M. O. S., Şengör, G. F. Ü., Soriano, M. G. & Ruiz, E. G. 2011a. Quantification of gaping, bruising, and blood spots in salmon fillets using image analysis. Journal of Food Science 76: E328–E331. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011.02060.x. Balaban, M. O., Chombeau, M., Gümüş, B. & Cırban, D. 2011b. Determination of volume of Alaska pollock (Theragra chalcogramma) by image analysis. Journal of Aquatic Food Product Technology 20: 45–52. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10498850.2010.531996. Bernardo, Y. A. A., Rosario, D. K. A., Delgado, I. F. & Conte-Junior, C. A. 2020. Fish quality index method: principles, weaknesses, validation, and alternatives—A review. Comprehensive Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 75 Reviews in Food Science and Food Safety 19(5): 2657–2676. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12600 Biliaderis, C. G. 1983. Differential scanning calorimetry in food research—A review. Food Che- mistry 10(4): 239–265. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/0308-8146(83)90081-X. Biomat 2020. ELISA Assay Technology [verkkoaineisto]. [viitattu 24.9.2020]. Saatavissa: https://www.biomat.it/applications-techniques/elisa-assay/. Bland, J. M., Bett-Garber, K. L., Li, C. H., Brashear, S. S., Lea, J. M. & Bechtel, P. J. 2018. Comparison of sensory and instrumental methods for the analysis of texture of cooked individually quick frozen and fresh-frozen catfish fillets. Food Science & Nutrition 6(6): 1692–1705. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/fsn3.737. Borderías, A. J., Gómez-Guillón, M. C., Hurtado, O. & Montero, P. 1999. Use of image analysis to determine fat and connective tissue in salmon muscle. European Food Research and Technology 209: 104–107. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s002170050466. Botta, J. R., Bonnell, G. & Squires, B. E. 1987. Effect of method of catching and time of season on sensory quality of fresh raw Atlantic cod (Gadus morhua). Journal of Food Science 52(4): 928–931. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1987.tb14245.x. Boziaris, I. S. & Parlapani, F. F. 2016. Specific spoilage organisms (SSOs) in fish. The Microbio- logical Quality of Food 61–98. Woodhead Publishing Series in Food Science, Technology and Nutrition. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100502-6.00006-6. Bruker Daltonics Inc. 2019. Innovation with integrity MALDI biotyper CA system [verkkoa- ineisto]. [viitattu: 2.6.2020]. Saatavissa: https://www.bruker.com/filead- min/user_upload/8-PDF-Docs/Separations_MassSpectrometry/Literature/Brochu- res/1862840_MBT_Food_brochure_01-2019_ebook.pdf. BÜCHI Labortechnik AG. 2020. NIR-Online process analyser [verkkoaineisto]. [viitattu 17.6.2020] Saatavissa: https://www.buchi.com/en/products/nir-online/nir-online-pro- cess-analyzer ja https://static1.buchi.com/sites/default/files/NIR-Online_Solu- tion_Brochure_en.pdf. Candrian, U. 1995. Polymerase chain reaction in food microbiology. Journal of Microbiological Methods 23(1): 89–103. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/0167-7012(95)00019-H. Cen, H. & He, Y. 2007. Theory and application of near infrared reflectance spectroscopy in de- termination of food quality. Trends in Food Science & Technology 18: 72–83. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2006.09.003. Chaillou, S., Chaulot-Talmon, A., Caekebeke, H., Cardinal, M., Christieans, S., Denis, C., Desmonts, M. H., Dousset, X., Feurer, C., Hamon, E., Joffraud, J.-J., La Carbona, S., Leroi, F., Leroy, S., Lorre, S., Macé, S., Pilet, M.-F., Prévost, H., Rivollier, M. & Champomier- Vergès, M.-C. 2015. Origin and ecological selection of core and food-specific bacterial communities associated with meat and seafood spoilage. The ISME Journal 9(5): 1105– 1118. Saatavissa: https://doi.org/10.1038/ismej.2014.202. Chajęcka‐Wierzchowska, W., Zadernowska, A., Kłębukowska, L. & Łaniewska‐Trokenheim, Ł. 2012. Salmonella detection in poultry meat—Validation of VIDAS Xpress automatic en- zymelinked fluorescent immunoassay-based method. Journal of Food Safety 32(4): 407– 414. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1745-4565.2012.00394.x. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 76 Chandra, M. V. & Shamasundra, B. A. 2015. Texture profile analysis and functional properties of gelatin from the skin of three species of fresh water fish. International Journal of Food Properties 18: 572–584. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10942912.2013.845787. Chang, L.-Y., Chuang, M.-Y., Zan, H.-W., Meng, H.-F., Lu, C.-J., Yeh, P.-H. & Chen, J.-N. 2017. One-minute fish freshness evaluation by testing the volatile amine gas with an ultrasen- sitive porous-electrode-capped organic gas sensor system. ACS Sensors 2(4): 531–539. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/acssensors.6b00829 Cheng, J.-H., Sun, D.-W., Han. Z. & Zeng, X.-A. 2014. Texture and structure measurements and analyses for evaluation of fish and fillet freshness quality: a review. Comprehensive Re- views in Food Science and Food Safety 13(1): 52–61. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12043. Cheng, J.-H. & Sun, D.-W. 2015. Data fusion and hyperspectral imaging in tandem with least squares-support vector machine for prediction of sensory quality index scores of fish fillet. LWT - Food Science and Technology 63: 892–898. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2015.04.039. Cheng, J.-H., Sun, D.-W. & Wei, Q. 2017. Enhancing visible and near-infrared hyperspectral im- aging prediction of TVB-N level for fish fillet freshness evaluation by filtering optimal variables. Food Analytical Methods 10: 1888–1898. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s12161-016-0742-9. Cheyne, A. 1975. How the GR Torrymeter aids quality control in the fishing industry. Fisheries News International 12: 71–76. Clark, A. E., Kaleta, E. J., Arora, A., & Wolk, D. M. 2013. Matrix-assisted laser desorption ioniza- tion–time of flight mass spectrometry: a fundamental shift in the routine practice of clinical microbiology. Clinical Microbiology Reviews 26(3): 547–603. Saatavissa: https://doi.org/10.1128/CMR.00072-12. Cortés, V., Blasco, J., Aleixos, N., Cubero, S. & Talens, P. 2019. Monitoring strategies for quality control of agricultural products using visible and near-infrared spectroscopy: A Review. Trends in Food Science & Technology 85: 138–148. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2019.01.015. Costa, C., D’Andrea, S., Russo, R., Antonucci, F., Pallottino, F. & Menesatti, P. 2010. Application of non-invasive techniques to differentiate sea bass (Dicentrarchus labrax, L. 1758) qual- ity cultured under different conditions. Aquaculture International 19: 765–778. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1007/s10499-010-9393-9. Coultate, T. 2016. Food: the chemistry of its components: 6th Edition. Royal Society of Chem- istry. Council Regulation (EC) No 2406/96: Laying down common marketing standards for certain fishery products, Pub. L. No. 31996R2406, 334 OJ L (1996). Saatavissa: http://data.eu- ropa.eu/eli/reg/1996/2406/oj/eng. Dai, Q., Cheng, J.-H., Sun, D.-W. & Zeng, X.-A. 2015. Advances in feature selection methods for hyperspectral image processing in food industry applications: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 55: 1368–1382. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10408398.2013.871692. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 77 Dalgaard, P. 1995. Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish. International Journal of Food Microbiology 26(3): 319–333. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/0168-1605(94)00137-U. Dissing, B. S., Nielsen, M. E., Ersbøll, B. K. & Frosch, S. 2011. Multispectral imaging for determi- nation of astaxanthin concentration in salmonids. PLoS ONE 6(5): 1–8. Saatavissa: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019032. Dwivedi, H. P. & Jaykus, L. 2011. Detection of pathogens in foods: The current state-of-the-art and future directions. Critical Reviews in Microbiology 37(1): 40–63. Saatavissa: https://doi.org/10.3109/1040841X.2010.506430. Elintarviketeollisuusliitto ETL 2017. Elintarvikkeiden mikrobiologisia ohjausarvoja viimeisenä käyttöpäivänä [verkkoaineisto]. [viitattu: 20.5.2020]. Saatavissa: https://www.etl.fi/me- dia/aineistot/suositukset-ja-ohjeet/elintarvikkeiden-mikrobiologisia-ohjausarvoja-vii- meisena-kayttopaivana-2017-suositus.pdf. Elmasry, G., Kamruzzaman, M., Sun, D.-W. & Allen, P. 2012. Principles and applications of hy- perspectral imaging in quality evaluation of agro-food products: a review. Critical Re- views in Food Science and Nutrition 52: 999–1023. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10408398.2010.543495. Elmasry, G. & Wold, P. 2008. High-speed assessment of fat and water content distribution in fish fillets using online imaging spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemis- try 56: 7672–7677. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf801074s. Erikson, U., Misimi, E. & Gallart-Jornet, L. 2011. Super chilling of rested Atlantic salmon: Differ- ent chilling strategies and effects on fish and fillet quality. Food Chemistry 127: 1427– 1437. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.01.036. Erikson, U., Standal, I.B., Aursand, I.G., Veliyulin E. & Aursand M. 2012. Use of NMR in fish pro‐ cessing optimization: a review of recent progress. Magnetic Resonanse in Chemistry, 50: 471–480. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/mrc.3825 Espiñeira, M., Atanassova, M., Vieites, J. M. & Santaclara, F. J. 2010. Validation of a method for the detection of five species, serogroups, biotypes and virulence factors of Vibrio by multiplex PCR in fish and seafood. Food Microbiology 27(1): 122–131. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fm.2009.09.004. European Food Safety Authority (EFSA) 2010. Scientific opinion on fish oil for human consump- tion. Food hygiene, including rancidity. EFSA panel on biological hazards (BIOHAZ). EFSA Journal 8(10): 1874. Saatavissa: https://efsa.onlinelibrary.wi- ley.com/doi/pdf/10.2903/j.efsa.2010.1874. Eviran ohje 16023/5 2017. Kalastustuotteiden valvonta [verkkoaineisto]. Saatavissa: https://www.ruokavirasto.fi/globalassets/yritykset/elintarvikeala/valmistus/elintarvike- ryhmat/kalat-ja-kalastustuotteet/eviran_ohje_16023_5_fi.pdf. Farkas, J. & Mohácsi-Farkas, C. 1996. Application of differential scanning calorimetry in food research and food quality assurance. Journal of Thermal Analysis 47: 1787–1803. https://doi.org/10.1007/BF01980925. Fogarty, C., Smyth, C., Whyte, P., Brunton, N. & Bolton, D. 2019a. Sensory and ATP derivative- based indicators for assessing the freshness of Atlantic salmon (Salmo salar) and cod Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 78 (Gadus morhua). Irish Journal of Agricultural and Food Research 5: 71–80. Saatavissa: https://doi.org/10.2478/ijafr-2019-0008. Fogarty, C., Whyte, P., Brunton, N., Lyng, J., Smyth, C., Fagan, J. & Bolton, D. 2019b. Spoilage indicator bacteria in farmed Atlantic salmon (Salmo salar) stored on ice for 10 days. Food Microbiology 77: 38–42. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fm.2018.08.001. Folkestad, A., Wold, J. P., Rørvik, K.-A., Tschudi, J., Haugholt, K. H., Kolstad, K. & Mørkøre, T. 2008. Rapid and non-invasive measurements of fat and pigment concentrations in live and slaughtered Atlantic salmon (Salmo salar L.). Aquaculture 280: 129–135. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2008.04.037. FOODnavigator 2018. [verkkoaineisto]. [viitattu 17.6.2020]. Saatavissa: https://www.foodnavi- gator.com/Article/2018/10/08/TellSpec-s-AI-sensor-detects-fish-fraud-in-real-time- This-technology-is-disruptive-says-CEO?utm_source=copyright&utm_medium=On- Site&utm_campaign=copyright. Gill, P., Moghadam, T. T. & Ranjbar, B. 2010. Differential scanning calorimetry techniques: ap- plications in biology and nanoscience. Journal of Biomolecular Techniques 21: 167–193. Gowen, A. A., O’Sullivan, C. & O’Donnell, C. P. 2012. Review: terahertz time domain spectros- copy and imaging: emerging techniques for food process monitoring and quality con- trol. Trends in Food Science & Technology 25(1): 40–46. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.tifs.2011.12.006. GrainSense 2020. [verkkoaineisto]. [viitattu. 17.6.2020]. Saatavissa: https://www.grain- sense.com/. Gram, L. & Dalgaard, P. 2002. Fish spoilage bacteria - Problems and solutions. Current Opinion in Biotechnology 13: 262–266. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/S0958- 1669(02)00309-9. Gram, L. & Huss, H. H. 1996. Microbiological spoilage of fish and fish products. International Journal of Food Microbiology 33(1): 121–37. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/0168- 1605(96)01134-8. Gram, L., Trolle, G. & Huss, H. H. 1987. Detection of specific spoilage bacteria from fish stored at low (0°C) and high (20°C) temperatures. International journal of food microbiology, 4(1): 65–72. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/0168-1605(87)90060-2. Gram, L., Wedell-Neergaard, C. & Huss, H. H. 1990. The bacteriology of fresh and spoiling Lake Victorian Nile perch (Lates niloticus). International Journal of Food Microbiology 10(3– 4): 303–316. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/0168-1605(90)90077-I. Gümüş, B. & Balaban, M. Ö. 2010. Prediction of the weight of aqua cultured rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by image analysis. Journal of Aquatic Food Production Technol- ogy 19: 227–237. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10498850.2010.508869. Güney, S. & Atasoy, A. 2015. Study of fish species discrimination via electronic nose. Computers and Electronics in Agriculture 119: 83–91. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.com- pag.2015.10.005. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 79 Hagens, S. & Loessner, M. J. 2007. Application of bacteriophages for detection and control of foodborne pathogens. Applied Microbiology and Biotechnology 76: 513–519. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1007/s00253-007-1031-8. Hammers, M. M., Cavinato, A. G., Mayes, D., Lin, M. & Rasco, B. A. 2007. Non-destructive de- tection of deep muscle bruising in salmon by near infrared spectroscopy. Eastern Ore- gon Science Journal 3: 25–29. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10408398.2012.746638. Han, F., Huang, X., Teye, E. & Gu, H. 2015. Quantitative analysis of fish microbiological quality using electronic tongue coupled with nonlinear pattern recognition algorithms. Journal of Food Safety 35(3): 336–344. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/jfs.12180. Han, F., Huang, X. & Teye, E. 2019. Novel prediction of heavy metal residues in fish using a lowcost optical electronic tongue system based on colorimetric sensors array. Journal of Food Process Engineering 42(2): 12983. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/jfpe.12983. Hassoun, A. & Karoui, R. 2017. Quality evaluation of fish and other seafood by traditional and nondestructive instrumental methods: Advantages and limitations. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 57(9): 1976–1998. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/10408398.2015.1047926. Hattula, T., Luoma, T., Kostiainen, R., Poutanen, J., Kallio, M. & Suuronen, P. 1995. Effects of catching method on different quality parameters of Baltic herring (Clupea harengus L.). Fisheries Research 23: 209–221. Saatavilla: https://doi.org/10.1016/0165- 7836(94)00358-4. Hatzakis, E. 2019. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in food science: a compre- hensive review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 18: 189–220. Saatavilla: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12408. He, H.-J., Wu, D. & Sun, D.-W. 2015. Nondestructive spectroscopic and imaging techniques for quality evaluation and assessment of fish and fish products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 55(6): 864–886. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10408398.2012.746638. Herrero, A. M., Carmona, P. & Careche, M. 2004. Raman spectroscopic study of structural changes in hake (Merluccius merluccius L.) muscle proteins during frozen storage. Jour- nal of Agricultural and Food Chemistry 52(8): 2147–2153. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf034301e. Hughes, R. B. & Jones, N. R. 1966. Measurement of hypoxanthine concentration in canned her- ring as an index of the freshness of the raw material, with a comment on flavour rela- tions. Journal of the Science of Food and Agriculture 17(9): 434–436. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/jsfa.2740170911. Huss, H. H. 1995. Quality and quality changes in fresh fish - 5. Postmortem changes in fish (No. 348), FAO fisheries and aquaculture technical paper. Food and agriculture organization of the United Nations, Rome. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 80 Isaksson, T., Swensen, L. P., Taylor, R. G., Fjaera, S. O. & Skjervold, P. O. 2002. Non–destructive texture analysis of farmed Atlantic salmon using visual/near-infared reflectance spec- troscopy. Journal of the Science of Food and Agriculture 82(1): 53–60. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/jsfa.997. ISO 2013. Microbiology of the food chain. Horizontal method for the enumeration of microor- ganisms. Part 2: Colony count at 30 degrees C by the surface plating technique (ISO 4833-2:2013). International Organization for Standardization. ISO 2019. Microbiology of the food chain. Horizontal method for the enumeration of psy- chrotrophic microorganisms (ISO 17340:2019). International Organization for Standard- ization. Jagadeesan, B., Gerner-Smidt, P., Allard, M. W., Leuillet, S., Winkler, A., Xiao, Y., Chaffron, S., Van Der Vossen, J., Tang, S., Katase, M., McClure, P., Kimura, B., Ching Chai, L., Chapman, J. & Grant, K. 2019. The use of next generation sequencing for improving food safety: Translation into practice. Food Microbiology 79: 96–115. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fm.2018.11.005. Jain, D., Pathare, P. B. & Manikantan, M. R. 2007. Evaluation of texture parameters of Rohu fish (Labeo rohita) during iced storage. Journal of Food Engineering 81: 336–340. Saatavissa: https://doi.or10.1016/j.jfoodeng.2006.11.006. Janhunen, M., Niukko J., Vehviläinen, H., Kankainen, M., Hakulinen, J. & Pesonen, O. 2019. Esi- selvitys 3D- kameratekniikan ja koneoppimisen hyödyntämisestä suomalaisessa kalan- kasvatuksessa. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus, 19. Luonnonvarakeskus, Helsinki, 24 s. Saatavissa: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-326-733-6. Jasson, V., Jacxsens, L., Luning, P., Rajkovic, A. & Uyttendaele, M. 2010. Alternative microbial methods: An overview and selection criteria. Food Microbiology 27(6): 710–730. Saata- vissa: https://doi.org/10.1016/j.fm.2010.04.008. Jiang, H., Zhang, M., Bhandari, B. & Adhikari, B. 2018. Application of electronic tongue for fresh foods quality evaluation: A review. Food Reviews International, 34(8): 746–769. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1080/87559129.2018.1424184. Jonsson, A., Sigurgisladottir, S., Hafteinsson, H. & Kritbergsson, K. 2001. Textural properties of raw Atlantic salmon (Salmo salar) fillets measured by different methods in comparison to expressible moisture. Aquaculture Nutrition 7(2): 81–89. Saatavissa: https://doi.org/10.1046/j.1365-2095.2001.00152.x. Järvelä, A. 2011. Kotimaisen tuorekalan tuoreuden arviointi laatuindeksimenetelmällä QIM® (Pro gradu -tutkielma, Helsingin yliopisto). Saatavissa: https://helda.helsinki.fi/han- dle/10138/28485?show=full. Karakaya, D., Ulucan, O. & Turkan, M. 2020. Electronic nose and its applications: a survey. In- ternational Journal of Automation and Computing, 17(2): 179–209. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s11633-019-1212-9. Keto, K. 2020. RPAS-laitteiden käyttömahdollisuudet vesistörakenteiden tarkkailussa ja muissa vesivaratehtävissä (Diplomityö, Oulun yliopisto). Saatavissa: http://urn.fi/URN:NBN:fi:oulu-202003191297. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 81 Kielwein, G. 1971. Die Isolierung und Differenzierung von Pseudomonaden aus Lebensmitteln. Arch f Lebensmittelhyg 22: 29–37. Kielwein, G., Gerlach, R.U. & Johne, H. 1969. Untersuchungen über das Vorkommen von Aer- omonas hydrophila in Rohmilch. Arch f Lebensmittelhyg 20: 34–38. Kjærsgård, I. V. H. & Jessen, F. 2003. Proteome analysis elucidating post-mortem changes in cod (Gadus morhua) muscle proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(14): 3985–3991. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf0340097. Kjærsgård, I. V. H., Nørrelykke, M. R., Baron, C. P. & Jessen, F. (006. Identification of carbonylated protein in frozen rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fillets and development of pro- tein oxidation during frozen storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54(25): 9437–9446. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf061885m. Khoshnoudi-Nia, S., Moosavi-Nasab, M., Nassiri, S. M. & Azimifar, Z. 2018. Determination of total viable count in rainbow-trout fish fillets based on hyperspectral imaging system and different variable selection and extraction of reference data methods. Food Analyt- ical Methods 11(5): 3481–3494. Saatavissa: http://doi.org/10.1007/s12161-018-1320-0. Khoshnoudi-Nia, S. & Moosavi-Nasab, M. 2019. Prediction of various freshness indicators in fish fillets by one multispectral imaging system. Scientific Reports 9: 14704. Saatavissa: https://doi.org/10.1038/s41598-019-51264-z. Kyrana, V. R. & Lougovois, V. P. 2002. Sensory, chemical and microbiological assessment of farm-raised European sea bass (Dicentrarchus labrax) stored in melting ice. International Journal of Food Science & Technology 37(3): 319–328. Saatavissa: https://doi.org/10.1046/j.1365-2621.2002.00572.x Lalabadi, H. M., Sadeghi, M. & Mireei, S. A. 2020. Fish freshness categorization from eyes and gills color features using multi-class artificial neural network and support vector ma- chines. Aquacultural Engineering 90: 102076. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.aq- uaeng.2020.102076. Lazo, O., Claret, A. & Guerrero, L. 2016. A comparison of two methods for generating descrip- tive attributes with trained assessors: check-all-that-apply (CATA) vs. free choice Profil- ing (FCP): CATA vs. FCP. Journal of Sensory Studies 31(2): 163–176. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/joss.12202. Le Nguyen, D. D., Ngoc, H. H., Dijoux, D., Loiseau, G. & Montet, D. 2008. Determination of fish origin by using 16S rDNA fingerprinting of bacterial communities by PCR-DGGE: An application on Pangasius fish from Viet Nam. Food Control 19(5): 454–460. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2007.05.006. Li, P., Geng, J., Li, H. & Niu, Z. 2020. Fish meal freshness detection by GBDT based on a portable electronic nose system and HS‑SPME–GC–MS. European Food Research and Technol- ogy 246: 1129–1140. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s00217-020-03462-7. Lougovois, V. P., Kyranas, E. R. & Kyrana V. R. 2003. Comparison of selected methods of as- sessing freshness quality and remaining storage life of iced gilthead sea bream (Sparus aurata). Food Research International 36(6): 551–560. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/S0963-9969(02)00220-X. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 82 Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry 193(1): 265–275. Luoma, T. & Latva-Kala, K. 1998. Suomelle merkittävien kalalajien aistinvaraisen profiilin mää- rittäminen (Loppuraportti No. 258/98). VTT. Maatilan Pellervo 2018. GrainSense on kädessä pidettävä viljalaboratorio. Saatavissa: https://maatilanpellervo.fi/2018/10/03/grainsense-on-kadessa-pidettava-viljalaborato- rio/. Mabuchi, R., Ishimaru, A., Tanaka, M., Kawaguchi, O. & Tanimoto, S. 2019. Metabolic profiling of fish meat by GC-MS analysis, and correlations with taste attributes obtained using an electronic tongue. Metabolites 9(1): 1. Saatavissa: https://doi.org/10.3390/me- tabo9010001. Macagnano, A., Careche, M., Herrero, A., Paolesse, R., Martinelli, E., Pennazza, G., Carmona, P., D’Amico, A. & Natale, C. D. 2005. A model to predict fish quality from instrumental fea- tures. Sensors and Actuators B: Chemical 111–112: 293–298. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.snb.2005.06.028. Madeira, K. & Penfield, M. P. 1985. Turbot fillet sections cooked by microwave and conventional heating methods: objective and sensory evaluation. Journal of Food Science 50: 172– 177. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/J.1365-2621.1985.TB13303.X. Mafra, I., Ferreira, I. M. P. L. V. O. & Oliveira, M. B. P. P. 2008. Food authentication by PCR-based methods. European Food Research and Technology 227: 649–665. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s00217-007-0782-x. Martinez, I., Bathen, T., Standal, I. B., Halvorsen, J., Aursand, M., Gribbestad, I. S. & Axelson, D. E. 2005. Bioactive compounds in cod (Gadus morhua) products and suitability of 1H NMR metabolite profiling for classification of the products using multivariate data anal- yses. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(17): 6889–6895. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf0507902. Martinez, I. & Jakobsen Friis, T. 2004. Application of proteome analysis to seafood authentica- tion. Proteomics 4(2): 347–354. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/pmic.200300569. Martinez, I., Šližyté, R. & Daukšas, E. 2007. High resolution two-dimensional electrophoresis as a tool to differentiate wild from farmed cod (Gadus morhua) and to assess the protein composition of klipfish. Food Chemistry 102(2): 504–510. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.03.037. Martinsdóttir, E., Sveinsdóttir, K., Luten, J., Schelvis-Smit, R. & Hyldig, G. 2001. Reference manual for the fish sector : Sensory evaluation of fish freshness. QIM Eurofish. National Institute of Aquatic Resources. Saatavilla: https://orbit.dtu.dk/en/publications/reference-man- ual-for-the-fish-sector-sensory-evaluation-of-fish-f. Martinsdóttir, E., Schelvis, R., Hyldig, G. & Sveinsdóttir, K. 2009. Sensory evaluation of seafood: methods. In H. Rehbein & J. Oehlenschlger, Fishery Products: Quality, Safety and Au- thenticity 425–443. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/9781444322668.ch20. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 83 Marty-Mahé, P., Loisel, P., Fauconneau, B., Haffray, P., Brossard, D. & Davenel, A. 2004. Quality traits of brown trouts (Salmo trutta) cutlets described by automated color image anal- ysis. Aquaculture 232(1–4): 225–240. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/S0044- 8486(03)00458-7. Mateo, A., Soto, F., Villarejo, J. A., Roca-Dorda, J., Gandara, F. D. & García, A. 2006. Quality analysis of tuna meat using an automated color inspection system. Aquacultural Engi- neering 35(1): 1–13. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.aquaeng.2005.06.007. Mathiassen, J. R., Misimi, E., Toldnes, B., Bondø, M. & Østvik, S. O. 2011. High-speed weight estimation of whole herring (Clupea harengus) using 3D machine vision. Journal of Food Science 76(6): E458–E464. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750- 3841.2011.02226.x. Mesquita, C. S., Oliveira, R., Bento, F., Geraldo, D., Rodrigues, J. V. & Marcos, J. C. 2014. Simpli- fied 2,4-dinitrophenylhydrazine spectrophotometric assay for quantification of carbon- yls in oxidized proteins. Analytical Biochemistry 458: 69–71. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.ab.2014.04.034. Misimi, E., Erikon, U., Diger, H., Skavhaug, A. & Mathiassen, J. R. 2008. Computer vision-based evaluation of preand postrigor changes in size and shape of Atlantic cod (Gadus morhua) and Atlantic salmon (Salmo salar) fillets during rigor mortis and ice storage: Effects of perimortem handling stress. Journal of Food Science 73(2): E57–E68. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2007.00626.x. Morsy, M. K., Zór, K., Kostesha, N., Alstrøm, T. S., Heiskanen, A., El-Tanahi, H., Sharoba, A., Pap- kovsky, D., Larsen, J., Khalaf, H., Jakobsen, M. H. & Emnéus, J. 2016. Development and validation of a colorimetric sensor array for fish spoilage monitoring. Food Control 60: 346–352. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.07.038. Nagamine, K., Hase, T. & Notomi, T. 2002. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes 16(3): 223–229. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0415. Nambudiri, D. D. & Gopakumar, K. 1992. ATPase and lactate dehydrogenase activities in frozen stored fish muscle as Indices of cold storage deterioration. Journal of Food Science 57: 72–76. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.1992.tb05428.x. Nielsen, D. & Hyldig, G. 2004. Influence of handling procedures and biological factors on the QIM evaluation of whole herring (Clupea harengus L.). Food Research International 37(10): 975–983. Saatavissa: https://orbit.dtu.dk/en/publications/influence-of-han- dling-procedures-and-biological-factors-on-the-qi. Nilsen, H., Esaiassen, M., Heia K. & Sigernes, F. 2002. Visible/near-infrared spectroscopy: A new tool for the evaluation of fish freshness? Food Science 67(5): 1821–1826. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2002.tb08729.x. Niu, J. & Lee, J. Y. 2010. New approach for the determination of fish freshness by electrochem- ical impedance spectroscopy. Journal of Food Science 65: 780–785. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2000.tb13586.x. Nollet, L. M. L. & Toldra, F. 2009. Handbook of seafood and seafood products analysis. CRC Press. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 84 Nollet, L. M. L. & Toldra, F. 2010. Sensory analysis of foods of animal origin. CRC Press. Nortvedt, R., Torrissen, O. J. & Tuene, S. 1998. Application of near-infrared transmittance spec- troscopy in the determination of fat, protein and dry matter in Atlantic halibut fillet. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 42(1-2): 199–207. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/S0169-7439(98)00012-4. Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N. & Kanda, H. 2015. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology 53(1): 1–5. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s12275-015-4656-9. Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N. & Hase, T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 28(12): E63. Saatavissa: https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63. NovoCIP 2014. Fish Freshness K value Assay [verkkoaineisto]. [viitattu 20.5.2020]. Saatavissa: http://www.novocib.com/Fish_Freshness_K_Value_Assay.html. Novoslavskij, A., Terentjeva, M., Eizenberga, I., Valciņa, O., Bartkevičs, V. & Bērziņš, A. 2016. Major foodborne pathogens in fish and fish products: a review. Annals of Microbiology, 66: 1–15. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s13213-015-1102-5. OAOC Official Method 2017.09 2017. Analysis confirmation and identification of Salmonella species, Cronobacter species, Campylobacter species, and other gram-negative organ- isms [verkkoaineisto]. [viitattu 16.6.2020]. Saatavissa: http://www.eoma.aoac.org/met- hods/info.asp?ID=51624. OAOC Official Method 2017.10 2017. Confirmation and identification of Listeria monocyto- genes, Listeria species, and other gram-positive organisms [verkkoaineisto]. [viitattu 16.6.2020]. Saatavissa: http://www.eoma.aoac.org/methods/info.asp?ID=51641. Oehslenschlager, J. 2005. The intellectron fishtester VI-an almost forgotten powerful tool for freshness and spoilage determination of fish at the inspection level. Fifth World Fish Inspection and Quality Control Congress 116–122. Ryder, J. & Ababouch. L. (Eds.), FAO, Rome. Olafsdottir, G., Chanie, E., Westad, F., Rosa Jonsdottir, R., Thalmann, C. R., Bazzo, S., Labreche, S., Marcq, P., Lundby, F. & Haugen, J. E. 2005. Prediction of microbial and sensory quality of cold smoked Atlantic salmon (Salmo salar) by electronic nose. Journal of Food Sci- ence 70(9): 563–574. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2005.tb08330.x. Ottavian, M., Facco, P., Fasolato, L., Novelli, E., Mirisola, M., Perini, M. & Barolo, M. 2012. Use of near-infrared spectroscopy for fast fraud detection in seafood: Application to the au- thentication of wild European Sea Bass (Dicentrarchus labrax). Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(2): 639–648. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf203385e. Pall Corporation 2014. GeneDisc® Technologies - For an easy, rapid and reliable identification of Listeria species [verkkoaineisto]. [viitattu 17.6.2020]. Saatavissa: https://www.pall.co.uk/content/dam/pall/food-beverage/literature-library/non-ga- ted/FBDSGDLSPPEN.pdf. Parlapani, F. F., Meziti, A., Kormas, K. Ar. & Boziaris, I. S. 2013. Indigenous and spoilage micro- biota of farmed sea bream stored in ice identified by phenotypic and 16S rRNA gene Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 85 analysis. Food Microbiology 33(1): 85–89. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fm.2012.09.001. Patel, K. K., Kar, A., Jha, S. N. & Khan, M. A. 2012. Machine vision system: A tool for quality inspection of food and agricultural products. Journal of Food Science and Technology 49(2): 123–141. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s13197-011-0321-4. Pérez-Esteve, E., Fuentes, A., Grau, R., Fernández-Segovia, I., Masot, R., Alcañiz, M. & Barat, J. M. 2014. Use of impedance spectroscopy for predicting freshness of sea bream (Sparus aurata). Food Control 35(1) 360–365. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.food- cont.2013.07.025. Peruzy, M. F., Murru, N., Yu, Z., Kerkhof, P.-J., Neola, B., Joossens, M., Proroga, Y. T. R. & Houf, K. 2019. Assessment of microbial communities on freshly killed wild boar meat by MALDI-TOF MS and 16S rRNA amplicon sequencing. International Journal of Food Mi- crobiology 301: 51–60. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2019.05.005. Pietikäinen, M. & Silvén, O. 2019. Tekoälyn haasteet – koneoppimisesta ja konenäöstä tunne- tekoälyyn. Konenäön ja signaalianalyysin keskus, Oulu. Saatavissa: http://jul- tika.oulu.fi/Record/isbn978-952-62-2482-4. Piñeiro, C., Barros-Velázquez, J., Sotelo, C. G., Pérez-Martín, R. & Gallardo, J. M. 1998. Two- dimensional electrophoretic study of the water-soluble protein fraction in white muscle of gadoid fish species. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46(10): 3991–3997. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf9800965. Postollec, F., Falentin, H., Pavan, S., Combrisson, J. & Sohier, D. 2011. Recent advances in quan- titative PCR (qPCR) applications in food microbiology. Food Microbiology 28(5): 848– 861. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fm.2011.02.008. Prabhakar, P. K., Vatsa, S., Srivastav, P. P. & Pathak, S. S. 2020. A comprehensive review on freshness of fish and assessment: Analytical methods and recent innovations. Food Re- search International 133: 109157. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.food- res.2020.109157. QIM Eurofish 2020. [verkkoaineisto]. [viitattu 22.6.2020]. Saatavissa: https://www.qim-euro- fish.com/default.asp?ZNT=S0T1O265. Qin, J., Cui, Y., Zhao, X., Rohde, H., Liang, T., Wolters, M., Li, D., Belmar Campos, C., Christner, M., Song, Y. & Yang, R. 2011. Identification of the Shiga toxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain responsible for a food poisoning outbreak in Germany by PCR. Journal of Clinical Microbiology 49(9): 3439–3440. Saatavissa: https://doi.org/10.1128/JCM.01312-11. QS-SOLUTION 2020. Freshness Checker [verkkoaineisto]. [viitattu: 20.5.2020]. Saatavissa: https://www.qs-solution.jp/english/freshness_checker.html. Quevedo, R. A., Aguilera, J. M. & Pedreschi, F. 2010. Color of salmon fillets by computer vision and sensory panel. Food and Bioprocess Technology 3(5): 637–643. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s11947-008-0106-6. Quijada, N. M., Hernández, M. & Rodríguez-Lázaro, D. 2020. High-throughput sequencing and food microbiology. Advances in Food and Nutrition Research 91: 275–300. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/bs.afnr.2019.10.003. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 86 Rantsiou, K., Kathariou, S., Winkler, A., Skandamis, P., Saint-Cyr, M. J., Rouzeau-Szynalski, K. & Amézquita, A. 2018. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology 287: 3–9. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2017.11.007. Rasmussen, J. B., Krimmer, A. N., Paul, A. J. & Hontela, A. 2012. Empirical relationships between body tissue composition and bioelectrical impedance of brook trout Salvelinus fontin- alis from a Rocky Mountain stream. Journal of Fish Biology 80(6): 2317–2327. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2012.03295.x. Rawdkuen, S., Jongjareonrak, A., Phatcharat, S. & Benjakul, S. 2010. Assessment of protein changes in farmed giant catfish (Pangasianodon gigas) muscles during refrigerated storage. International Journal of Food Science & Technology 45: 985–994. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2010.02217.x. Rehbein H. & Oehlenschläger, J. (Eds.) 2009. Fishery products: quality, safety and authenticity. Wiley-Blackwell Pub. Saatavissa: https://doi.org/10.1002/9781444322668. Rincón, L., Castro, P. L., Álvarez, B., Hernández, M. D., Álvarez, A., Claret, A., Guerrero, L. & Ginés, R. 2016. Differences in proximal and fatty acid profiles, sensory characteristics, texture, colour and muscle cellularity between wild and farmed blackspot seabream (Pagellus bogaraveo). Aquaculture 451: 195–204. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.aquacul- ture.2015.09.016. Ritvanen, T.-K. 2001. Kotimaisten kalalajien tuoreuden määritys eri menetelmillä. Pro gradu - tutkielma, Turun yliopisto. Rizo, A., Fuentes, A., Fernández-Segovia, I., Masot, R., Alcañiz, M. & Barat, J. M. 2013. Develop- ment of a new salmon salting–smoking method and process monitoring by impedance spectroscopy. LWT – Food Science & Technology 51(1): 218–224. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2012.09.025. Rodríguez-Méndez, M. L., Gay, M., Apetrei, C. & Saja, J. A. 2009. Biogenic amines and fish fresh- ness assessment using a multisensor system based on voltammetric electrodes. Com- parison between CPE and screen-printed electrodes. Electrochimica Acta 54(27): 7033– 7041. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.electacta.2009.07.024. Roh, S. W., Kim, K.-H., Nam, Y.-D., Chang, H.-W., Park, E.-J. & Bae, J.-W. 2010. Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing. The ISME Journal 4(1): 1–16. Saatavissa: https://doi.org/10.1038/ismej.2009.83. Rossel, R. V., Walvoort, D. J. J., McBratney, A. B., Janik, L. J. & Skjemstad, J. O. 2006. Visible, near infrared, mid infrared or combined diffuse reflectance spectroscopy for simultaneous assessment of various soil properties. Geoderma 131(1–2): 59–75. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.geoderma.2005.03.007. Rudi, K., Maugesten, T., Hannevik, S. E. & Nissen, H. 2004. Explorative multivariate analyses of 16S rRNA gene data from microbial communities in modified-atmosphere-packed salmon and coalfish. Applied and Environmental Microbiology 70(8): 5010–5018. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1128/AEM.70.8.5010-5018.2004. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 87 Ruiz-Rico, M., Fuentes, A., Masot, R., Alcañiz, M., Fernández-Segovia, I. & Barat Baviera, J. M. 2013. Use of the voltammetric tongue in fresh cod (Gadus morhua) quality assessment. Innovative Food Science & Emerging Technologies 18: 256–263. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.ifset.2012.12.010. Ruokavirasto 2018. Puhdistuksen riittävyyden arviointi [verkkoaineisto]. [viitattu 9.6.2020]. Saa- tavissa: https://www.ruokavirasto.fi/yritykset/elintarvikeala/elintarvikealan-yhteiset- vaatimukset/elintarvikehygienia/puhtaanapito/puhdistuksen-riittavyyden-arviointi/. Ruokavirasto 2019a. Clostridium botulinum ja botulismin ehkäisy [verkkoaineisto]. Saatavissa: https://www.ruokavirasto.fi/henkiloasiakkaat/tietoa-elintarvikkeista/elintarvikkeiden- turvallisen-kayton-ohjeet/ruokamyrkytykset/ruokamyrkytyksia-aiheuttavia-baktee- reja/clostridium-botulinum/. Ruokavirasto 2019b. Botulismi [verkkoaineisto]. Saatavissa: https://www.ruokavirasto.fi/tee- mat/zoonoosikeskus/zoonoosit/bakteerien-aiheuttamat-taudit/botulismi/. Ruokaviraston ohje 10501/2. Elintarvikkeiden mikrobiologiset vaatimukset, komission asetuk- sen (EY) No 2073/2005 soveltaminen sekä yleisiä ohjeita mikrobiologisista tutkimuk- sista. Ohje elintarvikealan toimijoille. Saatavissa: https://www.ruokavirasto.fi/globalas- sets/tietoa-meista/asiointi/oppaat-ja-lomakkeet/yritykset/elintarvikeala/elintarvike- alan-oppaat/eviran_ohje_10501_2_mikrobiologiset_vaatimukset_toimijoille.pdf Ruokaviraston ohje 4095/04.02.00.01/2020/3. Elintarvikkeiden mikrobiologiset vaatimukset ko- mission asetuksen (EY) No 2073/2005 soveltaminen sekä yleisiä ohjeita elintarvikkeiden mikrobiologisista tutkimuksista. Ohje elintarvikealan toimijoille. Saatavissa: https://www.ruokavirasto.fi/globalassets/tietoa-meista/asiointi/oppaat-ja-lomak- keet/yritykset/elintarvikeala/elintarvikealan-oppaat/elintarvikkeiden-mikrobiologiset- vaatimukset_ohjeita-toimijoille.pdf. Ruoppa, M. 1982. Vesihallinnossa käytettävät kalojen kliinis-kemialliset ja histologiset määri- tysmenetelmät. Vesihallituksen monistesarja, 98 s. Ryder, J.M. 1985. Determination of adenosine triphosphate and its breakdown products in fish muscle by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 33: 678–680. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf00064a027. SalmonBusiness 2018. [verkkoaineisto]. [viitattu 17.6.2020]. Saatavissa: https://salmonbusi- ness.com/this-small-futuristic-fish-scanning-device-is-going-to-fight-the-billion-dol- lar-seafood-fraud-industry/. Sanchez-Alonso, I., Carmona, P. & Careche, M. 2012. Vibrational spectroscopic analysis of hake (Merluccius merluccius L.) lipids during frozen storage. Food Chemistry 132(1): 160–167. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.10.047. Sant’Ana, L. S., Soares, S. & Vaz-Pires, P. 2011. Development of a quality index method (QIM) sensory scheme and study of shelf-life of ice-stored blackspot seabream (Pagellus bo- garaveo). LWT - Food Science and Technology 44(10): 2253–2259. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2011.07.004. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 88 Sciencenorway 2019. Using light to ascertain the quality of fish has the potential to revolution- ize the fishing industry [verkkoaineisto]. [viitattu 17.6.2020]. Saatavissa: https://part- ner.sciencenorway.no/fish-fisheries-nofima/using-light-to-ascertain-the-quality-of- fish-has-the-potential-to-revolutionize-the-fishing-industry/1594685. Segtnan, V. H., Høy, M., Lundby, F., Narum, B. & Wold, J. P. 2009a. Fat distribution analysis in salmon using non-contact near infrared interactance imaging: A sampling and calibra- tion strategy. Journal of Near Infrared Spectroscopy 17(1): 247–253. Saatavissa: https://doi.org/10.1255/jnirs.851. Segtnan, V. H., Høy, M., Sorheim, O., Kohler, A., Lundby, F., Wold, J. P. & Ofstad, R. 2009b. Noncontact salt and fat distributional analysis in salted and smoked salmon fillets using x-ray computed tomography and NIR interactance imaging. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57(5): 1705–1710. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf802080s. Sivertsen, A. H., Heia, K., Stormo, S. K., Elvevoll, E. & Nilsen, H. 2011. Automatic nematode de- tection in cod fillets (Gadus morhua) by transillumination hyperspectral imaging. Journal of Food Science 76(1): 77–83. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750- 3841.2010.01928.x. Sone, I., Olsen, R. L., Sivertsen, A. H., Eilertsen, G. & Heia, K. 2012. Classification of fresh Atlantic salmon (Salmo salar L.) fillets stored under different atmospheres by hyperspectral im- aging. Journal of Food Engineering 109(3): 482–489. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2011.11.001. Soriano-Disla, J. M., Janik, L. J., Viscarra Rossel, R. A., Macdonald, L. M. & McLaughlin, M. J. 2014. The performance of visible, near-, and mid-infrared reflectance spectroscopy for pre- diction of soil physical, chemical, and biological properties. Applied Spectroscopy Re- views 49(2): 139–186. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/05704928.2013.811081. Stien, L. H., Kiessling, A. & Manne, F. 2007. Rapid estimation of fat content in salmon fillets by colour image analysis. Journal of Food Composition and Analysis 20(2): 73–79. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2006.07.007. Stien, L. H., Manne, F., Ruohonene, K., Kause, A., Rungruangsak-Torrissen, K. & Kiessling, A. 2006a. Automated image analysis as a tool to quantify the colour and composition of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss W.) cutlets. Aquaculture 261: 695–705. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2006.08.009. Stien, L. H., Suontama, J. & Kiessling, A. 2006b. Image analysis as a tool to quantify rigor con- traction in pre-rigor-filleted fillets. Computers and Electronics in Aquaculture 50(2): 109– 120. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.compag.2005.08.012. Storbeck, F. & Daan, B. 2001. Fish species recognition using computer vision and a neural net- work. Fisheries Research 51(1): 11−15. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/S0165- 7836(00)00254-X. Sun, J., Zhang, R., Zhang, Y., Liang, Q., Li, G., Yang, N., Xu, P. & Guo, J. 2018. Classifying fish freshness according to the relationship between EIS parameters and spoilage stages. Journal of Food Engineering 219: 101–110. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2017.09.011. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 89 Sun, J., Zhang, R., Zhang, Y., Li, G. & Liang, Q. 2017. Estimating freshness of carp based on EIS morphological characteristic. Journal of Food Engineering 193: 58–67. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2016.08.007. Suomela, J.-P., Lundén, S., Kaimainen, M., Mattila, S., Kallio, H. & Airaksinen, S. 2016. Effects of origin and season on the lipids and sensory quality of European whitefish (Coregonus lavaretus). Food Chemistry 197: 1031–1037. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.food- chem.2015.11.114. Sveinsdóttir, K., Martinsdóttir, E., Green-Petersen, D., Hyldig, G., Schelvis, R. & Delahunty, C. 2009. Sensory characteristics of different cod products related to consumer preferences and attitudes. Food Quality and Preference 20(2): 120–132. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodqual.2008.09.002. Svellingen, C., Totland, B., White, D. & Øvredal, J. T. 2006. Automatic species recognition, length measurement and weight determination, using the CatchMeter computer vision system. International council for exploration of the sea, 3. Saatavissa: https://imr.brage.unit.no/imr-xmlui/bitstream/handle/11250/100899/N0306.pdf?se- quence=1. Tao, Z.-H. & Sato, M. 2013. Determination of K value for fish freshness by filter paper electro- phoresis. Modern Food Science and Technology 29(10): 2509–2511+2553. TellSpec 2020. Test in real-time for the nutritional value, moisture and freshness of white fish without destroying the fish [verkkoaineisto]. [viitattu 17.6.2020]. Saatavissa: https://tells- pec.com/eit-food/fishproject/. Thomas, S., Kuska, M. T., Bohnenkamp, D., Brugger, A., Elias Alisaac, E., Wahabzada, M., Beh- mann, J. & Mahlein, A.-K. 2018. Benefits of hyperspectral imaging for plant disease de- tection and plant protection: a technical perspective. Journal of Plant Diseases and Pro- tection 125(5): 5–20. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s41348-017-0124-6. Triqui, R. & Bouchriti, N. 2003. Freshness assessments of Moroccan sardine (Sardina pilchardus): Comparison of overall sensory changes to instrumentally determined volatiles. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(26): 7540–7546. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf0348. Uddin, M. & Okazaki, E. 2004. Classification of fresh and frozen-thawed fish by near infrared spectroscopy. Journal of Food Science 69(8): C665–C668. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2004.tb18015.x. Undeland, I., Hall, G. & Lingnert, H. 1999. Lipid oxidation in fillets of herring (Clupea harengus) during ice storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47: 524–532. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/jf9807871. Valderrama, W. B., Dudley, E. G. Doores, S. & Cutter, C.N. 2016. Commercially available rapid methods for detection of selected food-borne pathogens. Critical reviews in Food Sci- ence and Nutrition 56(9): 1519-1531. Saatavissa: https://doi.org/10.1080/10408398.2013.775567. Vallin, I. 2016. Gluteenittomien tattarinappien rakenteen analysointi. Rakenne-, kuiva-aine- ja aw-mittaus. Opinnäytetyö, Seinäjoen ammattikorkeakoulu. 55 s. Saatavissa: http://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605137619. Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 90 Vaz-Velho, M., Duarte, G. & Gibbs, P. 2000. Evaluation of mini-VIDAS rapid test for detection of Listeria monocytogenes from production lines off fresh to cold-smoked fish. Journal of Microbiological Methods, 40(2): 147–151. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/S0167- 7012(00)00118-4. Velioglu, H. M., Temiz, H. T. & Boyaci, I. H. 2015. Differentiation of fresh and frozen-thawed fish samples using Raman spectroscopy coupled with chemometric analysis. Food Chemistry 172: 283–290. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.09.073. Vogel, B. F., Venkateswaran, K., Satomi, M. & Gram, L. 2005. Identification of Shewanella baltica as the most important H2S-producing species during iced storage of Danish marine fish. Applied and Environmental Microbiology 71(11): 6689–6697. Saatavissa: https://doi.org/10.1128/AEM.71.11.6689-6697.2005. Välimaa, A.-L., Tilsala-Timisjärvi, A. & Virtanen, E. 2015. Rapid detection and identification methods for Listeria monocytogenes in the food chain – A review. Food Control 55: 103- 114. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2015.02.037. Wagner, C. D., Clever, H. L. & Peters, E. D. 1947. Evaluation of ferrous thiocyanate colorimetric method. Analytical Chemistry 19: 980–982. Saatavissa: https://doi.org/10.1021/ac60012a011. White, D. J., Svellingen, C. & Strachan, N. J. C. 2006. Automated measurement of species and length of fish by computer vision. Fisheries Research 80(2–3): 203–210. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fishres.2006.04.009. Whitman, W. B., Coleman, D. C. & Wiebe, W. J. 1998. Prokaryotes: The unseen majority. Pro- ceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(12): 6578–6583. Saatavissa: https://doi.org/10.1073/pnas.95.12.6578. Willis, J. & Hobday, A. 2008. Application of bioelectrical impedance analysis as a method for estimating composition and metabolic condition of outhern blue tuna (Thunnus mac- coyii) during conventional tagging. Fisheries Research 93(1–2): 64–71. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.fishres.2008.02.010. Wong, Y.-P. Othman, S., Lau, Y.-L., Radu, S. & Chee, H.-Y. 2017. Loop-mediated isothermal am- plification (LAMP): a versatile technique for detection of micro-organisms. Journal of Applied Microbiology 124(3): 626–643. Saatavissa: https://doi.org/10.1111/jam.13647. Xu, J.-L., Riccioli, C. & Sun, D.-W. 2015. An overview on nondestructive spectroscopic techniques for lipid and lipid oxidation analysis in fish and fish products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 14(4). Saatavissa: https://doi.org/10.1111/1541- 4337.12138. Yeni, F., Acar, S., Polat, Ö.G., Soyer, Y. & Alpas, H. 2014. Rapid and standardized methods for detection of foodborne pathogens and mycotoxins on fresh produce. Food Control 40: 359–367. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2013.12.020. Yoshioka, T., Konno, Y. & Konno, K. 2019. Below-zero storage of fish to suppress loss of fresh- ness. Fisheries Science 85: 601–609. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s12562-019- 01294-3. Yuan, P., Wang, Y., Miyazaki, R., Liang, J., Hirasaka, K., Tachibana, K. & Taniyama, S. 2018. A convenient and nondestructive method using bioimpedance analysis to determine fish Luonnonvara- ja biotalouden tutkimus 58/2021 91 freshness during ice storage. Fisheries Science 84: 1099–1108. Saatavissa: https://doi.org/10.1007/s12562-018-1256-8. Zaragoza, P., Ribes, S., Fuentes, A., Vivancos, J.-L., Fernandez-Segovia, I., Ros-Lis, J., Barat, J. & Martínez-Máñez, R. 2012. Fish freshness decay measurement with a colorimetric array. Procedia Engineering 47: 1362–1365. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.pro- eng.2012.09.409 Zavadlav, S., Janči, T., Lacković, I., Karlović, S., Rogulj, I. & Vidaček, S. 2016. Assessment of stor- age shelf life of European squid (cephalopod: Loliginidae, Loligo vulgaris) by bioelectri- cal impedance measurements. Journal of Food Engineering 184: 44–52. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2016.03.022. Zhao, X., Zhuang, H., Yoon, S.-C-, Dong, Y., Wang, W. & Zhao, W. 2017. Electrical impedance spectroscopy for quality assessment of meat and fish: A review on basic principles, measurement methods, and recent advances. Journal of Food Quality 2: 1–16. Saa- tavissa: https://doi.org/10.1155/2017/6370739Zhao ym. 2017. Zhuang, S., Li, Y., Hong, H., Liu, Y., Shu, R. & Luo, Y. 2020. Effects of ethyl lauroyl arginate hy- drochloride on microbiota, quality and biochemical changes of container-cultured largemouth bass (Micropterus salmonides) fillets during storage at 4 °C. Food Chemis- try, 324: 126886. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.126. Zion, B., Alchanatis, V., Ostrovsky, V., Barki, A. & Karplus, I. 2007. Real-time underwater edible fish species sorting. Computers and Electronics in Agriculture, 56(1): 34–45. Saatavissa: https://doi.org/10.1016/j.compag.2006.12.00 Luonnonvarakeskus Latokartanonkaari 9 00790 Helsinki puh. 029 532 6000